Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Danos ao DNA leva ao aparecimento de lesões de DNA consistindo de ciclobutano de dímeros de pirimidina (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine e single-strand ou dobro-Costa quebra^1,2. Raios-γ são a forma de radiação ionizante, com a maior energia e alta penetrância, assim, esta fonte de radiação é amplamente utilizado em radioterapia³. Por outro lado, experimentalmente induzida por danos no DNA causados pela exposição aos raios UV imita lasers natural à luz UV. Microirradiation UVA, como um método microscópico, representa uma ferramenta experimental para estudar o dano de DNA em células vivas individuais. Microirradiation foi usado pela primeira vez há 40 anos a fim de revelar a organização do cromossomo regiões^4,5. Esta técnica é altamente dependente ou as propriedades funcionais dos microscópios confocal ou os limites técnicos da nanoscopy moderna. Para induzir lesões do DNA, as células podem ser presensitized por 5' bromodeoxyuridine (BrdU) ou Hoechst 33342 antes da irradiação UV. Bártová et al . ⁶ descrito anteriormente o passo presensitization, e recentemente nós aperfeiçoamos essa técnica de microirradiation para evitar a morte celular ou apoptose. Por exemplo, o uso de um laser UV de 405 nm (sem presensitization de Hoechst 33342) leva para a indução de 53BP1-positivo double-strand breaks (DSBs) em detrimento de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Por outro lado, passos presensitization combinados com UV microirradiation induzem a níveis muito elevados de CPDs e DSBs simultaneamente^7,8. Esta metodologia é difícil aplicar ao estudo de um único caminho de reparação do DNA.

Com microirradiation, é possível analisar o recrutamento de proteína, cinética e interação em lesões de DNA em células vivas. Um exemplo desse método foi publicado por Luijsterburg et al . ⁹ para 1 β proteína de heterocromatina e recentemente mostrou pela primeira vez que o fator de pluripotência Oct4 e uma proteína associada a corpos de Cajal, coilina, são recrutados para lesões de DNA induzida por UV^6,10. Cinética de proteína destas lesões de DNA também podem ser estudadas usando o FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento)^11,12,13 ou FRET (transferência de energia fluorescência ressonância) técnicas^{14 ,15}. Esses métodos têm o potencial para revelar a difusão simples de proteínas em lesões do ADN ou interações da proteína-proteína. Uma ferramenta útil para a caracterização adicional de proteínas é FLIM (Lifetime Imaging a microscopia de fluorescência) ou sua combinação com FRET tecnologia (FLIM-FRET)¹⁶. Estes métodos permitem o estudo dos processos de células que são estàvel vivas ou transitoriamente, expressando a proteína de interesse, marcado por uma molécula fluorescente¹⁷. Aqui, um exemplo de tempo de decaimento exponencial (τ) para proteína GFP-etiquetado p53 e seu parceiro de interação, mCherry-com a tag 53BP1, desempenhando um papel importante no DNA danos resposta^18,19 é mostrado. O parâmetro τ, o tempo de vida do fluorocromo fornecido pelos cálculos FLIM, é específico para uma tinta determinada fluorescência, suas habilidades de ligação e seu ambiente celular. Portanto, esse método pode nos mostrar distinções entre subpopulações de proteína, suas habilidades de vinculação e suas propriedades funcionais após, por exemplo, danos ao DNA.

Aqui, um resumo das abordagens metodológicas das técnicas de microscopia avançada que é usado em nosso laboratório para estudar o recrutamento de tempo específico de proteína, cinética, difusão e interações da proteína-proteína no site da cromatina de microirradiated é apresentado. A metodologia passo a passo para a indução de lesões locais do DNA em células vivas e uma descrição das metodologias úteis para estudos de DNA danos relacionadas a eventos em lesões de DNA localmente induzidas causadas por lasers UV são fornecidos.

