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Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

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DOI:

10.3791/55994

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25 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

Neste artigo

Resumo

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Resumo

Vetores de vírus adeno-associado (AAV) são um reagente chave nas Neurociências para cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR), optogenetics, cre-lox segmentação, etc. O objetivo deste manuscrito é ajudar o investigador a tentativa de transferência de genes de extenso sistema de nervoso central (SNC) em ratos através da injeção de veia de cauda de AAV. Expressão de larga escala é relevante para as condições com patologia generalizada, e um modelo do rato é significativo devido ao seu tamanho maior e fisiológicas semelhanças com os seres humanos em comparação com ratos. Neste aplicativo de exemplo, uma transdução neuronal em larga escala é usada para imitar uma doença neurodegenerativa que afeta toda medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica (ela). A transdução de CNS eficiente em grande escala também pode ser usada para entregar fatores de proteínas terapêuticas em estudos pré-clínicos. Após um intervalo de expressão pós-injeção de várias semanas, são avaliados os efeitos da transdução. Para um vetor de controle de proteína verde fluorescente (GFP), a quantidade de GFP no cerebelo é estimada rapidamente e confiantemente por um programa básico da imagem latente. Para fenótipos motor doença que são induzidos pelo ALS relacionados resposta transacional de proteínas DNA-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43), os défices são marcados por rotarod e reflexo de fuga. Além da modelagem de doença e terapia genética, existem diversas aplicações potenciais para o gene em larga escala como alvo descrito aqui. Expandido o uso deste método irá ajuda em acelerar testes nas neurociências e neurogenética de hipóteses.

Introdução

Vectores recombinantes vírus adeno-associado (AAV) são ferramentas indispensáveis para a investigação do CNS, porque eles são tão eficientes para transducing neurônios em vivo. Vetores AAV são muito versáteis para estudar diferentes transgenes e isoformas de proteínas, tecidos diferentes, espécies hospedeiras diferentes e diferentes vias de administração. Por exemplo, AAV pode ser administrado a ratos por um periférico, relativamente não-invasivo, injeção intravenosa para transduce neurônios em todo o CNS como o primeiro descrito em Foust et al e Duque et al (veja papel de Júpiter por Gombash et al (2014)). 1 , 2 , 3 abordagem de entrega este gene é usada em ratos eficientemente expressar qualquer proteína verde fluorescente (GFP) ou o ALS relacionados a proteína, a resposta transacional ADN-proteína obrigatória de 43 kDa (TDP-43) no SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabalhando em ratos é significativa porque o rato está fisiológica e metabólica parâmetros estão mais próximos aos seres humanos em comparação com ratos e há ensaios toxicológicos e comportamentais projetados especificamente para ratos. Além disso, mais linhas de ratos transgénicos estão se tornando disponíveis que podem ser utilizados em estudos de transferência de gene AAV.

Métodos são detalhados para transferência de genes de CNS expansiva no rato e rápida e confiável de quantificação dos resultados. Transdução de CNS em larga escala é usada para imitar a sintomatologia de ALS em ratos expressando TDP-43 ao longo da medula espinhal. O método é cauda veia injeções do vetor de ratos adultos jovens como usado em Jackson et al TDP-43 6 , 8 , 9 depois de várias semanas, TDP-43-induzido motor défices são marcados por dois métodos: escapar de reflexo e rotarod como usado em Dayton et al e Jackson et al 5 , 6 , 7 , 9 para o vetor de controle GFP, em análise post-mortem, a área fluorescente do cerebelo é calculada como um índice de eficiência de transdução como usado em Jackson et al . 6 , 8 a análise do cerebelo tem provado para ser um índice rápido e confiável do grau de transdução CNS após a entrega do gene periférica e deve ser aplicável a uma variedade de abordagens, a tentativa de transferência de genes de periféricos-para-central.

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Protocolo

todos os procedimentos seguiram as orientações adequadas de NIH. Todos os procedimentos seguiram protocolos de animais que foram aprovados pelo Comitê de uso no centro de Ciências de saúde de LSU em Shreveport e cuidado Animal. Ratas Sprague-Dawley com 6 semanas de idade foram utilizadas para este procedimento.

1. determinar os doses/volumes de vetor necessário

  1. pesar ratos injetados e determinar a quantidade de vetor viral necessária para cada animal com base do título (concentração), da preparação do vetor. Usar doses de vetor que foram bem sucedidos para expressão eficiente no rato CNS anteriormente (ver Jackson et al. 6).
    Nota: para AAV9 TDP-43 ou AAV9 GFP, uma dose típica é entre 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomas/kg. Os ratos adultos jovens com 6 semanas de idade pesam cerca 150 g.
  2. Fazer doses equivalentes por kg em todos os animais para comparações sistemáticas. Certifique-se que o volume não exceda volumes de injeção aconselhados padrão (250-500 µ l para um rato de 250 g). Um volume de injeção típico é 200 μl de um jovem rato adulto.

