Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Summary

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Abstract

Para atualizar a cultura celular 2D tradicional para cultura de células 3D, integramos microfabrication com tecnologia cryogelation para produzir se microescala cryogels (microcryogels), que pode ser carregado com uma variedade de tipos de células para formar o microtissues 3D. Aqui, apresentamos o protocolo para fabricar microtissues 3D versátil e suas aplicações em terapia regenerativa e de despistagem de drogas. Tamanho e forma-controláveis microcryogels podem ser fabricados em um chip de matriz, que pode ser colhido fora do chip como transportadoras carregados de células individuais para terapia regenerativa injetável ou ainda ser montados em-microplaqueta em 3D microtissue matrizes para alta produtividade triagem de drogas. Devido à natureza elástica elevada destes cryogels de microescala, os microtissues 3D exibem grande Injectabilidade para terapia celular minimamente invasiva, protegendo as células de força de cisalhamento mecânico durante a injeção. Isso garante a sobrevivência celular melhorada e efeito terapêutico no modelo de isquemia do membro do rato. Enquanto isso, montagem de matrizes de microtissue 3D em um formato padrão de 384-multi-bem facilita o uso do comum instalações laboratoriais e equipamentos, permitindo que sobre esta plataforma de cultura de células 3D versátil de despistagem de drogas de alto rendimento.

Introduction

Cultura celular tradicional superfícies achatadas bidimensional (2D), como um prato de cultura ou placas multi bem, dificilmente pode eliciar comportamentos de celular perto de seus Estados nativos. Recapitulação exata do microambiente celular nativo, que são compostos por vários tipos de células, matrizes extracelulares e bioativos fatores solúveis em tridimensional (3D) arquiteturas^{1,2,3 ,4}, é essencial para construir biomimicking tecidos em vitro para aplicações na medicina regenerativa, engenharia de tecidos, biologia fundamental pesquisa e droga descoberta^{5,6,7 ,8,9}.

Em vez de cultura de células 2D, cultura de células 3D é amplamente utilizada para avançar biomimetic microarquitetura e características funcionais das células cultivadas em vitro. É um método de cultura de células 3D popular células agregadas em esferoides^7,8,9,10. Esferoides celulares podem ser injetados para tecidos feridos com maior retenção de celular e sobrevivência em comparação com a injeção de células dispersas. No entanto, não-uniforme esferoide tamanhos e inevitável lesão mecânica imposta sobre as células pela força de cisalhamento do fluido durante a injeção levam a pobre célula efeitos terapêuticos^11,12,13. Da mesma forma, a não-uniformidade inerente durante a agregação de esferoides fez sua tradução para 3D baseada em célula elevado-throughput de despistagem de drogas desafiador¹⁰.

Outro método para cultura de células 3D é alcançado com a ajuda de biomateriais, que encapsula normalmente células em hidrogel aquosa ou andaimes porosas. Permite maior flexibilidade na construção de arquiteturas 3D. Para a terapia, células encapsuladas em andaimes em massa geralmente são entregues ao corpo animal através da implantação cirúrgica, que é invasivo e traumático, portanto, restringindo sua tradução ampla para o leito. Por outro lado, aquosa hidrogel permitem terapia minimamente invasiva através da injeção de células suspendidas em solução de precursor de hidrogel em corpos de animais, permitindo em situ gelificação através do thermo-, reticulação química ou enzimática¹¹. No entanto, como as células são entregues enquanto os precursores de hidrogel ainda estão em um estado aquoso, eles estão também expostos a cisalhamento mecânico durante a injeção. Não só isso, reticulação química ou enzimática durante em situ gelificação de hidrogel também pode impor danos às células dentro. Para triagem de drogas, culturas de células de biomaterial assistida enfrentam problemas com taxa de transferência, controlabilidade e uniformidade. Usando o hidrogel, células são normalmente envolvidos durante a gelificação, pelo qual o processo pode afetar a função e viabilidade celular. Gelificação durante a semeadura da célula também dificulta o uso pela maioria dos equipamentos de alto rendimento, desde que o hidrogel pode precisar de ser mantido no gelo para evitar gelificação antes célula semeadura, e o hidrogel pode jam aplicadora dicas, que são geralmente muito finas, para garantir a precisão para seleção da elevado-produção. Pré-formado andaimes potencialmente poderiam separar os procedimentos de fabricação do biomaterial de cultura de células, porém a maioria produtos baseados em andaime estão disponíveis como produtos a granel com relativamente baixa taxa de transferência¹⁴.