1. cultivo de linhagens celulares

1. linhas de células HeLa-derivado
   Nota: células de carcinoma cervical uso HeLa: ou células HeLa estàvel expressando histona H2B marcados com células GFP ou HeLa-Fucci expressando RFP-Cdt1 no G1 e primeiras fases de S e GFP-geminin nas fases S/G2-M ( Figura 1).
   1. Para o cultivo de todas as linhas de célula HeLa-derivado, use Dulbecco ' s modificado águia ' s suplementado (DMEM) com 10% de soro fetal bovino e antibióticos apropriados a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂. Substituir o meio 2 - 3 vezes por semana.
   2. Remover o meio de cultura e lave as células usando 1X PBS para eliminar todos os vestígios de soro que contém inibidor de tripsina. Execute esta etapa em uma capa de risco biológico em temperatura ambiente.
   3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA escaldada para cobrir a camada de células e manter as células em células de Trypsinize 37 ° C. até a camada de células é dispersada (geralmente 3-5 min).
   4. Adicionar 3 mL de meio de cultura completo escaldadas para inactivar Trypsin-EDTA e dispersar o meio pipetando suavemente várias vezes.
      Nota: Este procedimento deve ser realizado em uma capa de risco biológico para proteger o operador contra contaminantes e manter condições de cultivo celular ideal.
   5. Contagem de células usando um contador automático de célula ou câmara Bürker. Dilua a suspensão de células para 1 × 10 ⁵ células/mL e pipetar 5 mL para uma nova placa. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂.
2. Cultivo de rato células-tronco embrionárias (mESCs), linha de célula D3
   1. mESCs de cultura celular cultura pratos revestidos com meio de manutenção de gelatina e mESC de 0,2%. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂.
      Nota: Recomenda-se preparando o meio de cultivo e manutenção de mESCs em alíquotas de 50 mL e armazená-lo em 2-8 ° C por até 2 semanas. O mESC médio contém 75 mL ES célula FBS, 5 mL de penicilina G e estreptomicina, 5ml Non-aminoácidos essenciais (10 mM) (concentração final 0.1 mM), 50 µ l de rato fator inibidor de leucemia (mLIF; 100 µ g/mL) (concentração final de 10 ng/mL), 430 µ l MTG (1- Thioglycerol; diluição de 1: 100 em DMEM) (concentração final de 100 µM) e glicose alta DMEM médio até 500 mL.
   2. Aspire o meio de cultivo mESC do prato cultura e enxágue as células uma vez com PBS 1x.
   3. Adicionar 0,5 mL do Trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C, até que as células começam a se separar do prato. Em seguida, desativar a tripsina lavando as células com 2 mL de meio de cultivo mESC suplementado com 15% de soro fetal bovino.
   4. Usar uma pipeta para desalojar as células restantes do prato cultura.
      Nota: É importante obter células únicas, porque aglomerados de células promovem a diferenciação das células.
   5. Dividir células 01:10 em pratos gelatinizados com meio de manutenção do mESC.
      Nota: Se a densidade de células mESC é muito baixa, não crescem bem; se a densidade é muito alta, a diferenciação é promovida.
   6. , Certifique-se de que mESCs são mantidos em um estado indiferenciado, realizando a passagem de mESC cada segundo dia dividindo as células de uma placa de Petri em quatro novos pratos. Inspecionar as colônias mESC com um microscópio invertido sob 100 X ou 200 X de ampliação e, se houver evidência de mES espontânea a diferenciação celular, realizar borrões ocidentais para avaliar a depleção de proteínas Oct4.
      Nota: Com passagem de célula ideal, diferenciação espontânea de mESCs em vitro pode ser reduzida.

2. Transfecção de células

1. semente células 48 h antes de experiências em pratos de microscopia quadriculado (diâmetro 35mm) a fim de encontrar o microirradiated células de acordo com suas coordenadas sobre o prato de Petri.
   Nota: Este é um exemplo em que microirradiation é o primeiro passo experimental e imunocoloração é o segundo ( Figura 2A).
   1. Para semeadura, usar uma concentração de 5 × 10 ⁴ células/mL para linhas de células HeLa-derivado (ou 1 × 10 ⁴ células/mL para D3 mES células). Usam até meio completo de 2 mL por prato. Durante o cultivo e microirradiation, manter as células em uma câmara de termostato ou cultivo em 37 ° C e 5% de CO ₂.
   2. Contagem de células usando um contador automático célula.
      Nota: Não utilize uma concentração maior de células. Especialmente no caso de colónias densamente de mESCs D3, densidade de pilha alta impede que uma identificação de células de microirradiated localmente após immunostaining.
2. Preparar o reagente de DNA e a transfeccao Plasmideo de escolha como segue. Preparar a solução A usar 2-3 µ g do ADN do plasmídeo selecionado (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes) e 150 µ l 1X PBS. Prepare a Solução B usando o reagente de transfeccao 3,5 µ l em PBS de 1 × 150 µ l. Certifique-se de que cada solução é bem mixada por pipetagem cuidadosa.
   Nota: A proporção ideal do DNA e do transfection reagente deve ser empiricamente determinada para cada linha celular e plasmídeo individual.
Células
3. em 24 h antes da observação experimental de viver transitoriamente transfectada, combinar a solução A e B de solução sem utilização do vortex. Incube as soluções combinadas à temperatura ambiente por 15-20 min. Em forma de gota a gota, dispersar homogeneamente isso completar a mistura de transfeccao (300 µ l, como descrito no ponto 2.2) sobre a camada de células crescendo no prato microscopia.
4. Células de incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ para 4-6 h, em seguida, substituir a mistura de transfeccao com meio fresco. Cultivar as células em condições padrão.
   Nota: Quando se utiliza um laser 405 nm, não presensitize as células com qualquer reagente, mas quando se utiliza um laser de 355 nm, realizar presensitization de celular com 10 µM 5-bromo-2 ' - deoxy - uridina (BrdU) ^{7 , 8} . Presensitization tempo depende do tipo de célula e a duração do ciclo celular. Para as células HeLa, adicione BrdU 16 a 20 h antes microirradiation local. No caso de mESCs, adicionar BrdU 6 a 8 h antes microirradiation.

