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Artigo de método

Imagem latente da viver-pilha de células fúngicas para investigar os modos de entrada e localização Subcellular da planta antifúngico defensinas

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DOI:

10.3791/55995

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24 de dezembro de 2017

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Defensinas de plantas desempenham um papel importante nas defesas vegetais contra patógenos. Para uma utilização eficaz destes peptides antifúngicos como agentes antifúngicos, compreender seus modos de ação (MOA) é crítica. Aqui, um método de imagem de viver-pilha é descrito para estudar aspectos críticos do MOA destes peptides.

Resumo

Pequenas rica em cisteína defensinas são um dos maiores grupos de péptidos de defesa do hospedeiro presentes em todas as plantas. Muitos defensinas de plantas apresentam potente em vitro atividade antifúngica contra um amplo espectro de patógenos fúngicos e, portanto, têm o potencial para ser usado como agentes antifúngicos em culturas transgénicas. Para aproveitar todo o potencial de defensinas de plantas para controle de doenças, é crucial para elucidar seus mecanismos de ação (MOA). Com o advento de técnicas avançadas de microscopia, imagem latente da viver-pilha tornou-se uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica da MOA antifúngico de defensinas de plantas. Aqui, um método de imagem de microscopia confocal com base viver-pilha é descrito usando dois defensinas de plantas fluorescente etiquetadas (MtDef4 e MtDef5) em combinação com corantes fluorescentes vitais. Esta técnica permite a visualização em tempo real e análise dos eventos dinâmicos da internalização de MtDef4 e MtDef5 em células fúngicas. Importante, neste ensaio gera uma riqueza de informações, incluindo cinética da internalização, modo de entrada e Localização subcellular destes peptides. Juntamente com outras ferramentas de célula biológica, estes métodos fornecidos críticos insights sobre a dinâmica e a complexidade da MOA destes peptides. Essas ferramentas também podem ser usadas para comparar o MOA destes peptides contra fungos diferentes.

Introdução

As plantas desenvolveram um sofisticado sistema imune inato para defesa contra o de patógenos microbianos planta1. Expressam numerosos péptidos de defesa anfitrião gene codificado com atividade antimicrobiana putativo2. De fato, muitos destes peptides exibem atividade antimicrobiana em vitro3. Defensinas compõem um dos maiores grupos de peptídeos de defesa do hospedeiro no Reino planta4. Estes peptídeos ricos em cisteína, catiônicos apresentam atividade inibitória do crescimento potentes contra fungos e patógenos oomiceto em concentrações micromolar e representam uma das primeiras linhas de defesa contra estes patógenos5,6. Por causa da sua potente atividade antifúngica, defensinas podem ser exploradas em aplicações agribiotechnological para gerar culturas resistentes a doenças. Superexpressão constitutiva de várias defensinas de plantas foi mostrado para aumentar a resistência a doenças nos testes de campo e estufa de culturas transgénicas6. É importante desvendar os mecanismos de ação (MOA) estes peptides antifúngicos para aproveitar totalmente o seu potencial como instrumentos eficazes de proteção de cultivos. No entanto, o MOA de defensinas estas plantas é mal compreendido. Evidência atual sugere que eles apresentam diferentes MOA5,6,7,8. Algumas defensinas atuam extracelularmente sobre fungos e alvo específico da parede celular/plasma membrana residente esfingolipídeos, romper a integridade da membrana e ativar vias de toxicidade celular9,10,11. Recentemente, no entanto, defensinas antifúngicas que translocar em células fúngicas foram descobertos12,13,14. Alguns destes defensinas ligam para bioativos fosfolipídios da membrana-residente, formam complexos oligoméricos e permeabilize membranas de plasma15,16,17. Assim, alguns aspectos do MOA de defensinas de plantas têm sido elucidados. No entanto, o MOA de planta defensinas prováveis envolve um conjunto complexo de eventos que ainda não foram identificados e integrados em um modelo abrangente. Em particular, ainda há uma importante lacuna em nossa compreensão dos alvos celulares destes peptides.

