Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

O uso de hiPSCs representa uma nova estratégia para rastreamento de drogas e estudos mecanicistas de várias doenças. Do ponto de vista regenerativo, os hiPSCs também são uma fonte potencial para a substituição de tecidos danificados que têm capacidade de cura limitada, como a cartilagem articular ^{1 , 2} .

A regeneração da cartilagem articular nativa tem sido um desafio há várias décadas. A cartilagem articular é um tecido macio e branco que abaixa a extremidade dos ossos, protegendo-os da fricção. No entanto, tem habilidade regenerativa limitada quando danificada, o que torna o auto-reparo quase impossível. Portanto, as pesquisas voltadas para a regeneração da cartilagem estão em curso há várias décadas.

Anteriormente, a diferenciação in vitro na linhagem condrogênica geralmente era realizada com BMSC ou condrocitos nativos isolados da articulação do joelho ³ . Devido tO seu potencial condrogênico, BMSCs e condrócitos nativos têm inúmeros méritos que suportam seu uso na condrogênese. No entanto, devido à sua expansão limitada e fenótipo instável, essas células enfrentam várias limitações na reconstrução de defeitos da cartilagem articular. Sob condições de cultura in vitro , essas células tendem a perder suas próprias características após 3-4 passagens, o que eventualmente afeta suas habilidades de diferenciação ⁴ . Além disso, no caso de condrócitos nativos, danos adicionais na articulação do joelho são inevitáveis ​​na obtenção dessas células.

Ao contrário de BMSCs ou condrócitos nativos, os hiPSCs podem expandir-se indefinidamente in vitro . Com as condições de cultura adequadas, os hiPSCs têm um grande potencial como fonte de substituição para a diferenciação condrogênica. No entanto, é um desafio mudar as características intrínsecas dos hiPSCs ⁵ . Além disso, é necessário vários in vitro complicadosPs para direcionar o destino dos hiPSCs para um tipo de célula específico. Apesar dessas complicações, o uso de HiPSCs ainda é recomendado devido às suas altas habilidades de auto-renovação e sua capacidade de se diferenciar em células específicas, incluindo condrócitos ⁶ .

A diferenciação condrogénica é geralmente feita com sistemas de cultura tridimensionais, como a cultura de pelotização ou a cultura de micromassas, usando células progenitoras semelhantes a MSC. Se estiver usando o HiPSCs, o protocolo para gerar células progenitoras do tipo MSC difere dos protocolos existentes. Alguns grupos usam cultura monocamada de hiPSCs para converter diretamente o fenótipo em células tipo MSC ⁷ . No entanto, a maioria dos estudos usa EBs para gerar células de crescimento que se assemelham aos MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Vários tipos de fatores de crescimento são usados ​​para induzir ChondrogeNesis. Geralmente, as proteínas da família BMP e TGFβ são usadas, sozinhas ou em combinação. A diferenciação também foi induzida com outros fatores, como GDF5, FGF2 e IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . Foi demonstrado que TGFβ1 estimula a condrogênese de uma maneira dose-dependente em MSCs ¹⁶ . Comparado com o outro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induz condrogênese, aumentando a condensação da célula pré-cartilagea mesenquimatosa.TGFβ3 induz condrogênese aumentando significativamente a proliferação celular mesenquimatosa ¹⁷ . No entanto, o TGFβ3 é utilizado mais frequentemente por pesquisadores do que TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 aumenta a expressão de genes relacionados aos componentes da matriz condrogênica em humanosCondrócitos articulares sob condições in vitro ²⁰ . BMP2 aumenta a expressão de genes críticos para a formação de cartilagem em MSCs em combinação com proteínas TGFβ ²¹ . Também foi demonstrado que BMP2 melhora sinergicamente o efeito do TGFβ3 através das vias Smad e MAPK ²² .

Neste estudo, os CBMC-hiPSCs foram agregados em EBs usando meio EB em uma placa Petri de baixo valor. As células de ultrapassagem foram induzidas ao unir os EBs a um prato revestido com gelatina. A diferenciação condrogénica utilizando células secundárias foi realizada por cultura de pelota. O tratamento com BMP2 e TGFβ3 condensou com sucesso as células e induziu a acumulação de proteína da matriz extracelular (ECM) para a formação de grânulos condrogénicos. Este estudo sugere um protocolo de diferenciação condrogénica simples, mas eficiente, usando CBMC-hiPSCs.