3. Indução de lesões locais do DNA e microscopia Confocal

1. Coloque o prato no palco microscópio e gravar a posição das células selecionadas no prato; as coordenadas da célula serão necessária para posterior análise ( Figura 2A a-c).
2. Encontrar células transfectadas em um quadrado marcado com um número ou letra ( Figura 2A d-f, setas no show de Ad a localização da célula ampliada em painéis Ae e Af). Obter uma imagem das células usando microscopia de campo claro e adquirir uma imagem de fluorescência para identificar a posição de ambas as células e a Praça rotulada ( Figura 2A).
3. Para aquisição de imagem antes da irradiação, usar um laser de luz branca (WLL) (470-670 nm em incrementos de 1 nm) conectado ao microscópio confocal (ou outro laser disponível conectado para o confmicroscópio ocal).
4. Use as seguintes configurações: 512 × 512 pixels resolução, pixel tamanho 64 nm, 400 Hz, modo bidirecional (digitalização em dois sentidos), linha médio definido como 8, zoom 8 x 12 x.
   Nota: Média de linha representa um determinado número de exames; a mesma linha é verificada várias vezes antes de continuar para a próxima linha. Repetidos exames de todas as linhas produzem o quadro final da imagem.
5. Para a observação de imagem e aquisição, use um objectivo de óleo 63 × com uma abertura numérica de 1.4 e sequencialmente adquirir imagens de fluorescência. Eliminar a Cruz-conversa entre os dois fluorochromes usando o modo de varredura sequencial do software apropriado.
   Nota: Todos os softwares de microscópio permite a configuração de um modo chamado de varredura sequencial. O operador pode selecionar se deseja adquirir os fluorochromes ' informações simultaneamente (por exemplo, na fluorescência vermelho-verde-azul) ou, como mencionado aqui, individualmente (sequencialmente), fluorocromo pelo fluorocromo. Levar em conta a informação geral que a excitação/emissão máxima de GFP é 395/509 nm e a excitação/emissão máxima para mCherry é 587/610 nm (ver fluorochromes usados aqui na Figura 2B). Com base nessas informações, selecione excitação adequada e filtros de emissão para os desejado fluorochromes. Seleção de filtro e verificação de procedimentos devem ser otimizados para cada microscópio confocal.
6. Para indução de lesões do ADN, uso 64 linha digitalização modo, desligue o WLL (em ' aquisição ' modo), ligue a fonte externa de UV (na " laser UV " botão), definir a região de interesse (ROI) (em ' aquisição ' modo) e defina o 355 nm do laser para 100% de energia ou, alternativamente, usar uma fonte de laser 405 nm.
   Nota: Geralmente, a potência do laser é ajustada pelo botão de ajustamento adequado do laser no modo de aquisição de imagem.
7. Para microirradiation local, usam lasers que emitem no espectro UVA próximo. Para microirradiation de ROI no núcleo e para captura de imagem, definir o plano de fundo a zero no modo de aquisição de imagem para regular a intensidade do laser fora o ROI; se a célula é irradiada corretamente, o sinal de GFP-histona H2B irá desaparecer, e, por exemplo, proteína PCNA mCherry-marcados será recrutada para lesões do ADN imediatamente após a irradiação ( Figura 2B e Video 1 ).