Com os recentes avanços em tecnologias de microscopia e o desenvolvimento de novas sondas fluorescentes, técnicas de imagem live-célula agora são frequentemente usadas para estudar o MOA de peptídeos antimicrobianos (AMPs). Estas técnicas complementam métodos amplamente utilizados como immunolocalization, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica ou tomografia computadorizada de raios-x18, que têm sido empregados principalmente para analisar os efeitos de peptídeos antifúngicos na morfologia e crescimento de células fúngicas, incluindo o estudo da integridade da parede celular, alterações nos padrões de crescimento/ramificação de célula, bem como a permeabilização da membrana plasmática e matando. No entanto, estes estudos foram limitados para células em um certo ponto do tempo de imagem após o tratamento com os peptídeos em vez de executar o lapso de tempo de imagens sobre as mesmas células para monitorar suas mudanças dinâmicas em resposta ao desafio de defensina. Nos últimos anos, uso de peptídeos fluorescente etiquetados em conjunto com células vivas de imagem utilizando microscopia confocal tem permitido a visualização em tempo real da dinâmica de interações de AMP – micróbio. Ambos naturalmente purificado e quimicamente sintetizados peptídeos antifúngicos podem ser marcados com etiquetas fluorescentes (por exemplo, DyLight, rodamina, BODIPY ou Alexa Fluor baseado corantes) e diretamente observado durante sua interação com células do lapso de tempo imagem latente da viver-pilha. A utilização destas rotulado peptídeos aumentou significativamente a nossa compreensão dos diferentes aspectos do seu MOA, incluindo o modo de entrada, Localização subcellular, tráfico intracelular e sítios de ação antifúngica dentro de células fúngicas vivas 18.

Recentemente, vários estudos têm mostrado que vários peptídeos antifúngicos incluindo planta defensinas são internalizados por viver células fúngicas12,14,19,20. O MOA destas defensinas prováveis envolve interação com alvos intracelulares. Recentemente informamos a ação antifúngica de uma planta defensina MtDef4 em dois fungos ascomicetes, Neurospora crassa e Fusarium graminearum. MtDef4 foi mostrado para usar caminhos diferentes para a entrada de célula fúngica e Localização subcellular nestes fungos14. Este estudo usado quimicamente sintetizado tetrametil rodamina (TAMRA)-rotulado MtDef4 em combinação com corantes fluorescentes vitais (tintura de membrana-permeant, SYTOX verde, a tintura de membrana seletiva, FM4-64; a tintura de repórter de morte celular, iodeto de propidium) e inibidores metabólicos. Essas análises demonstraram a cinética da internalização da MtDef4, seus mecanismos de transporte intracelular e seus alvos subcellular14.

Aqui, um protocolo para a imagem latente de viver-pilha usando microscopia confocal é apresentado. O protocolo utiliza péptidos fluorescente etiquetados em combinação com corantes fluorescentes vitais para estudar interações defensina-fungos vegetais, em particular, as vias de translocação e os alvos intracelulares de defensinas em células fúngicas.

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Protocolo

1. rotulagem de defensinas com Fluorophores

  1. Selecione um fluoróforo que tem efeito mínimo sobre as propriedades antimicrobianas, bem como a captação e a localização de defensina dentro da célula viva.
    Nota: Selecionar o fluoróforo ideal depende de objetivos experimentais específicos. Propriedades químicas e espectrais, fotoestabilidade, tamanho e carga do fluoróforo também devem ser consideradas.
  2. Etiqueta defensina com o fluoróforo selecionado usando um peptídeo adequado rotulagem kit disponível fornecedores comerciais. Alternativamente, quimicamente sintetiza defensinas fluoróforo-rotulados. Neste estudo, rotular MtDef5 defensina com DyLight550 usando uma rotulagem comercial kit de acordo com protocolo e tetrametil rodamina 6G do fabricante (TAMRA)-rotulado MtDef4 defensina foi quimicamente sintetizado comercialmente.
    Nota: É recomendável que peptídeos quimicamente sintetizado fluoróforo marcado (especialmente para peptides curtos de 50 aminoácidos ou menos) ser usado desde que o fluoróforo pode ser anexado ao resíduo N - ou C-terminal do peptide para assegurar o efeito mínimo na sua atividade antimicrobiana. Síntese de peptídeos longos com mais de três ligações de bissulfeto é um desafio. Neste caso, é recomendável esse peptídeo rotulados com um fluoróforo ideal usando um peptide comercialmente disponível adequado rotulagem kit.
  3. Teste em vitro da atividade antimicrobiana do defensina etiquetados e determinar a concentração inibitória mínima (CIM) contra os fungos que ser investigada.
    Nota: Neste estudo, o MIC de DyLight550-MtDef5 e TMR-MtDef4 foi determinado contra Neurospora crassa e Fusarium graminearum.