Este protocolo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). Os CBMCs utilizados para a reprogramação foram obtidos diretamente do Cord Blood Bank do Seoul St. Mary's Hospital.

1. Diferenciação condrogênica de iPSCs

1. Geração CBMC-iPSC
   1. Gerar CBMC-hiPSCs usando o protocolo mostrado em nosso trabalho anterior ²³ .
   2. Colecione as células sanguíneas em um tubo cônico de 15 mL e conte-as usando um hemocitômetro.
   3. Prepare 3 x 10 ⁵ células e centrifugá-las por 5 minutos a 515 xg e RT. Descarte o sobrenadante por sucção e ressuspenda as células em 0,5 mL de meio de células sanguíneas.
   4. Transfira as células para um poço de uma placa não revestida de 24 poços e adicione a mistura de vírus Sendai, seguindo as recomendações do fabricante.
   5. Centrifugue a placa por 30 min a 1.150 xg e 30 ° C.
   6. AtrásPor centrifugação, incubar as células durante a noite (O / N) a 37 ° C em 5% de CO2.
   7. No dia seguinte, transfira as células transduzidas para um poço revestido com matriz. Centrifugue a placa a 1.150 xg durante 30 min a 30 ° C.
   8. Após a centrifugação, remova o sobrenadante, adicione 1 mL de meio iPSC e mantenha as células O / N a 37 ° C em 5% de CO ₂ .
   9. Manter as células anexadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Mude o meio diariamente, substituindo-o por meio de iPSC fresco.
      NOTA: As colônias aparecerão no dia 14-21 após a transdução.
2. Geração EB
   1. Manter o hiPSCs a 37 ° C e 5% de CO ₂ . Mude o meio diariamente, substituindo-o pelo meio essencial Essential 8 (E8).
   2. Prepare 2 x 10 ⁶ hiPSCs em uma placa revestida de vitronectina de 100 mm em meio E8.
   3. Retire o meio E8 do prato de cultura e lave com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
   4. Adicione 1ML de ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA) e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 min.
   5. Colher as células com 3 mL de meio E8 e transferi-las para um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 250 xg à temperatura ambiente (RT) durante 2 min.
   6. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular e ressuspender as células em 5 mL de meio E8.
   7. Contar as células usando um hemocitômetro e preparar 2 x 10 ⁶ células para cada 100 mm de placa de Petri. Ressuspender as células preparadas em uma mistura de 10 mL de meio E8 e EB (1: 1) com 10 μM de inibidor de quinase associada a rho (ROCK).
   8. Incube as células O / N para agregação a 37 ° C e 5% de CO ₂ .
   9. No dia seguinte, colhe os EBs agregados por pipetagem. Centrifugar as células a 250 xg durante 1 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda os EBs em 10 mL de meio E8 fresco.
   10. Amplie os EBs gerados por 5 dias, realizando mudanças diárias com fresH E8 médio. Para uma maior maturação, mude o meio de cultura para o meio E7. Manter os EBs a 37 ° C e 5% de CO ₂ por mais 5 dias, realizando mudanças médias diárias com meio E7 fresco.
       NOTA: O meio E7 é meio E8 sem FGF2.
3. Indução de células de crescimento de EBs
   1. Adicionar 6 mL de gelatina a 1% a uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 30 min.
   2. Retire a gelatina e retire o prato completamente por 2-3 h antes de usar.
   3. Transfira os EBs para um tubo cônico de 50 mL. Permita que os EBs se instalem na parte inferior do tubo cônico. Remova o sobrenadante sem perturbar os EBs.
   4. Ressuspender os EBs em 10 mL do Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 20% de soro bovino fetal (FBS). Transfira os EBs para o prato 100 mm revestido com gelatina. Adicionar 10 μM ROCK inibidor.
   5. Incubar e manter as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 7 dias. Mudar temaDiariamente, sem adição de inibidor de ROCK.
4. Formação de grânulos condrogénicos
   1. Aspirar o meio de cultura do prato e lavar as células três vezes com PBS.
   2. Aplicar 1 mL de EDTA 1 mM e incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 min.
   3. Colher as células usando 5 mL de DMEM com 20% de FBS e transferi-las para um novo tubo cônico de 15 mL.
   4. Centrifugar as células por 2 minutos a 250 xg e RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o grânulo em 10 mL de DMEM com FBS a 20%.
   5. Filtre e descarte os aglomerados de células usando um filtro de células de 40 μm e colhe as células individuais. Contar as células individuais usando um hemocitômetro.
   6. Centrifugar as células por 2 minutos a 250 xg e RT. Remova o sobrenadante e semeie 3 x 10 ⁵ células por pelotização em um tubo cônico de 15 mL com 300 μL de meio de diferenciação condrogênica (MDL).
   7. Para a formação de pelozes, centrifugar as células por 5 min a680 xg e RT.
      NOTA: Os grânulos são mantidos em tubos cônicos de 15 mL durante a diferenciação dos grânulos condrogénicos.
   8. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO ₂ .
   9. Altere o MDL a cada 2-3 dias. Dentro de 3 dias, os grânulos exibirão morfologias esferóides achatadas e esferoidais. Manter as pastilhas por 21 dias a 37 ° C e 5% de CO ₂ .