2. Preparar a estação de trabalho

  1. pegar os materiais necessários: um filme de parafina quadrada (cerca de 5 x 5 cm) por animal, almofada de preparação de um álcool por animal, gaze (2-3 por animal), pontas de pipeta e uma micropipeta.
  2. Preparar a superfície de trabalho, limpando a superfície com etanol a 70%. Coloque uma almofada de aquecimento para baixo com a temperatura definida como baixa (~ 37 ° C). Coloque uma almofada do banco em cima da almofada de aquecimento.
  3. Preparar a anestesia de gás (isoflurano). Certifique-se de oxigênio adequado e anestesia de gás para o procedimento. Limpar a máscara de anestesia e câmara de indução com etanol a 70% e coloque a máscara de anestesia na almofada banco.

3. Preparar o vetor

  1. descongelar o vetor à temperatura ambiente e rotular um tubo estéril microcentrifuga para cada animal.
  2. Pipeta o volume de AAV determinado no passo 1.1 para o tubo apropriado e trazer o volume o volume de injeção desejado (aqui, 200 μl) com Ringer lactato ' solução salina ou solução de s.
  3. Pulso vórtice a amostra para 1-2 s e então pulse centrífuga para 5 s para levar a amostra para o fundo do tubo.
  4. Pipeta o volume total de injeção para o rato fora do tubo e para a Praça da película de parafina.
  5. Colocar uma agulha de 30 calibre em uma seringa de 1 mL.
  6. Coloque a agulha com o bisel virado para baixo na vetor do filme de parafina. Puxe o êmbolo da seringa até que todo o vírus está na agulha e seringa. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar para a agulha, que se torna mais fácil com a prática de desenho.

4. Preparar o rato

  1. aumentar o oxigênio até 1 L/min e defina a anestesia de isoflurano para 5%. Certifique-se de que a anestesia de gás está fluindo para a câmara de indução, verificando todas as mangueiras de ligação e orientações torneira.
  2. Colocar o rato na câmara de indução de anestesia de gás cerca de 3 min, até que o rato não está respondendo.
  3. Assegurar adequada profundidade de anestesia por beliscar o dedo do pé. Não deve haver nenhum movimento no pé ou na perna após o aperto de dedo do pé.
  4. Reduzir a anestesia de isoflurano para 2% para a manutenção da anestesia e ajustar a torneira para que a anestesia está fluindo para a máscara de anestesia.
  5. Colocar o rato ' s nariz da máscara de anestesia e ajustar o rato, de modo que é uma mentira do seu lado.
  6. Identificar a veia lateral da cauda.
    Nota: As veias de cauda lateral mentem em aproximadamente 10 e 2 o ' relógio com a face dorsal da cauda como 12 o ' relógio. Com o rato deitado de lado, a veia lateral da cauda deve ser voltado para cima
  7. Limpe a área de injeção com a almofada da preparação do álcool. Local da injeção é dois terços do comprimento da cauda.

5. Injetar o vetor

  1. Segure firmemente a cauda ligeiramente acima da área de injeção com um dedo diretamente sobre a veia lateral da cauda; isso vai dilatar a veia.
  2. Com o bisel voltado para cima, alinhar a agulha com a veia da cauda visível na mesma direção.
  3. Perfuram a pele sobre a veia da cauda enquanto tomar muito cuidado para evitar a outra mão segurando a cauda e pressionando a veia da cauda.
  4. Liberar a pressão da veia da cauda para permitir o fluxo de sangue normal.
  5. Mover a agulha na veia. Para assegurar que a agulha perfurou a veia da cauda, puxe levemente o êmbolo. Se a agulha está na veia, o sangue fluirá para a agulha.
    1. Reposicionar a agulha conforme necessário. Então, para estabilizar a agulha, mover a mão acima do local da injeção para abaixo do local da injeção e segure a extremidade da seringa contra cauda.
  6. Lentamente injete o vetor dentro da cauda (aproximadamente 20 µ l/s).
    Nota: A veia pode perder a cor como o vetor atravessa-lo. Sinais de que a solução foi injetada fora da veia incluem blebbing, branqueamento da pele, ou resistência quando injetar o vetor. Com a prática, exposição extra vascular pode ser minimizada.
  7. Depois que o vetor tem sido administrado, retire a agulha do rato e pressione com uma gaze contra o local da injeção para ajudar a conter a hemorragia para 30-60 s.