2. fungosas culturas e crescimento médio

  1. Transferência de conídios de uma cultura de estoque s. crassa para inclinar o tubo contendo ágar médio21 do Vogel e incubar a temperatura ambiente ao abrigo da luz por 5 dias.
  2. Cultura de F. graminearum PH-1 tensão nas placas contendo completa médio (CM)22 a 28 ° c durante 5 dias. Para a produção de conídios, inocular 4 plugues (10 mm de diâmetro) da cultura 5 dia de idade de F. graminearum PH-1 em 50 mL de meio de carboximetil celulose (CMC) (15 g carboximetilcelulose, 1 g de extrato de levedura, 0,5 g de MgSO4.7 H2O, 1 g de NH 4 Não há3e 1 g KH2PO4) e cultura para 4-7 dias a 28 ° c em um agitador rotativo a 180 rpm.

3. preparação da suspensão conidiais

  1. F. graminearum conidiais suspensão
    1. Vórtice da cultura líquida F. graminearum e coletamos conídios filtrando cultura fúngica de 1,5 mL através de duas camadas de material de filtragem (como Miracloth) em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL. Centrifugar a suspensão conidiais 13.226 x velocidade g numa microcentrifuga por 2 min.
    2. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de água estéril para lavar o sedimento.
    3. Centrifugar a suspensão conidiais 13.226 x velocidade g numa microcentrifuga de 2 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de 2 X SFM (meios sintéticos de fungos)23.
    4. Conte os conídios usando um hemocytometer sob um microscópio de luz.
    5. Ajuste a suspensão conidiais 105 conídios/mL com 2 X SFM.
  2. N. crassa conidiais suspensão
    1. Transferi uma pequena quantidade de crescente cultura (5 dia de idade) de s. crassa usando um loop de inoculação para um tubo de microcentrifugadora contendo 2 mL de meio líquido de Vogel.
    2. Levar a suspensão conidiais e filtrar através de material de filtragem em um novo tubo de microcentrifugadora.
    3. Centrifugar a suspensão conidiais velocidade máxima numa microcentrifuga de 2 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o conidiais em 1 mL de meio líquido de Vogel.
    4. Conte os conídios usando um hemocytometer sob um microscópio de luz.
    5. Ajuste a suspensão conidiais 105 conídios/mL com meio líquido de Vogel.

