Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.
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Artigo de método
Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias
Neste artigo
Resumo
Resumo
A presença de quimerismo incompleta é observada em uma grande proporção de pacientes após transplante de medula óssea para a talassemia major ou doença falciforme. Esta observação tem implicações tremendas, como estratégias de imunomodulação terapêutica subsequente podem melhorar os resultados clínicos. Convencionalmente, a análise baseada em reação em cadeia da polimerase de repetições curtas em tandem é usada para identificar o quimerismo em células de sangue de doadores-derivado. No entanto, esse método é restrito às células nucleadas e não conseguem distinguir entre linhagens de célula única dissociadas. Aplicamos a análise das repetições curtas em tandem para fluxo de células progenitoras hematopoiéticas cytometric-classificados e comparou-o com a análise de repetições curtas em tandem de unidades formadoras de estouro selecionada - eritroide colônias, ambos coletados do osso medula. Com este método... somos capazes de demonstrar as diferente proliferação e diferenciação das células do doador no compartimento eritroide. Esta técnica é elegível para completar o monitoramento atual de quimerismo em definindo o transplante de células estaminais e, portanto, pode ser aplicados estudos clínicos no futuro, investigação em células estaminais e design dos julgamentos de terapia de gene.
Introdução
Transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) é a abordagem curativa disponível apenas para uma variedade de desordens genéticas inatas do sistema hematopoiético, conseguindo taxas de sobrevida livre de doença de mais de 90% para outra forma altamente comprometida e vida útil limitada pacientes1. A eficácia desta importante ferramenta terapêutica foi otimizada ao limitar a toxicidade de pré- e pós-transplante de regimes2, mas também por intervenções destinadas a sustentar a função estável do enxerto, que é quantificada pelo acompanhamento atento da células de doador-derivado de4
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Protocolo
1. isolamento de medula óssea células hematopoiéticas classificando multiparâmetro fluorescência-ativado celular
- amostra de coloração
- antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparado:
- mídia de gradiente para a preparação de mononucleares células tubos (GM), 50 mL cônica
- 12 x 75 mm tubos de fluxo para coloração de células
- coloração tampão: tampão fosfato salino (PBS) + 3% de soro de vitela fetal (FCS)
- pipetas < / l Eu >
- FC bloco e coloração anticorpos (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Com esta combinação de fluorocromo há repercussões insignifica....
- antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparado:
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Resultados
Separação dos progenitores lymphohematopoietic classificando FACS celular
Demonstramos aqui os resultados da classificação as populações de células necessárias para a análise de STR a jusante. Células da medula óssea foram coradas com V450-conjugado anti-CD45, anti-CD36 conjugado FITC e APC-conjugado anti-CD34. A população de interesse é as megacariócito eritroide progenitores (MEP), nucleated as células respons.......
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Discussão
O objetivo do estudo atual é fornecer ao público uma combinação das duas abordagens para analisar quimerismo doador/beneficiário em eritroide progenitores após TCTH em pacientes tratados para hemoglobinopatias: 1.) classificação de fluorescência-ativado da pilha de células progenitoras hematopoiéticas em amostras de medula óssea, seguidas de análise de repetições curtas em tandem e 2.) unidade formadoras de cultivo de células de medula óssea, a classificação das colônias em vários tipos de progenitor seguido de análise d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remover hemácias |
| Tubos cônicos de 50 mL | Falcon | 14-432-22 | Preparação de amostras |
| Tubos de fluxo de 12 x 75 mm | Falcon | 352002 | Classificação FACS |
| Solução salina tamponada com fosfato | Gibco | 10010023 | PBS |
| Soro fetal para bezerros | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (inativado por calor) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocitômetro | Invitrogen Inc. | C10227 | Contagem automática de células |
| Hank' s Solução salina balanceada | Gibco | 14025092 | Tampão de suspensão na análise FACS |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Componente do tampão de suspensão |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Bloco FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinante eritropoietina humana | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove» s Dulbecco modificado ' s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030-081 | Componente do Meio de Cultura |
| CD34+ contas magnéticas | Milteny Biotech | 130-046-702 | Purificação CD34+ |
| Recombinante humano G-CSF Gibco | PHC2031 | CFU-Assay | |
| Recombinante humano SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinante humano GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinante humano IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinante humano IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Kit de extração de sangue | Qiagen | 51306 | Isolamento de DNA |
| Nanodrop ND-1000 fotômetro de espectros | Thermo Scientific | ND 1000 | Quantificação de DNA Livre |
| de DNAase H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | Preparação de DNA |
| AmplTaq Gold DNA Polimerase | Biociência Aplicada | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradiente Eppendorf | 6321000019 | PCR | |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Tamanho Padrão | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Analisador Genético | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Referências
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
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