   Nota: Uma lesão do DNA induzida no ROI de uma seção confocal também aparece em três dimensões (3D) projeção (ver rotação 3D e o x-y, x-z, projeções de y-z na Figura 2 e vídeo 2). Para obter descrições dos parâmetros técnicos completos para 355 nm e 405 nm laser, ver Stixová et al ⁷
8. após o ROI tem sido irradiado, desligue a fonte externa de UV, desligue o ROI, ligue o WLL, mudar a linha de exploração para 8 e encontrar outra célula para irradiação. Para a seleção de ROI, use o botão aplicável no software ' o modo de aquisição de imagem de s.
   Nota: mCherry-PCNA tem um pico de máxima acumulação em lesões de DNA entre 2 e 20 min ( Figura 2B). Para verificar o resultado em níveis de proteína exógena, prossiga com a mancha imediatamente após microirradiation local. Selecione o intervalo de tempo de irradiação de acordo com o interesse.
9. Verificar que um acúmulo de proteínas exógenas pode ser detectado na maioria das células microirradiated. Para esta verificação, utilize os critérios nas etapas a seguir.
   1. Verificar que não há nenhum superexpressão da proteína exógena em células transfectadas transitoriamente. Como uma possível solução, escolha células com apenas uma fraca expressão da proteína fluorescente (por exemplo, PCNA-mCherry ou mCherry-53BP1).
   2. Avaliar a fototoxicidade da exposição WLL usada para aquisição de imagens.
      Nota: Para teste de fototoxicidade, expor células transfectadas para microirradiation prolongada do laser e verificar que as células proceder à mitose, como mostrado na Figura 3A -B. Como uma solução possível, reduzir a varredura tempo e número de fatias confocal por célula, otimizar a digitalização 3D pela seleção do passo axial ideal (0,3 µm é recomendado) e definir o laser ' poder de s no seu mínimo. Alternativamente, fototoxicidade pode ser eliminada usando Trolox (ácido 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic, um análogo hidrossolúvel de vitamina E) dissolvido no meio de cultivo. Para experimentos de DNA danos relacionadas, não se recomenda usar de Trolox devido a seu efeito protetor contra a radiação UV.
   3. No caso de irradiação com um laser de 355 nm, verificar suficiente incorporação de BrdU usando um anticorpo de deteção de BrdU apropriado da incorporação BrdU kit (veja a Tabela de materiais). Desde BrdU de DNA é incorporado durante a fase S do ciclo celular, a maioria das células deve prosseguir através de fase S durante presensitization. Como uma solução possível, considere o comprimento do ciclo celular, que é o tipo de célula específica.
   4. Analisar se o DNA reparar proteínas de interesse têm a capacidade de reconhecer as lesões de DNA no ciclo celular específico phase(s). Uma solução possível: Para verificar que o recrutamento de proteínas selecionados às lesões do ADN é restrito às fases do ciclo celular específico (S/G1/G2), use as células HeLa-Fucci. Estas células expressam RFP-Cdt1 no G1 e primeiras fases de S e GFP-etiquetado geminin no S/G2-M ciclo celular fases ²² ( Figura 1).
   5. Para evitar a apoptose, morte celular, selecione uma fonte de laser apropriado e laser poder configuração ²³. Tenha em mente que irradiados células deverá proceder à mitose ( Figura 3A -B, vídeo 3).
      Nota: Apoptose indesejada pode ser detectado por anexina V positividade, caspase 3 ou lamina clivagem B. No nível morfológico, desprendimento de células e formação de corpos apoptotic será visível.