6. Limpar

  1. desativar o isoflurano anestesia e oxigênio. Monitorar o rato até que recupere a consciência e depois devolvê-lo à sua jaula.
  2. Cuidadosamente Coloque todas as agulhas no recipiente para objectos cortantes. Elimine todos os outros materiais descartáveis que são potencialmente contaminados com vírus adeno-associados em um recipiente apropriado risco biológico. Limpar as estações de trabalho com etanol a 70%.

7. Avaliar reflexo de fuga do membro posterior

Nota: membro posterior défices surgem geralmente 2-6 semanas após a transferência de genes de TDP-43, dependendo da dose de vetor.

  1. Sobre uma superfície plana clara de detritos, com dois dedos, pegue o rato ' s tail aproximadamente 2 cm do corpo. Levante o rato delicadamente até os membros dianteiros são pendurado enquanto visualiza a parte ventral inferior do rato.
    1. Executar o procedimento semanalmente ao longo do tempo-curso experimental após a transferência de genes (por exemplo, até 12 semanas após a transferência de genes).
      Nota: Também marcar défices do membro anterior dessa maneira, mas os défices de membro posterior são mais prováveis de ocorrer neste modelo, dependendo da dose de vetor usada.
  2. Observar os membros traseiros para 10 Nota s. se um ou ambos os membros traseiros cerrar em direção à linha média durante a 10 s.
  3. Repetir este teste para um total de três vezes com 30 s entre ensaios. Se um ou ambos os membros posteriores estão cerrados para cada um dos três ensaios, o rato está mostrando disfunção motora. Gravar os dados (manualmente nas notas) como qualquer défice de membro posterior unilateral ou bilateral presente se houver consistente apertamento em todos os três ensaios.

8. Avaliar a função motora sobre o rotarod

  1. para configurar o rotarod, coloque uma almofada do banco sob o rotarod e definir a aceleração de 4-40 rotações por minuto (rpm) mais 2 min (a taxa aumenta em ~0.3 rpm/s). Por um tempo-curso de 12 semanas, executar os assuntos em 2, 4, 8 e 12 semanas após o gene transfer.
    2. Permitir que
  2. o rato se adaptar à sala de testes de 20 min.
  3. Para treinar com o rato usar a rotarod pela primeira vez, primeiro iniciar o rotarod definir velocidade de 4 rpm, em seguida, coloque o rato sobre o rotarod. Permitir que o rato caminhar por uma revolução completa a 4 rpm e, em seguida, iniciar a aceleração e permitir que o rato andar sobre o rotarod até que ele cai. Continuar o treinamento até que o rato pode caminhar consistentemente pelo menos 40 s. Um rato saudável, jovem e adulto serão prontamente treinado dessa maneira.
    1. No caso de um rato com uma visível deficiência motora, que pode impedir que o rato uma latência de linha de base para cair de 40 s, fornecer o rato tentativas de formação 3-5 antes de começar a marcar rotarod.
  4. Para iniciar os testes rotarod, coloque o rato sobre o rotarod e começar a aceleração da rotarod. Observe o tempo em que o rato cai do rotarod; Esta é a latência para cair. Se o rato permanece sobre o rotarod depois de 120 s, cap a sessão neste momento, remova o rotarod o rato e gravar uma latência de queda de 120 s.
  5. Repetir o teste duas vezes mais para um total de três julgamentos. Para minimizar o efeito de fadiga, espaço de ensaios pelo menos 5 min separado. As pontuações dos três ensaios em média. Um rato adulto inquebrantável normalmente tem uma latência média a queda das > 40 s.
  6. Coloque o rato volta na gaiola e limpe o rotarod e áreas adjacentes com etanol a 70%.