2. Caracterização de pelozes condrogénicas por coloração

1. Incorporação condrogênica
   1. Antes de incorporar, preparar e derreter a parafina a 58 ° C.
   2. Corrigir os grânulos em 1 mL de paraformaldeído a 4% durante 2 h à TA em um tubo de 1,5 mL.
      Atenção: o paraformaldeído é altamente tóxico. Evite o contato com os olhos, a pele ou as mucosas. Minimize a exposição e evite a inalação enquanto a prepara.
   3. Coloque uma camada de gaze na cassete e transfira as pastilhas fixas usando uma pipeta. Cubra a pelota dobrandoFaça uma gaze e feche a tampa da cassete.
   4. Inicie a desidratação em 100 mL de etanol a 70% (EtOH) duas vezes, 10 min cada. Desidratar os grânulos através de lavagens sequenciais de 10 minutos em 80% e EtOH a 95%.
   5. Transfira os grânulos para 100% de EtOH durante 10 min. Repita três vezes com EtOH fresco.
   6. Para "limpeza", troque a solução para uma mistura de 100 mL, 1: 1 de EtOH e xileno, seguido de uma mistura 1: 2 de EtOH e xileno durante 10 min cada. Limpe o EtOH restante incubando os grânulos duas vezes em 100% de xileno, 10 min cada.
   7. Para infiltração de parafina, incubar os grânulos em misturas sequenciais de xileno e parafina. Execute todo o processo de infiltração de parafina a 58 ° C. Incubar os grânulos em 100 mL de uma mistura 2: 1 de xileno e parafina durante 30 min.
   8. Troque a solução para 100 mL de uma mistura 1: 1 de xileno e parafina e incube durante 30 min.
   9. Troque a solução para 100 mL de uma mistura 1: 2 de xileno e parafina e incube por 30 min.
   10. Para a infiltração final, transfira os grânulos para o primeiro banho de parafina 100% e incube durante 2 h.
   11. Transferir os grânulos para o segundo banho de parafina 100% e incubar O / N a 58 ° C.
   12. No dia seguinte, transfira suavemente os grânulos para um molde usando uma pinça. Adicione a parafina ao molde do dispensador de parafina. Solidifique a parafina durante 30 min a 4 ° C.
   13. Cortar as secções a 7 μm e transferir as seções para o slide. Deixe as lâminas secar durante a noite e guarde as lâminas na RT até que estejam prontas para uso.
2. Preparação da corrediça
   1. Desparafinize as lâminas movendo-as através de 100 mL de 100%, 90%, 80% e 70% de EtOH sequencialmente durante 5 minutos cada.
   2. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min.
3. Coloração azul alcian
   1. Incubar as lâminas em 50 mL de solução alcian azul a 1% durante 30 min.
      NÃOE: Azul alcalino é diluído em solução a 3% de ácido acético. Ajuste o pH para 2,5 usando ácido acético.
   2. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 2 min.
   3. Enxágüe as lâminas em água desionizada (DW) e compareça com solução nuclear rápida por 2 min.
   4. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 1 min.
   5. 2.3.5) Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6.
4. Mancha de azul de toluidina
   1. Incubar lâminas em 50 mL de solução de azul de toluidina durante 4 min.
   2. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min.
   3. Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6.
5. Coloração imuno-histoquímica
   1. Incubar as lâminas em 3% de H ₂ O ₂ durante 15 min para o bloqueio da peroxidase endógena.
   2. Aplicar 200 μL de anticorpo primário (anti-COL1A1 e -COL2A1) diluído 1: 100 em tris-buSoro férreo (TBS) contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de cabra normal (NGS) para as lâminas e incubar O / N a 4 ° C.
   3. No dia seguinte, coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-os com 50 mL de TBS contendo 0,1% de polissorbato 20 (TBST) três vezes por 5 minutos cada.
   4. Aplicar 200 μL de anticorpo secundário (anticorpo IgG de cabra anti-coelho, diluído 1: 200 em TBS contendo 1% de BSA e 5% NGS) para as lâminas e incubar à TA durante 40 min.
   5. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-as três vezes com 50 mL, 5 minutos cada.
   6. Para amplificação de sinal, aplique solução de estreptavidina conjugada com HRP para as lâminas e incube durante 10 min.
   7. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e lave-as três vezes com 50 mL, 5 minutos cada.
   8. Misture a solução de substrato DAB-peroxidase, aplique 200 μL de solução a cada lâmina e incube durante 1 min.
   9. Coloque as lâminas em uma jarra de vidro e enxaguar com água da torneira por 5 min.
   10. CounterstainCom hematoxilina de Mayer durante 1 min.
   11. Lave as lâminas com DW.
   12. Proceda para desidratar e montar as lâminas no passo 2.6.
6. Desidratação e montagem
   1. Desidratar os slides movendo-os sequencialmente através de 100 mL de 70%, 80%, 90% e 100% EtOH, 30 s cada.
   2. Mergulhe os slides em duas mudanças de xileno durante 1 min cada.
   3. Adicione 50 μL de solução de montagem aos lamínulas e coloque as lâminas na parte superior.

