Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.
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Artigo de método
Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas de ligação ao ARN (RBPs) determinam o destino dos ARNs. Eles participam de todas as vias de biogênese de RNA e contribuem especialmente para a regulação de genes pós-transcrição (PTGR) de ARNs mensageiros (mRNAs). Nos últimos anos, uma série de proteomas ligados a mRNA de leveduras e linhas de células de mamíferos foram isoladas com sucesso através do uso de um novo método chamado "captura de intercepto de ARNm", que permite a identificação de proteínas de ligação de mRNA (mRBPs) Diretamente de um ambiente fisiológico. O método é composto de reticulação ultravioleta (UV) in vivo , pull-down e purificação de complexos de ribonucleoproteína messenger (mRNPs) por esferas de oligo (dT) e a posterior identificação das proteínas reticuladas por espectrometria de massa (MS). Muito recentemente, ao aplicar o mesmo método, vários proteomas ligados a mRNA de plantas foram relatados simultaneamente em diferentes fontes de tecido de Arabidopsis : mudas etioladas, tecido foliar,Protoplastos de mesofila foliar e células de raízes cultivadas. Aqui, apresentamos o método otimizado de captura de interome de mRNA para protoplastos de mesofila de folha de Arabidopsis thaliana , um tipo de célula que serve como uma ferramenta versátil para experiências que incluem vários ensaios celulares. As condições para o rendimento proteico ideal incluem a quantidade de tecido inicial e a duração da irradiação UV. No proteoma ligado a mRNA obtido a partir de uma experiência de média escala (10 células 7 ), as RBPs observaram que a capacidade de ligação de RNA foi representada de forma exagerada e foram identificadas várias novas RBPs. O experimento pode ser ampliado (10 9 células), e o método otimizado pode ser aplicado a outros tipos e espécies de células vegetais para isolar, catalogar e comparar geneticamente proteinas de mRNA nas plantas.
Introdução
Os eucariotas usam múltiplos caminhos regulatórios da biogênese do ARN para manter os processos biológicos celulares. Entre os tipos conhecidos de ARN, o ARNm é muito diverso e traz a capacidade de codificação das proteínas e suas isoformas 1. A via PTGR direciona o destino dos pré-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes famílias de genes controlam a regulação do RNA, e em PTGR, mRBPs específicos orientam os mRNAs através de interações físicas diretas, formando mRNPs funcionais. Portanto, identificar e caracterizar mRBPs e seus mRNPs é fundamental para a compreensão da regulação do metabolism....
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Protocolo
1. Aislamento de Protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis
NOTA: Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são essencialmente isolados como descrito por Yoo et al ., 2007, com várias modificações 40 .
- Crescimento de plantas
- Mergulhe cerca de 200 sementes de etiópia Col-0 de Arabidopsis thaliana em água esterilizada durante 2 dias a 4 ° C na escuridão para estratificação.
NOTA: Este número de sementes é suficiente para uma amostra não CL e uma amostra de CL (ver passo 1.3). - Prepare potes com uma mistura de solo....
- Mergulhe cerca de 200 sementes de etiópia Col-0 de Arabidopsis thaliana em água esterilizada durante 2 dias a 4 ° C na escuridão para estratificação.
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Resultados
Observamos um halo característico, que envolve o grânulo do talão na amostra CL, no passo de lavagem 4.3 com o tampão de lavagem 2 ( Figura 1B ). Embora não tenha sido investigado, esse fenômeno provavelmente pode ser explicado pela interferência de complexos de mRNP reticulados com agregação de grânulos durante a captura magnética, fazendo com que um agregado mais difuso se forme. Isso indica que a captura de pérolas oligo-d (T) 25 foi efetiva
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Discussão
Nós aplicamos com sucesso a captura de interome de mRNA, desenvolvida para leveduras e células humanas, para plantar protoplastos de mesofila foliar. As células do mesofílio da folha são o principal tipo de tecido moído nas folhas das plantas. A principal vantagem deste método é que ele usa reticulação in vivo para descobrir as proteínas de um ambiente fisiológico.