9. Quantificação da expressão de GFP no cerebelo

  1. anestesiar os ratos e perfundir com salina tampão fosfato (PBS) e, em seguida, paraformaldeído 4%. Dissecar o cérebro e a medula espinhal e mergulhe os tecidos no fixador durante a noite e em seguida, movê-los para uma solução de sacarose de 30%. Depois de equilibração, corte 50 μm coronal seções em um micrótomo deslizante com congelamento fase 4 , 5 , 6.
  2. Escolher 3-6 seções do cerebelo que são espaçadas na vermis, o lobo central do cerebelo. Etiqueta fluorescente a GFP para maximizar o sinal. Use o anticorpo primário para GFP em 1: 500 e Alexa 488 anticorpo secundário conjugado a uma diluição de 1: 300 4 , 5 , 6.
    Nota: Ver referencia 4 , 5 , 6 para mais detalhes sobre a amostragem, corte e coloração procedimentos.
  3. Photomicrograph cada seção na região definida de interesse com uma lente de ampliação baixa usando um microscópio. Uso um objectivo de X 2,5 (N.A. 0,12) e filtro conjunto 10, 450-490/515-565 excitação/emissão). Manter as configurações da câmera (exposição vezes, por exemplo, 2 s) o mesmo através de amostras a analisar. Salve como um. Arquivo TIF.
  4. Abrir a Fotomicrografia no amplamente disponível programa Scion image; duas janelas serão aberto. Feche a janela indicada como " cores indexadas ".
  5. Escolher " opções ", então " densidade SliceŔ uma gama de tons será indicada em vermelho na janela tabela do Look-up (LUT). Na janela, use o cursor para preencher a rotulagem de GFP específica só e parar quando o fundo específico começa a ser levantada na imagem.
    Nota: Isto irá destacar a área fluorescente sobre a Fotomicrografia a quantificar. As configurações devem ser otimizadas para especificamente capturar todas as células fluorescentes visivelmente. Com a prática, este método pode precisamente destacar a fluorescência específica.
  6. Antes de medir a área fluorescente, primeiro assegurar que as medições feitas nas unidades corretas (pixels). Para fazer isso, clique em " Analyze ", então " ScaleŔ conjunto a quarta linha deveria dizer " unidades ". Na lista suspensa, escolha pixels para medir em pixels e, em seguida, clique " Okey ". Alternar entre as opções de análise de " incluem Interior furos " para garantir a inclusão de todo o corpo da célula na análise.
    7. Clique em
  7. para medir a área fluorescente, " analisar " e, em seguida, clique " medida ". Para ver esse valor, clique " Analyze " clique " mostrar ResultsŔ vai aparecer uma janela de resultados. A medição da área fluorescente será sob o título rotulado " área ".
  8. Para garantir a padronização entre as medições, não altere os valores realçados na janela LUT.
  9. , Uma vez que todas as medições foram registradas, os valores médios para cada animal (de 3 a 6 seções por animal). Utilize um teste estatístico apropriado para comparar as áreas transduzidas entre os grupos. 6

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Resultados

TDP-43 induzidas motor deficiências devem surgir dentro de 2-6 semanas, dependendo da dose da AAV TDP-43 usado (Figura 1). Injeções de veia de cauda malsucedida resultará em parcial ou sem deficiências; a AAV deve atinjam a corrente sanguínea para produzir o efeito. Uma injeção bem sucedida de AAV GFP resultará em expressão de GFP em todo o cérebro e a medula espinhal, de uma forma de vetor-dose dependente. Ao usar o promotor recombinante forte a expressão de...

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Discussão

Uma variedade de rotas de entrega foram testados para vetores AAV: intraparenquimatosa, intra-cerebroventricular, intra-thecal, por via venosa, intranasal, intramuscular, etc. Cada rota pode ter vantagens específicas, bem como inconvenientes. Administração de cauda veia de AAV de ratos adultos é um método confiável para a realização de transdução consistente do SNC. O método de injeção periférica evita a introdução de uma cânula de injeção nos tecidos CNS e, portanto, minimamente invasivo. A expressão eficiente do CNS qu...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e uma doação de caridade para a investigação de ALS de Thomas Lawson, para os quais somos gratos. Agradecemos a eliane pomar e Donna Burney para aconselhamento e formação. JAS foi apoiada pela Fundação mentiu e National Institutes of Health conceder GM103418.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Balde Nalgene ScalePelouzeSP5
ThermoScientific120140004000 mL
Tubo de microcentrífugaUSA Scientific1615-5500
Solução de Ringer com lactatoBaxter Healthcare0338-0114-04
Mini vórticeCentrífuga 128101
ScientificEppendorf22624415
Filme de laboratórioBemisPM996
Seringa de 1 mLBD309626Vem com uma agulha de 25g acoplada.
Substitua por agulha de 27-30g para injeção
Agulha de 30gBD305106
IsofluranoPiramal Healthcare66794-013-25Isoflurano USP 250 mL
Máscara de anestesiaKopf Instruments906
GauzeHenry Schein100-25242" x 2" (5cm x 5cm)
Pontas de pipetaUSA Scientific1111-0816
MicropipetGilson4642080
Vaporizador de anestesia com gásSurgiVet4214322Classic T3
Eliminador de anestesia com gásSurgiVet32373B10Almofada de aquecimento Enviro-PURE
Sears17280
Almofada de bancadaVWR56617-006
RotarodPanlab / Harvard Apparatus76-07724 ratos / 4 camundongos
70% EtanolDecon Laboratories, Inc.2401140 prova
70% IsopropanolVWR89108-160
Scion ImageScion Corporation
GFP Tag Anticorpo policlonalInvitrogenA11122Anticorpo primário - diluição 1:500
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Anticorpo secundário - diluição 1:300
microscópio Axioskop 40Zeiss
Fisher

Referências

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
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  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
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