4. microscopia Confocal e preparação da amostra

  1. Localização subcellular de MtDef4 defensina em células fúngicas
    1. Pipete 50 µ l de cada suspensão conidiais (105 conídios/mL) para o teste de 10 mm de pratos de microplacas de fundo de vidro 35 mm. Para a observação de conídios, diretamente prosseguir para a próxima etapa, ou para a preparação de germlings, pipeta, 50 µ l de s. crassa e F. graminearum conídios para os pratos de cultura de 35mm e deixe germinar por 3-6 h à temperatura ambiente.
    2. Adicionar 50 µ l de defensina fluorescente etiquetadas no MIC para cada prato de microplacas e incube por 2,5 h. O microfone das defensinas rotulado de fluoróforo usados aqui (etapa 1.3) é de 3 µM para s. crassa e F. graminearum e o MIC de TMR-MtDef4 para s. crassa e F. graminearum foi 1 µM e 12 µM, respectivamente.
    3. Adicionar 2 µ l de membrana seletivo tingir FM4-64 (concentração final: 5 µM) na cultura do prato e incube por 30 min e montar imediatamente no microscópio confocal para a imagem latente.
    4. Selecione o laser de luz branca (WLL). Use o duas laser fontes 488 nm e 550 nm para excitar o corante TMR-MtDef4 e FM4-64, respectivamente. Detectar a fluorescência do TMR-MtDef4 580-700 nm e detectar FM4-64 tintura em 690-800 nm.
      Nota: Execute a microscopia confocal no quarto escuro.
  2. Imagem latente de lapso de tempo de interiorização de MtDef5 defensina
    1. Pipete 50 µ l de suspensão conidiais crassa s. e F. graminearum (105 conídios/mL) para 10mm de microplacas de pratos de microplacas de fundo de vidro 35 mm. O teste de 10mm é sem revestimento e tem um vidro de tampa n º 1.5 na parte inferior. Para a observação de conídios, proceda diretamente para a próxima etapa. Para a observação de germlings, incube conídios por 3-6 h à temperatura ambiente antes de prosseguir com a microscopia.
    2. Ligue o WLL. Selecione a linha de laser em 550 nm para excitar o fluoróforo-rotulado defensinas usadas aqui (etapa 1.3) e FM4-64 com 1,00% de intensidade e ativar os sensores correspondentes. As defensinas rotulado de fluoróforo usada aqui (etapa 1.3) foi detectada em 560-600 nm e o FM4-64dye foi detectada em 690-800 nm.
      Nota: Uso do laser de baixa intensidade para célula viva de imagem como intensidade de alta do laser pode causar danos às células fúngicas ao vivo.
    3. Monte o prato de microplacas no microscópio. Encontrar as células com 10 objetivos x inicialmente e, em seguida, ligue a x 100 / 1,44 objetivo de óleo para maior ampliação.
      Nota: Definir o modo de varredura para xyzt (combinação de Z-pilha e modos de lapso de tempo), posição Z, Zoom, frequência de captura de imagem, etc.
antes de prosseguir para a próxima etapa.
  • Adicionar 50 µ l das fluoróforo-rotulado defensinas usadas aqui (etapa 1.3) do MIC de 3 µM e 2 µ l de membrana seletivo corante FM4-64 (concentração final de 5 µM) para cada prato de microplacas e começar a imagem latente de lapso de tempo. Coloque pequenos pedaços de papéis de filtro molhados nos pratos de microplacas para evitar a evaporação. A frequência de captura de imagem foi 3 min 30 s e o período total foi de 2 h 30 min.
    Nota: Adicionar defensina e fluoróforo após prato de microplacas de montagem no microscópio pode desfocar a região de interesse. Portanto, após a adição de defensina e fluoróforo para o teste de, região de interesse precisa ser reorientada que pode causar atraso na aquisição de imagens.
  • Usar um microscópio confocal para a imagem latente confocal tudo e realizar a microscopia na temperatura de quarto em um quarto escuro.

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    Resultados

    Viver imagem latente da pilha foi realizado para acompanhar e comparar a internalização e Localização subcellular de dois defensinas, MtDef4 e MtDef5, de Medicago truncatula; em células fúngicas. TMR-MtDef4 foi sintetizado quimicamente enquanto MtDef5 foi rotulado com Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conídios foram incubados com qualquer defensina em combinação com o corante de membrana seletiva FM4-64. A Figura 1 mostra que a TMR-MtDef4 tem diferente...

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    Discussão

    Neste estudo, uma metodologia de viver-pilha confiável de imagens com o uso da fluorescente etiquetadas defensinas antifúngicas foi descrita para estudar a cinética da internalização destes peptides em células fúngicas e determinar os alvos subcellular. Este método é uma ferramenta poderosa para visualizar a dinâmica da interação entre defensinas e células fúngicas, temporal e espacialmente.

    Vários métodos têm sido usados para estudar a internalização e localização intracelular de defensinas d...

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    Divulgações

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Agradecimentos

    Agradecemos o Dr. R. Howard Berg, diretor do centro de microscopia integrado com o Donald Danforth Plant Science Center, para sua orientação e ajuda com microscopia confocal. Os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    FM4-64 DyeLife TechnologiesT13320
    DyLight 550 Kit de rotulagem de anticorposThermo Scientific84530
    Prato de micropoços com fundo de vidroTeKP35G-1.5-10-C
    Pano MiraEMD Millipore Corp475855-1R
    SP8-X microscópio confocalSoftware Leica
    ImageJFiJipara análise de imagem
    Imaris softwareBitplanepara análise de imagem

    Referências

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