Para superar algumas das deficiências dos métodos de cultura 3D atual, nós desenvolvemos uma tecnologia integrada microfabrication-cryogelation para fabricar uma prateleira e user-friendly microcryogel matriz microplaqueta¹⁵. Neste protocolo, a gelatina é selecionada para exemplificar a técnica de fabricação de microcryogel como é biocompatível, biodegradável, cost-effective, e nenhuma modificação adicional é necessária para a fixação da célula. Outros polímeros de fontes naturais ou sintéticas também podem ser usados para a fabricação, dependendo da aplicação. Através desta tecnologia, nós podemos fabricar microcryogels miniaturizados e altamente elástica com tamanho controlável, forma e layout. Quando carregado com uma variedade de tipos de células, microtissues 3D poderia ser formado para várias aplicações. Estas características únicas permitem Injectabilidade desejada, protecção celular e retenção local-dirigido após injeção na vivo para efeitos terapêuticos reforçadas. Não só isso, o microcryogels poderia ser tratados posteriormente para formar matrizes de microtissue 3D que são compatíveis com equipamentos comuns de laboratório e instrumentos para realizar a cultura de células de alto rendimento para triagem de drogas versátil e outros ensaios celulares. Neste documento, serão detalhamos o processo de fabricação de microcryogels e seu tratamento pós como individuais microtissues 3D ou 3D microtissue matrizes para duas importantes aplicações, terapia celular e despistagem de drogas, respectivamente^10,15 .

Protocol

as experiências com animais seguiram rigoroso protocolo aprovado pelo Comitê de ética Animal no centro de análise biomédica, Universidade de Tsinghua. Sob aprovação do Comitê de ética, o tecido adiposo humano foi obtido do departamento de cirurgia plástica de Peking Union Hospital com consentimento informado dos pacientes.

1. fabricação de 3D Microcryogels

1. Design e fabricação de chips de matriz microstencil
   1. uso um software comercial para matrizes de desenho das geometrias específicas, tais como círculos, elipses, triângulos ou trevos ¹⁴, dependendo do aplicativo subsequente.
      Nota: Consulte a secção 2 do protocolo para a medicina regenerativa e secção 3 do protocolo para a seleção de drogas para detalhes do projeto.
   2. Importar o desenho para o software que acompanha a máquina de gravura do laser de gravura do laser. Usando as configurações do laser de acordo com as recomendações de fábrica para a máquina de gravura do laser, laser-grava o desenho importado para poli (methymethacrylate) (PMMA) folhas.
   3. Lavar as fichas de matriz microstencil com água desionizada para limpar os restos de gravura do laser. Seca a matriz microstencil fichas em 60 ° C. loja em um saco fechado à temperatura ambiente para meses.
2. Fabricação de chips de matriz microcryogel
   1. microstencil coloque 4 fichas sobre o tabuleiro de amostra de matriz e inserir o plasma líquido de limpeza. Feche a porta da lavadora e ligue a bomba de vácuo por 2 min e, em seguida, ligue a potência máxima de RF (18 W) para tratar as fichas de matriz microstencil no plasma líquido de limpeza para 3 min à temperatura ambiente para aumentar a Hidrofilia.
   2. Adicionar gelatina de 0,06 g de 1 mL de água desionizada para formar solução 6% (wt/vol) gelatina precursor (o suficiente para fazer 5 fichas). Quente a 60 ° C em banho-maria para dissolver adequadamente. Incubar no gelo por 5 min.
   3. Adicionar 3 µ l de solução gelatina precursor para uma concentração final de 0,3% de glutaraldeído. Homogeneiza.
   4. Solução de precursor Pipetar 200 µ l com glutaraldeído para a superfície superior do chip matriz microstencil.
      Nota: 200 µ l é suficiente para um chip de 75 mm × 25 mm independentemente do projeto. Aumentar a quantidade proporcionalmente quando a área de superfície do chip é aumentada.
   5. Manualmente distribuir a solução uniformemente sobre o chip por raspagem de volta e adiante com uma vareta de vidro curvada 2 a 3 vezes.
      Nota: Cada micropoço no chip microstencil pode ser preenchido com solução de precursor, devido à sua natureza hidrofílica após tratamento plasma.
   6. Imediatamente, coloque o chip de matriz precursor-solução-preenchido em um congelador-20 ° C durante 16 h para cryogelation.
   7. Ajustar o liofilizador de-40 ° C durante 30 min. Coloque os chips de matriz após cryogelation no Liofilizador e lyophilize as fichas de matriz para 2h no vácuo.
      Nota: Microcryogels de gelatina com macroporos interligados formam-se porque o gelo formado durante cryogelation sublimes no liofilizador.
   8. Proceder à seção 2 para tratamento de isquemia crítica de membro (CLI) e seção 3 para triagem de drogas de alto rendimento.