4. Coloração de imunofluorescência

1. lavar a camada de células (crescendo em pratos de microscópio) brevemente com 1 × PBS e após o enxágue, corrigir células usando formol 4% por 10 min. (para linhas de células HeLa-derivado) ou 20 min (para células D3 ES) à temperatura ambiente. Enxagúe o prato com 1 × PBS.
   Atenção: Formol causa danos oculares graves, pode causar uma reação alérgica de pele e é também um potencial cancerígeno; assim, todas as etapas experimentais com formol devem ser executadas em um exaustor.
   Nota: Para evitar o branqueamento desnecessária de sinais de fluorescência, guarde o prato em uma câmara escura durante o tempo de incubação necessário para a mancha da imunofluorescência.
2. Permeabilize células com 0,1% Triton X-100 dissolvido em H ₂ O para 8 min e em seguida, Incube as celulas por 12 min com 1 × PBS contendo saponina de 0,1% e 0,1% Triton X-100. Após a incubação, lavar as células em 1 × PBS em dois tempos de 15 min.
3. Células de incubar com 1% de BSA em 1 × PBS para 60 min para bloquear ligação inespecífica de anticorpos selecionados. Lavar as células em 1 × PBS durante 15 minutos após incubação.
Anticorpo primário
4. dilua na proporção de 1: 100 (ou 1: 200) (este passo deve ser optimized para detecção de anticorpos individuais) em 1% BSA em 1 × PBS, usando 25 µ l desta solução por prato e cobrir as células com uma lamela. Incubar as células com a solução contendo o anticorpo primário em uma câmara umidificado durante a noite a 4 ° C.
5. No dia seguinte, lavar as células em 1 × PBS duas vezes por 5 min.
6. Diluir o anticorpo secundário na proporção de 1: 100 (ou em alternativa 1: 200) em BSA 1% em 1 × PBS, usando 100 µ l desta solução por prato e cobrir as células com uma lamela. Incube as células com a solução contendo o anticorpo secundário por 60 min. Após a incubação, lavar as células em 1 × PBS três vezes por 5 min.
7. Montar a lamela com uma gota de meio de montagem e selar a lamínula com esmalte ou a cola para evitar a secagem e movimento durante a observação microscópica. Armazene o prato no escuro a 4 ° C.

5. Microscopia de fluorescência vida imagem (FLIM)

1. iniciar o FLIME. Aberto o " Suite de aplicação " do software e mudá-lo para o " FLIM " modo. Certifique-se de que o WLL está operando no modo pulsado.
   Nota: O operador deve alternar um botão de hardware para chegar ao modo pulso.
2. Colocar a cápsula contendo as células coradas (manchadas na secção 4) no palco microscópio na mesma orientação como durante microirradiation local e encontrar as células irradiadas de acordo com as grades sobre o prato de Petri. Realizar a aquisição da imagem pelo microscópio confocal.
   Nota: Use as seguintes configurações: modo bidirecional de 400 Hz, 1024 × 1024 pixels, 16 linhas, zoom 8 x 12 x.
3. Antes de iniciar a medição de FLIM, executar um teste preliminar para mostrar um registro em tempo real de decaimento exponencial, clicando no " Setup FLIM " e " aquisição " e pressionando " teste executar FLIM ". Otimize os parâmetros FLIM para a amostra, avaliando os dois principais parâmetros como segue.
   1. Otimizar a taxa de repetência do WLL com comprimento de onda de excitação sintonizada com o tempo de vida da amostra (ver nota abaixo). No software do microscópio confocal, ajustar a intensidade do laser com o botão apropriado, que é chamado geralmente " o ajuste a laser " na ' aquisição de imagem ' menu. Em seguida, calcular uma decadência curva (ou histograma mostrando todas as contagens de fótons) usando o software FLIM (ver Figura 4A -B).
      Nota: Utilize o WLL em modo de pulso de excitação. O software deve ser equipado com um seletor de pulso para WLL, que permite a seleção da taxa de repetição (80, 40, 20 ou 10 MHz). O comprimento de onda de excitação no caso do doador de fluorescência, as boas práticas agrícolas, é de 488 nm. A curva de decaimento é gravada usando o espaço de trabalho do software FLIM. O parâmetro (τ _D, τ _DA) mostra tempos de decaimento exponencial (por exemplo, tempo de vida fluorocromo); parâmetro (A) representa a amplitude de decaimento fluorocromo (ver exemplos de dados FLIM GFP-etiquetado p53 e 53BP1 mCherry-marcados na Figura 4A -B).
   2. Verificar a taxa de repetição de contagem usando a ferramenta de aquisição de software (modo de taxa de repetição selecionar). Selecionar os pixels mais brilhantes na amostra; a curva para o pixel mais brilhante deve ser inferior a 10% da intensidade da fluorescência geral.
4. Clique em " medida " e pressione " executar FLIM ".