Neste estudo, geramos grânulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs induzindo células de crescimento de EBs. A diferenciação condrogênica foi induzida usando CBMC-hiPSCs com alta pluripotência confirmada 11 . Um esquema simples de nosso protocolo é mostrado na Figura 1A . Antes da diferenciação, as colônias iPSC foram expandidas ( Figura 1B ). Os iPSC expandidos foram montados como EBs para iniciar a diferenciação ( Figura 1C ). Os EBs gerados foram anexados a pratos revestidos com gelatina para induzir células de crescimento ( Figura 1D ). Em seguida, as células de crescimento foram colhidas e utilizadas para gerar grânulos condrogénicos. Após 21 dias de diferenciação, foram obtidos pequenos grânulos condrogénicos semelhantes a grânulos e utilizados para maior caracterização ( Figura 1E ). A qualidade do chon gerado in vitroOs grânulos de drogénio foram confirmados através de vários ensaios.

Avaliamos histologicamente a qualidade dos grânulos condrogénicos no dia 21. Os grânulos condrogénicos BMSC foram utilizados como controle positivo. A acumulação de proteínas ECM segregadas pelos condrócitos diferenciados foi confirmada por coloração azul alciano e azul de toluidina na Figura 2A . As principais características da cartilagem saudável, como a produção de lacunas e proteoglicanos, aumentaram à medida que o processo de diferenciação continuou ao longo de 21 dias. Os grânulos condrogénicos gerados a partir de CBMC-hiPSCs expressaram COL2A1, que é o principal componente de ECM em cartilagem saudável ( Figura 2B ). A expressão de COL2A1 de grânulos derivados de CBMC-hiPSC foi maior do que a das pastilhas derivadas de BMSC. A expressão de colágeno tipo I, um marcador para cartilagem fibrótica, foi menor em grânulos derivados de CBMC-hiPSC em comparação com a expressão de COL2A1.