2. Colheita de Microcryogels individuais de forma injetável 3D Microtissues para tratamento de CLI

1. microcryogels individual de colheita
   1. Design matrizes (75 mm × 25 mm) de 600 círculos, cada um com 400 µm de diâmetro, em software comercial para construção de microtissue 3D injetável. Usar o PMMA de 300 µm de espessura para fabricação do chip de matriz microstencil, conforme detalhado na secção 1.1.
   2. Fabricar chips de matriz microcryogel como no ponto 1.2.
   3. Fabricar uma matriz de pinos do ejetor de PDMS com o mesmo design como no passo 2.1.1 por litografia macia padrão ^{16 , 17}.
   4. Sobrepor o chip de matriz microcryogel em cima a matriz de pinos do ejetor de PDMS, alinhando cada microcryogel com um pino ejetor no array. Pressione o chip de matriz microcryogel em direção a matriz de pino ejetor para empurrar o microcryogels fora aos micropoços com os pinos salientes na matriz de pino ejetor PDMS a colheita individual microcryogels.
   5. Colher de microcryogel em água e coletá-los com o auxílio de filtros de célula. Usar um filtro para recolher microcryogels de um único chip (ou seja, 600 microcryogels).
   6. Microcryogels de lavagem com 0,1 M NaBH ₄ no gelo por 20 min saciar qualquer resíduo de aldeído uncross vinculado. Use 5 mL de 0.1 M NaBH ₄ pela microplaqueta. Descartar NaBH ₄ e lavar com 5 mL de água desionizada durante 3 a 5 vezes, 15 minutos cada vez.
   7. Descartar a água do filtro célula e se microcryogels em um cluster por filtro de célula, coloque um cluster em um prato de Petri 35mm usando uma pinça curvada. Adicione 50-70 µ l de água deionizada para cada cluster de água e cobrir a tampa da caixa de Petri. Bata levemente a placa de Petri sobre a mesa para igualar todos os microcryogels, para que não microcryogels estão deitando em cima de outra microcryogel para formar uma monocamada de microcryogels na superfície da caixa de Petri.
   8. Congelar a microcryogels colhidos em-20 ° C por 4 a 16 h antes de liofilização-los por 2 h (consulte a etapa 1.2.7). Loja microcryogels em um vácuo à temperatura ambiente até ulterior utilização.
2. Caracterização de microcryogels
   1. avaliar os poros do microcryogels por digitalização de imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
      1. Imobilizar o microcryogels colhidos e liofilizada em um porta-amostras por fita adesiva de dupla-lado e casaco com ouro com um sputter coater para 90 s, antes de imagem por SEM ¹¹. Avaliar e analisar a distribuição dos diâmetros dos poros no microcryogel de sete diferentes imagens SEM usando software de análise de imagem.
   2. Pesa a um cluster de 600 microcryogels liofilizados em um prato de Petri-35mm para o peso da gelatina secas microcryogels (GMs). Adicione 60 µ l de água deionizada água para o cluster de microcryogels liofilizado e esperar por 30 s para microcryogels inteiramente absorver água e inchar. Pese o microcryogels inchado.
      1. Determinar o equilíbrio relação inchaço e porosidade de microcryogels, como a relação do peso de inchadas microcryogels de microcryogels de gelatina secas e a relação do peso da água realizada em microcryogels ao de microcryogels hidratado, respectivamente ¹³.