6. doador de vida usando um Script de FLIM e cálculo do FRET eficiência

1. iniciar o software FRET-FLIM e abra o ' doador ' espaço de trabalho.
2. Selecione o " análise " / " Imaging " tab no menu e iniciar o script FLIM clicando " começar a ". Para configurações ideais FRET-FLIM, use parceiros conhecidos de proteína interagindo.
   Nota: A eficiência de FLIM-FRET para interagir conhecido parceiros GFP-p53 e mCherry-53BP1 era (34,1 ± 2,3) % ( Figura 4).
3. Usar somente o canal de emissão do doador (canal 1 ou 2) e pressione " calcular rapidamente FLIM ".
   Nota: A imagem e o gráfico serão ambos atualizados.
4. Software em the FRET-FLIM, definir a escala de intensidade (0 - 4000 contagens) e a escala de tempo de vida (0 - 5 ns) manualmente no software. Com esta abordagem, Visualizar a célula de interesse e definir a medição FRET-FLIM.
   Nota: Esta configuração elimina as diferenças na intensidade de fluorescência entre células individuais em uma população celular.
5. Sob a forma de decadência, escolher o modelo de encaixe.
   Nota: Recomendamos reconvolution n-exponencial e seleção do parâmetro de modelo " n ". Um ajuste ideal tem os seguintes critérios: o cabido curva sobreposições bem a curva de decaimento e o χ ² - valor é igual a 1 ( Figura 4B).
6. Selecione o " limiar " / " limite de uso " e definir o limite de 75. Iniciar " inicial Fit ".
   Nota: O software SPT64 calcula o tempo de vida médio dos doadores na ausência de FRET (" vida média ponderada de Amplitude ", τ _Av.Amp)

7. Eficiência FRET usando o Script de FLIM-FRET

1. Selecione o espaço de trabalho do doador/aceitador e abra " análise " | " Imaging " | " imagem vida FRET ".
2. , Selecione apenas o doador como o canal ativo e ajustar Pixel Binning dependendo o número de fótons/pixel. Em seguida, execute o modo de software chamado " calcular FastFLIM ". Se o número de fótons/pixel na imagem é baixa, aumente o Pixel Binning 4 pontos de.
3. Definir a intensidade de 0 - 200 contagens e o tempo de vida de 0 - 5 ns.
4. Ativar " limite de uso " e digite um limite de 75.
5. Definir o modelo de encaixe " Multi-exp. doador ", digite o parâmetro de modelo " n ", digite τ _Av.Amp (etapa 6.6) como um τ _D e ativar " ajuste inicial ".
6. Definir os parâmetros de Bkgr _Dec, Shift _IRF e _IRF para valores constantes, removendo a marca de Bkgr.
   Nota: Defina a maioria dos parâmetros para permanecer constante, tanto quanto possível. Esta abordagem reduz flutuações estatísticas. Neste caso, não pressione " inicial de ajuste " novamente. Descrições dos parâmetros mencionados a seguir: IRF = função de resposta do instrumento, BkgrDec = fundo de ajuste exponencial, ShiftIRF = mudança IRF de exponencial reconvolution caber, BkgrIRF = fundo IRF de exponencial reconvolution caber. Todos os três parâmetros são calculados e pode ser corrigidos usando o software para posterior análise.
7. Imprensa " FRETŔ calcular um traste imagem (plotada na área de imagem FLIM) FRET histograma de eficiência são calculados e um histograma de distância do traste é plotado ( Figura 4). Terminada a análise de imagem, pressione " resultado salvar ".
   Nota: Durante os experimentos de traste, é necessário considerar que proteínas fluorescentes exibem transições reversíveis entre fluorescente (brilhante) e Estados não-fluorescente (escuro). Esta característica é chamada " piscando ", e eficiência FRET é afectada por este fenômeno (uma explicação deste efeito foi fornecida por Vogerl et al. ²⁴).

