Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pequenas rica em cisteína defensinas são um dos maiores grupos de péptidos de defesa do hospedeiro presentes em todas as plantas. Muitos defensinas de plantas apresentam potente em vitro atividade antifúngica contra um amplo espectro de patógenos fúngicos e, portanto, têm o potencial para ser usado como agentes antifúngicos em culturas transgénicas. Para aproveitar todo o potencial de defensinas de plantas para controle de doenças, é crucial para elucidar seus mecanismos de ação (MOA). Com o advento de técnicas avançadas de microscopia, imagem latente da viver-pilha tornou-se uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica da MOA antifúngico de defensinas de plantas. Aqui, um método de imagem de microscopia confocal com base viver-pilha é descrito usando dois defensinas de plantas fluorescente etiquetadas (MtDef4 e MtDef5) em combinação com corantes fluorescentes vitais. Esta técnica permite a visualização em tempo real e análise dos eventos dinâmicos da internalização de MtDef4 e MtDef5 em células fúngicas. Importante, neste ensaio gera uma riqueza de informações, incluindo cinética da internalização, modo de entrada e Localização subcellular destes peptides. Juntamente com outras ferramentas de célula biológica, estes métodos fornecidos críticos insights sobre a dinâmica e a complexidade da MOA destes peptides. Essas ferramentas também podem ser usadas para comparar o MOA destes peptides contra fungos diferentes.
Introdução
As plantas desenvolveram um sofisticado sistema imune inato para defesa contra o de patógenos microbianos planta1. Expressam numerosos péptidos de defesa anfitrião gene codificado com atividade antimicrobiana putativo2. De fato, muitos destes peptides exibem atividade antimicrobiana em vitro3. Defensinas compõem um dos maiores grupos de peptídeos de defesa do hospedeiro no Reino planta4. Estes peptídeos ricos em cisteína, catiônicos apresentam atividade inibitória do crescimento potentes contra fungos e patógenos oomiceto em concentrações micromolar e representam u....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. rotulagem de defensinas com Fluorophores
- Selecione um fluoróforo que tem efeito mínimo sobre as propriedades antimicrobianas, bem como a captação e a localização de defensina dentro da célula viva.
Nota: Selecionar o fluoróforo ideal depende de objetivos experimentais específicos. Propriedades químicas e espectrais, fotoestabilidade, tamanho e carga do fluoróforo também devem ser consideradas. - Etiqueta defensina com o fluoróforo selecionado usando um peptídeo adequado rotulagem kit disponível fornecedores comerciais. Alternativamente, quimicamente sintetiza defensinas fluoróforo-rotulados. Neste estudo, rotular MtDef5 defensina com DyLight5....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Viver imagem latente da pilha foi realizado para acompanhar e comparar a internalização e Localização subcellular de dois defensinas, MtDef4 e MtDef5, de Medicago truncatula; em células fúngicas. TMR-MtDef4 foi sintetizado quimicamente enquanto MtDef5 foi rotulado com Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conídios foram incubados com qualquer defensina em combinação com o corante de membrana seletiva FM4-64. A Figura 1 mostra que a TMR-MtDef4 tem diferente.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste estudo, uma metodologia de viver-pilha confiável de imagens com o uso da fluorescente etiquetadas defensinas antifúngicas foi descrita para estudar a cinética da internalização destes peptides em células fúngicas e determinar os alvos subcellular. Este método é uma ferramenta poderosa para visualizar a dinâmica da interação entre defensinas e células fúngicas, temporal e espacialmente.
Vários métodos têm sido usados para estudar a internalização e localização intracelular de defensinas d.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. R. Howard Berg, diretor do centro de microscopia integrado com o Donald Danforth Plant Science Center, para sua orientação e ajuda com microscopia confocal. Os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Kit de rotulagem de anticorpos | Thermo Scientific | 84530 | |
| Prato de micropoços com fundo de vidro | TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Pano Mira | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X microscópio confocal | Software Leica | ||
| ImageJ | FiJi | para análise de imagem | |
| Imaris software | Bitplane | para análise de imagem |
Referências
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