   3. Injectabilidade medida de microcryogels usando uma bomba de seringa programável integrada com uma força digital calibre ¹⁴.
      1. Mancha 600 peças de microcryogels por Trypan azul e suspender em 600 µ l 15% gelatina solução para obter distribuição homogênea. Suspensão de microcryogel 1 mL na seringa de 1 mL de carga. Injetar a mistura através de uma agulha de calibre 27 anexada para a seringa de 1 mL, utilizando uma bomba de seringa programável em taxa de fluxo de 1 mL/min.
      2. Injeção de monitor em tempo real força pela força digital medidor de teste e traçar a curva de força-tempo. Após a injeção, observar a integridade do microcryogels sob um microscópio.
         Nota: GMs suspendidos em 15% (wt/vol) solução de gelatina podem ser suavemente injetados e manteve-se intacta após a injeção.
   4. Caracterizam a degradabilidade de microcryogels.
      1. Primeiro, medir o peso de um cluster de 600 microcryogels liofilizados em um prato de Petri 35mm como peso seco. Em seguida, mergulhe 600 microcryogels liofilizados em 2 mL 0,025% (vol/vol) tripsina/EDTA.
      Microcryogels
      2. coleta da solução usando um coador de célula em pontos de tempo diferente (i.e., 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 min). Pavio fora solução em excesso com um lenço de papel. Medir o peso de microcryogels em pontos de tempo diferentes e calcular o grau de degradação, como a relação do peso de microcryogel em um certo ponto do tempo ao de microcryogel no tempo zero.
3. Autoloading de células em microcryogels a forma 3D microtissues
   1. microcryogels da etapa 2.1.8 por sistema de esterilização de óxido de etileno com exposição de gás de 12 h, seguida por 12 h desgaseificação sob vac de esterilizarUum.
   2. Escolha humanas adiposo-derivado do estroma células mesenquimais (hMSCs) para o tratamento de membro isquêmico posterior de rato. Células isoladas seguindo os procedimentos como anteriormente relataram ¹⁸.
   3. Cultura hMSCs no crescimento médio contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) ng/mL 10 fator de crescimento epidérmico (EGF), 10 ng/mL fator de crescimento derivado de plaquetas bb (PDGF-bb), 1 X selênio de transferrina de insulina (ITS), 10 ^-8 M dexametasona, 10 ^-4 M ácido ascórbico 2-fosfato, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL em DMEM/F12. Passagem das células para a relação de 1:3 Quando confluentes. Usar células de passagem de 3 a 5 nos experimentos seguintes.
   4. Colher hMSCs com tripsina e quantificar o número de células utilizando uma câmara de contagem de Fuchs-Rosenthal e ressuspender a uma densidade de 8 x 10 ⁶ células/mL em meio de crescimento hMSCs.
   5. Suspensão de hMSCs pipeta 60 µ l para a monocamada de 600 microcryogels com diâmetro de 400 µm em um prato de 35 mm da seção 2.1. As células são absorvidas automaticamente as microestruturas porosas do microcryogels.
   6. Manutenção em uma câmara umidificada e incubar a 37 ° C por 2 h permitir que as células anexar. Após 2 h de incubação, adicione 2 mL de meio de cultura. Altere o meio em 2 dias. Cultura microcryogels hMSCs-carregado por 2 dias formar o 3D microtissues.