8. FRAP análise

1. lugar a dish no palco do microscópio, encontrar as células transfectadas expressando a proteína fluorescente etiquetada de interesse e executar a aquisição de imagens usando microscopia de campo claro com a lâmpada do microscópio padrão (ver Figura 2Aa-b) e modos de microscopia de fluorescência.
   1. Para aquisição de imagem, use o laser de luz branca (WLL) conectado ao microscópio confocal (ou um laser de escolha, de acordo com o fluorocromo selecionado). Use as seguintes configurações: 512 × 512 pixels, 1000 Hz, modalidade bidirecional da, média da linha 1, zoom 8 x 12 x.
   2. Adquirir pelo menos 15 imagens prebleaching (a potência do laser de ~ 10%) e definir a região de interesse (ROI) no menu de aquisição de imagem.
2. Para experimentos de fotobranqueamento, usar um laser de argônio (488 nm). Aplique as seguintes configurações: quadro resolução 512 × 512 pixels, 1000 Hz, modo bidirecional, zoom 8 x 10 x.
   Nota: Fluorochromes incluindo as boas práticas agrícolas, mCherry e RFP podem ser excitados por um laser de argônio trabalhando em 488 nm ou 514 nm.
3. Use o modo software FRAP do microscópio de escolha. Durante o fotobranqueamento, definir o laser de argônio ' poder máximo usando o botão de ajuste do laser. Realizar a aquisição de imagens a intervalos 0,256 s, a potência do laser de 10%.
   Nota: Para postbleaching passos, use o modo de aquisição de imagem padrão do microscópio confocal de escolha. Tempo de recuperação
   1. fluorescência monitor após fotobranqueamento (até 45-50 s após o procedimento de clareamento).
      Nota: Como mostrado na Figura 4, o tempo de recuperação após fotobranqueamento para 53BP1 de mCherry-tag é distinto em lesões de DNA espontâneas e focos de irradiação UVA-induzido. mCherry-53BP1 em lesões UVA recuperou-se rapidamente em comparação com acumulações de mCherry-53BP1 em ocorrendo espontaneamente DNA reparar focos; Ver Figura 4 e Foltankova et al. ²⁵
4. exportar os dados do microscópio software (ou software de escolha) para uma planilha e realizar análise estatística.

Utilizando microscopia confocal avançada, observamos um acúmulo de proteínas 53BP1 e mCherry-PCNA mCherry-etiquetadas em lesões do ADN. As análises foram realizadas por microirradiation local de células vivas. Para reconhecer os padrões de distribuição nuclear de proteínas DNA-reparação-relacionados em fases individuais de ciclo celular, usamos o sistema celular Fucci, pelo qual é possível determinar o G1, S precoce, e G2 fases da célula ciclo (Figura 1). A aplicação biológica do modelo celular Fucci que publicamos em Suchankova et al . 26 mostra que 53BP1 foi recrutado para lesões localmente induzidas do ADN nas fases G1, S e G2 do ciclo celular, que foi associado com a função desta proteína durante final não-homóloga ingressar (NHEJ), um dos principais mecanismos levando a reparação de ruptura da dobro-costa. Por outro lado, este sistema experimental mostrou-na nível celular individual que a proteína, PCNA, que está ligada da via de reparo de recombinação homóloga (HRR), reconhece DSBs nas fases tardias, S e G2 do ciclo celular 27. Para estudos sobre a maquinaria de reparo do DNA, nós aperfeiçoamos também condições de irradiação a fim de assegurar que as culturas de células continuaram submeter-se a mitose após a exposição ao laser UV (Figura 3). Células Microirradiated, passando por mitose provam que, nestas condições experimentais, receitas de reparação DNA de forma relativamente fisiológica e células não foram feridas pelos lasers, que em intensidades mais elevadas, induzir a apoptose. Aqui, mostramos também como aplicar a análise FLIM-FRET para a caracterização das proteínas de reparo do DNA. Esta tecnologia avançada permite-nos estudar as interações da proteína-proteína local no núcleo celular ou, alternativamente, interações proteína nucleolar regiões como o nucléolo, lâmina nuclear ou aglomerados de heterocromatina. Para iniciantes nesta tecnologia, nós gostaríamos de recomendar otimizando essa técnica FRET-FLIM usando parceiros de proteína interagindo bem conhecido como p53 e 53BP1 (Figura 4A-C). Em geral, um conhecimento da interação da proteína-proteína leva a compreender como complexos de proteínas regulam processos como replicação, ativação do gene, silenciar ou reparação do DNA. Além disso, uma ferramenta muito útil para estudos de cinética de proteína é o método FRAP, que mostra as características de difusão local proteína e mobilidade (Figura 4). Tomados em conjunto, aqui nós fornecemos instruções metodológicas para aplicação de técnicas avançadas de microscopia confocal no DNA estudos de reparação.