A expressão gênica das proteínas ECM da cartilagem no período de 21 grânulos condrogénicos foi confirmada por PCR em tempo real. A expressão de agrecana (ACAN) de grânulos derivados de CBMC-hiPSC foi semelhante à dos grânulos derivados de BMSC ( Figura 3A ). A expressão de COL2A1 foi significativamente maior nas pastilhas CBMC-HiPSC derivadas ( Figura 3B ). A expressão da região Y-box 9 (Sox9) determinante do sexo, um marcador progenitor condrogênico, também foi avaliada. Pellets gerados a partir de CBMC-hiPSCs expressaram altos níveis de Sox9 ( Figura 3C ). Confirmamos que esses genes foram significativamente aumentados em bolinhas condrogênicas de CBMC-hiPSC em comparação com os grânulos de controle de BMSC no dia 21. A expressão de um marcador hipertrófico, COL1A1, foi avaliada ( Figura 3D ). A expressão de COL1A1 em grânulos derivados de CBMC-hiPSC foi reduzida em comparação com a de BMSC-deriPellets ved. A eficiência de diferenciação foi analisada pela proporção de COL2A1 para COL1A1 ( Figura 3E ). O incremento da proporção em grânulos derivados de CBMC-hiPSC demonstrou a expressão relativamente alta de COL2A1 em comparação com COL1A1. Em conclusão, confirmamos a capacidade de diferenciação condrogênica de CBMC-hiPSCs. A qualidade dos grânulos carbonatados derivados de CBMC-hiPSC gerados possuía uma qualidade compatível com a dos BMSCs.

Figura 1: diferenciação condrogênica de hiPSCs. ( A ) Esquema da geração de grânulos condrogénicos de hiPSCs. ( B ) Morfologia do CBMC-hiPSC gerado. ( C ) Morfologia de EBs gerados. ( D ) Células de crescimento derivadas de EBs ligadas a um prato de cultura revestido com gelatina. ( E ) Imagem de t Ele granulado condrogênico após 21 dias de diferenciação. As unidades dos intervalos são mostradas em milímetros. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise histológica do grânulo condrogénico. ( A ) Avaliação histológica de grânulos condrogénicos no dia 21 usando coloração azul alciano e azul de toluidina. ( B ) Imagem imuno-histoquímica de grânulos condrogénicos corados com anticorpos COL1A1 e COL2A1. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1 ">
Figura 3: Expressão genética do grânulo condrogénico. ( A ) Expressão gênica relativa de ACAN. ( B ) Expressão gênica relativa de COL2A1. ( C ) Expressão gênica relativa de SOX9. ( D ) Expressão gênica relativa de COL1A1. ( E ) Expressão genética de COL1A1. ( F ) Expressão genética de COL10A1. ( G ) A proporção da expressão do gene COL2A1: COL1A1. Os pellets foram colhidos e analisados ​​após 21 dias de diferenciação. Os dados foram obtidos usando PCR em tempo real e exibidos como o erro padrão médio de experiências triplicadas por amostra (n = 3). A expressão do gene foi normalizada para GAPDH como um controle interno. (* P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).K "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Número do celular	Rendimento das células de crescimento	Produção de pelota
HiPSCs	2 x 10 6	2-5 x 10 7	70-150
MSC	2 x 10 6	-	6

Tabela 1: Comparação de rendimento de MSC e HiPSCs.

Nome do alvo	Direção	Seqüência de iniciador	Tamanho
	progressivo	TTCCGCGACGTGGACAT	77 pb
Marcha ré	TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT
UMA LATA	progressivo	AGCCTGCGCTCCAATGACT	107 pb
Marcha ré	TAATGGAACACGATGCCTTTCA
COL2A1	progressivo	GGCAATAGCAGGTTCACGTACA	79 pb
Marcha ré	CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA
COL1A1	progressivo	CCCCTGGAAAGAATGGAGATG	148 pb
Marcha ré	TCCAAACCACTGAAACCTCTG

Tabela 2: Seqüências de iniciadores contra marcadores condrogênicos em PCR em tempo real.

Os autores não têm nada a revelar.