   7. Depois de 2 dias de cultivo, Pipetar 100 microcryogels hMSCs-carregado por alvéolo em uma placa de 96 poços, adicione 120 µ l de solução de trabalho de resazurina preparada de acordo com o fabricante ' instrução s em cada poço. Incubar durante 2 h a 37 ° C.
      1. Detectar fluorescência de resazurina metabolizada pelas células viáveis em um leitor de microplacas com um comprimento de onda de luz da excitação de 560 nm e emissão de luz de comprimento de onda de 590 nm. Estabelecer uma curva padrão de número de celular vs fluorescência usando hMSCs para interpolar o número do celular da intensidade de fluorescência para futura experiência de acordo com o protocolo do kit ¹³.
   8. Avaliar o número de hMSCs em microcryogels do dia 0 ao dia 4 usando resazurina como descrito no passo 2.3.7 do dia 0 ao dia 4.
   9. Mancha células em microcryogels com diluição de 1: 500 de calceína AM e diluição de 1: 250 de iodeto de Propidium (conhecido como coloração viva/morta) na salina tamponada fosfato (PBS) e observar sob o microscópio de fluorescência ou microscópio de fluorescência confocal.
4. Injeção de microtissues 3D na vivo para tratamento da CLI no modelo do rato
   1. estabelecer isquemia crítica de membro posterior de camundongos BALB/c femininos como relatado ^{11 , 19} para determinar o efeito terapêutico da terapia 3D baseada em microtissue.
   2. Transferir o microtissues da etapa 2.3.6 usando uma pipeta de 5 mL em um coador de célula e filtrar fora do meio de cultura.
   3. Resuspenda o microtissues 3D hMSCs-carregado em solução de gelatina de 15%, com uma densidade de 100 microcryogels por solução de 100 µ l.
   4. Antes da cirurgia, esterilizar instrumentos cirúrgicos por autoclave e realizar uma cirurgia em uma sala de cirurgia de animais em uma central de facilidade de Animal.
   5. Posicione o mouse dentro da câmara de indução de anestesia contendo 1-3% de isoflurano em 100% de oxigênio em uma taxa de fluxo de 1 L/min. eritromicina aplicar sobre os olhos do rato para impedir a secagem. Através de uma incisão na pele de 1 cm de comprimento, ligate a artéria femoral e seus ramos com suturas de seda de 5-10 e impostos especiais de consumo ¹⁹.
   Injeção de
   6. Inject indocianina verde (ICG) (0,1 mL de 100 µ g/mL) na veia da cauda para monitorar o fluxo de sangue. Realizar imagens de fluorescência ICG usando uma sistema de imagens de fluorescência (aqui, sistema caseiro) na reflectância geometria ¹¹.
   7. Por via intramuscular, injetar microtissues em três locais do músculo grácil em volta da incisão de artéria utilizando uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 23.
   8. Após a cirurgia, aquecer o mouse com uma almofada aquecida na gaiola recuperação. Injectar por via subcutânea meloxicam para aliviar a dor e monitorar continuamente até acordado.
   9. Depois de 28 dias, monitorar a eficácia terapêutica do membro 3D microtissue-tratada por fluorescência de imagem ¹¹.
      Nota: Injectar por via subcutânea meloxicam para aliviar a dor quando o mouse mostrou amputação espontânea.
   10. Euthanize ratos com dióxido de carbono após a conclusão dos experimentos.
       Nota: Aqui, eutanásia com dióxido de carbono foi realizada de acordo com rigoroso protocolo aprovado pelo Comitê de ética Animal no centro de análise biomédica, Universidade de Tsinghua.