Figura 1: formação de focos de reparo do DNA pode ser estudada em células HeLa-Fucci expressando RFP-cdt1 (vermelho) no G1/início S fases e GFP-geminin (verde) nas fases do ciclo celular G2/S. Lesões de DNA ocorre espontaneamente positivas para proteína 53BP1 (azul; Coloração de Alexa 405), foram estudados no G1 (vermelho), início S (laranja; expressão de RFP-cdt1 e GFP-geminin) e G2 (verde) as fases do ciclo celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: recrutamento de mCherry-tag PCNA em lesões do DNA ao longo do tempo. (A) células expressando mCherry-PCNA (vermelho), foram localizados em um prato de microscópio quadriculado em regiões selecionadas (cinza). Após a fixação e imunocoloração, células irradiadas (setas amarelas) estavam localizadas de acordo com coordenadas registradas (veja a carta cinza K como exemplo) (Aa-c). O quadro amarelo e setas (Ad) mostram a célula que foi ampliada em painéis Ae-f e microirradiated. (B) acumulação de mCherry-PCNA (vermelho) foi estudada em células HeLa estàvel expressando GFP-etiquetado histona H2B (verde). As células foram monitorizadas imediatamente após microirradiation local para até 35 min (ver vídeo 1). (C) Microirradiated células foram analisadas por microscopia confocal 3D e acúmulo de proteínas em lesões de DNA (por exemplo, mCherry-53BP1) foi encontrado em todas as três dimensões (x-y, - z, x e y-z), embora apenas no estômago do núcleo celular foi microirradiated (ver rotação 3D-célula em projeções em 3D Video 2 na Figura 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: células microirradiated por um díodo laser 405 nm prosseguir normalmente através do ciclo celular. (A) após a irradiação usando um laser de diodo de 405 nm, células HeLa (estàvel expressando GFP-histona H2B; verde) passam por mitose (Veja também o vídeo 2). Quadros e setas amarelas indicam ROI irradiado em células selecionadas. Quadros brancos show de mitose. (B) sob as mesmas condições experimentais, mitose em células irradiadas também foi observado por microscopia de lapso de tempo em células HeLa estàvel expressando GFP-H2B (verde) e transitoriamente, expressando mCherry-PCNA (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: análise FLIM e FRET-FLIM de GFP-p53 e mCherry-53BP1. Fluorescência ressonância energia transferência (FRET) detectado pelo FLIM e aplicativo de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento(FRAP) em várias lesões de DNA. ( A-C) Em média (n = 10) vidas úteis de GFP-etiquetado p53 na ausência e presença do aceitador (mCherry-53BP1), medido em toda nonreplicating núcleos de células HeLa. (A) curvas de decaimento de fluorescência representativa e resíduos estudaram em células HeLa, transitoriamente, expressando GFP-p53 (somente doador, τD) ou GFP-p53 e mCherry-53BP1 (doador-aceitador, τDA). (B) média amplitudes (A1 -3) de (um) GFP-p53 e (b) mCherry-53BP1 e vida útil (τ1 τ -3) medido em núcleos de células HeLa. Valores χ2 também foram calculados e são mostrados. (C) Resumo de FRET eficiência para os parceiros de interação conhecidos GFP-p53 e mCherry-53BP1. Escala de barras = 4-5 µm. FRET-FLIM resultado apresentando ~ 35% FRET eficiência interagindo bem conhecido parceiros GFP-etiquetado p53 e 53BP1 de mCherry-tag. (D) Cinética de recuperação de mCherry-53BP1 estudou em lesões de DNA ocorre espontaneamente (curva verde) e lesões de DNA induzida pela UVA (curva azul). mCherry em lesões de DNA foi descorado ao nível do plano de fundo (forma dispersa da proteína da proteína de mCherry-53BP1), e a fluorescência de fundo foi subtraída de cada valor. DATA, mostrado como a intensidade de fluorescência relativo de mCherry-53BP1, são apresentadas como meios ± erro padrão. O teste t de Student revelou uma diferença estatisticamente significativa entre os dois tipos de lesões do ADN (* mostra p ≤0.05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1: recrutamento de mCherry-tag PCNA proteína (fluorescência vermelha) para lesões do ADN induzido por microirradiation local em HeLa células estàvel expressando GFP-etiquetado histona H2B (fluorescência verde). Clique aqui para baixar este vídeo.

Video 2: acumulação de 53BP1 de mCherry-tag proteína (fluorescência vermelha) em lesões do ADN induzido por microirradiation local em células HeLa. O núcleo da célula é mostrado no espaço 3D usando um modo de software que permite a visualização de rotação de célula no espaço. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Microirradiated HeLa células estàvel expressando GFP-etiquetado histona H2B (verde fluorescência) prosseguir através de mitose. A região irradiada é caracterizada pelo esgotamento de GFP-H2B (regiões negras são irradiadas tiras dentro do núcleo de células). Clique aqui para baixar este vídeo.

Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.