3. Montagem de Microtissue matriz Chip para triagem de drogas de alta produtividade

1. Assembleia da microcryogel matriz para cultura de células no chip
   1. Modificar o design na seção 1.1, de acordo com as dimensões da placa multi bem convencional, ou seja, para o formato de 384-multi-bem, desenha uma matriz de 16 × 24 poços (linha por coluna), cada um espaçamento de 2 mm de diâmetro e 4,5 mm centro--.
   2. Laser grava em uma folha de PMMA grossa 500 µm, conforme descrito na seção 1.1.
   3. Fabricação microcryogels, conforme descrito na seção 1.2 usando de que o chip de matriz 384-multi-assim obtido passo 3.1.2. Essa matriz contendo microcryogel é designado como o chip de matriz microcryogel.
   4. Lavar o chip de matriz microcryogel com 50 mL 0,1 M NaBH ₄ saciar qualquer aldeído residual uncross ligados, repetidamente Enxagúe com 50 mL de água desionizada para h 2 3 vezes, cada hora.
   5. Descartar a água, congelar o chip de matriz microcryogel a-20 ° C para 4 a 16 h antes de liofilização conforme item 1.2.7.
   6. Projeto de matriz de modificar o 384-multi-bem na etapa 3.1.1 para conter 16 × 24 poços, cada um espaçamento de 3 mm de diâmetro e 4,5 mm centro--.
   7. Remover um lado do apoio de uma folha de ultra-fino (10 µm) biocompatível-fita dupla face adesiva e colá-lo ao lado de um pedaço de folha de PMMA-3 milímetros de espessura. Laser grava o design da etapa 3.1.4 para esta folha PMMA de 3-mm de espessura de acordo com a seção 1.1. Esta matriz é designada como a matriz de reservatório.
   8. Alinhar a matriz microcryogel chip com o chip de matriz de reservatório e aderir juntos firmemente para montar o chip de matriz 3D microcryogel para cultura de células no chip. Esterilizar por radiação ultravioleta para 1 h.
   9. Matriz de armazenamento de microcryogel 3D chips no vácuo à temperatura ambiente para novas experiências.
2. Droga de triagem em matrizes 3D microtissue
   1. encher uma caixa molhada com 25 mL de água desionizada estéril para servir como uma câmara de umidade para cultura de células. Pré-aqueça em um 5% umidificado incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
   2. Colheita de células de câncer de pulmão não-pequenas células (NCI-H460) e células de carcinoma hepatocelular (HepG2) das placas de cultura de tecidos de acordo com o protocolo padrão e ressuspender em meios de cultura para uma densidade final de 1,0 x 10 ⁶ células/mL. Homogeneiza.
      Nota: RPM1640 com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL é utilizada para ICN-H460. Use DMEM com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL para HepG2.
   3. Remova a câmara de humidade da incubadora. Use uma pinça para cuidadosamente lugar 3D montada microcryogel matriz chip da etapa 3.1.9 na câmara de umidade. Tome cuidado para não molhar o microcryogels com água na câmara de.
   4. Misturar a suspensão de células completamente, então alíquota µ l 3 da suspensão de células diretamente sobre o microcryogel em cada poço.
      Nota: A ponta da pipeta deve tocar levemente a superfície da microcryogel antes de expulsar a suspensão de células. As células são carregados automaticamente para o microcryogel por absorção. Não semear células nas áreas periféricas.
   Adicionar 10 μL de mídia para cada poço, depois que as células são semeadas em microcryogel com pipeta multicanal, tais como um manipulador de líquido 96-canal de
   5. . Médio também é adicionado ao periféricos poços.
      Nota: Uso RPM1640 meios de comunicação social com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e 100 µ g/mL streptomycin de células H460. Use mídia DMEM com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL para as células de HepaG2.
   6. Cultura da matriz celular-carregado microcryogel chip na câmara de umidade por 24 h em um 5% umidificado incubadora de CO ₂ a 37 ° C, a matriz de forma 3D microtissue.
   7. Dissolver doxorrubicina e IMMLG-8439 ⁹ em dimetilsulfóxido (DMSO) para formar uma solução stock de 10 mM. Diluir a drogas com meio de cultura para formar um gradiente de concentração de 10 vezes a diluição de 2 nM a 200 µM.
   8. Adicionar 10 µ l de soluções da droga em cada poço. Use 0,1% DMSO (diluído em meio) como o controle. Incubar a matriz de microtissue 3D carregado de drogas em um 5% umidificado incubadora de CO ₂ a 37 ° C por 24 h.
   9. Adicionar 4 µ l de solução-mãe resazurina para cada poço. Incubar a 37 ° C por 2 h. lugar o 3D microtissue a matriz o leitor de microplacas e detectar fluorescência de resazurina metabolizada pelas células viáveis em um comprimento de onda de luz da excitação de 560 nm e emissão de luz de comprimento de onda de 590 nm.
   10. Subtrair o sinal de linha de base resazurina de todos os poços antes ainda mais o processamento de dados. Calcular a fração de viabilidade celular de cada poço dividindo seu sinal de fluorescência pelo sinal de fluorescência média dos poços controle.
   11. Traçar a curva de dose-resposta no software de plotagem com a fração de viabilidade celular como o eixo y e o logaritmo de base 10 da concentração de fármaco como o eixo x. Interpolar a concentração de inibição de 50% (IC50) na fração de 0,5 viabilidade celular.

Results

Fabricação e caracterização de microcryogels para a formação de microtissue 3D.

De acordo com este protocolo, microcryogels foram fabricados para o 3D de forma microtissues e microcryogels individuais ou matrizes de microcryogel e foram aplicados à terapia regenerativa e de despistagem, respectivamente de drogas (Figura 1). Fichas de matriz Microstencil fabricadas a partir de PMMA f...

Discussion

Regenerativos modelos medicina e in vitro de despistagem de drogas são dois importantes aplicações para tecido engenharia^5,6,7,8,9. Enquanto esses dois aplicativos têm necessidades muito diferentes, um terreno comum entre eles encontra-se na necessidade de um mais biomimetic condição de cultivo para aumentar celular funções¹⁹. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatina	sigma	G7041	Todos os outros reagentes foram comprados da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), salvo indicação em contrário.
Glutaraldeído	J& K	902042	Usado como reticulador na preparação do material.
Lamínula de vidro (24 x 50 mm)	CITOGLASS, China	10212450C	Para raspar a solução do prcursor em microstencils
Sódio  borohidreto, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	Para lavar o glutaraldeído restante após a gelificação.
Asperts de frasco a vácuo	, China	VC8130	Para preservar microgéis sob vácuo.
Folhas de polimetilmetacrilato (PMMA)	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Folhas comuns de PMMA.
Sistema de laser	Rayjet Rayjet, Austrália	Rayjet 50 C30	Para gravar folhas de PMMA para formar poços.
Limpador de plasma	Mycro Technologies, EUA	PDC-32G	Para tornar o PMMA hifofílico.
Liofilizador	Boyikang, China	SC21CL	Para liofilizar materiais.
Solução de azul de tripano (0,4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	Para tingir microgéis.
Cloridrato de doxorrubicina	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	Para testar a resistência a medicamentos de células em microgel 2D ou 3D.
Ensaio vivo/morto	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japão)	CS01-10	Para distinguir células vivas e mortas.
Título de Célula-Azul	Promega (Wisconsin, EUA).	G8080	Para testar a viabilidade celular.
Filtro de células	BD Biosciences, EUA	352360	Para coletar microgéis.
D-Luciferina	SYNCHEM (Alemanha)	s039	Para prender células.
Microscópio eletrônico de varredura	FEI, EUA	Quanta 200	Para caracterizar a morfologia do microgel.
Máquina de ensaio mecânico	Bose, USA	3230	Para medir características mecânicas.
Bomba de seringa programável	World Precision Instruments, EUA	ALADINI 1000	Para testar a injactabiliy.
Medidor de força digital	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	Para testar a injactabiliy.
Sistema de esterilização por óxido de etileno	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	Para esterilizar microgéis com gás óxido de etileno.
Dispositivos moleculares	do leitor de Microplate	M5	Para medir a intensidade da fluorescência no micro-array.
Microscópio confocal	Nikon, Japão	A1Rsi	Para observar a distribuição celular em 3D.
Xenógeno Sistema de imagem Lumina II	Caliper Life Sciences, EUA	IVIS	Para rastrear células em animais.
Estatura de trabalho líquido	Design de damasco,	pipeta S dos	Para carregar suspensão média ou celular alta-throuputly.