Neste protocolo, apresentamos principalmente uma série de condições experimentais otimizadas ( por exemplo, o .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos o laboratório do Prof. Joris Winderickx, que forneceu o aparelho de reticulação UV equipado com a lâmpada UV convencional. A KG é apoiada pelo fundo de pesquisa KU Leuven e reconhece o apoio da subvenção FWO G065713N.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| 0.8 M Mannitol | Sigma | M1902-500G | Solução de enzima isotônica primária & Solução MMg |
| 2 M KCl | MERCK | Art. 4935 | Solução enzimática isotônica primária & tampão W5 |
| 0,2 M MES (pH 5,7) (ácido 4-morfolineetanossulfônico) | Sigma-aldrich | M2933 | Solução enzimática isotônica primária, tampão W5 & solução MMg, Esterilização por filtração |
| Celulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | CELULASE " ONOZUKA" R-10, 10 g | Solução enzimática isotônica final |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10g | Solução enzimática isotônica final |
| 10% (p/v) BSA (albumina de soro bovino) | Sigma-aldrich | A7906-100G | Solução enzimática isotônica final & Esterilização por filtração |
| 1 M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Solução enzimática isotônica final, tampão W5 e Tampão de digestão |
| 1 M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | Tampão W5 |
| 2 M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | Solução MMg |
| 1 M LiCl (cloreto de lítio) | Acros | 199885000 | Lise/tampão de ligação, Tampão de lavagem 1, Tampão de lavagem 2 & Tampão com baixo teor de sal |
| 5% (w/v) LiDS (Sulfato de Dodecil de Lítio) | Sigma-aldrich | L4632-25G | Lise/tampão de ligação, Tampão de lavagem 1 & Esterilização por filtração |
| 1 M DTT (Ditiotreitol) | Thermo Fisher Scientific Tampão de lavagem 1 & Tampão de lavagem 2 | 307866 | Lise/tampão de ligação, |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hidroximetil)aminometano, ácido clorídrico S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical | 167620010 & H/1200/PB15 | Lise/tampão de ligação, Tampão de lavagem 1, Tampão de lavagem 2, Tampão com baixo teor de sal e Tampão de eluição |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) (ácido etilenodiaminotetracético) | Sigma-aldrich | ED-500G | Lise/tampão de ligação, Tampão de lavagem 1, Tampão de lavagem 2, Tampão com baixo teor de sal e Tampão de eluição |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Regeneração de esferas de oligo-d(T)25 |
| 0,1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Regeneração de esferas de oligo-d(T)25 |
| 1x PBS (pH 7,4) (solução salina tamponada com fosfato) contendo (NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4) | Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC | S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 | Regeneração de oligo-d(T)25 grânulos Solução de |
| proteinase K (2 μ g/μ L) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Digestão de proteínas |
| Corante de carregamento | Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE |
| qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR |
| RNase Cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Digestão de RNA |
| Metanol | Sigma-aldrich | 322415 | Fixação em gel e descoloração em gel |
| Ácido acético | Sigma-aldrich | 537020 | Fixação em gel e descoloração em gel |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Coloração em gel |
| 1 M NH4HCO3 (Bicarbonato de amônio) | Sigma-aldrich | 09830-500G | Gel hidratação & Tampão de digestão |
| CH3CN (Acetonitrila) | Sigma-aldrich | 34851-100ML | Gel desidratação & Solução de dissolução de peptídeos |
| IAA (ácido iodoacético) | Sigma-aldrich | I4386-10G | Agente alquilante |
| TFA (ácido trifluoroacético) | Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Solução de dissolução de peptídeos |
| FA (ácido fórmico) | Sigma-aldrich | 06554-5G | Extração de peptídeos |
| Solução de tripsina (6 ng/μ L) | Promega | V5280 | Tampão de digestão |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Crescimento vegetal |
| Vermiculita 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | de crescimento vegetal |
| (150 x 20 mm) | Sarstedt | 82.1184.500 | Suporte para suspensão de protoplasto |
| 0,22 μ m filtro | Millipore | SE2M229104 | Homogeneização da solução enzimática isotônica final |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Tiras de folhas de roseta |
| 35-75 μ m malha de nylon | SEFAR NITEX | 74010 | Protoplast suspensão filtração |
| 50 mL tubos de fundo redondo | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Carrier para suspensão protoplast |
| Hemocitômetro (Bü hemocitômetro rker) | MARIENFELD | 650030 | para contagem de células Protoplast |
(HL-2000 HybriLinker) | UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo Lâmpada UV de reticulação UV |
(Sankyo-Denki G8T5) | SANKYO DENKI | SD G8T5 | in vivo |
| Seringa de vidro de 50 mL | FORTUNA Optima | Z314560 | Homogeneização do lisado de protoplasto |
| Agulha estreita (0,9 x 25 mm) | Microlança Becton Dickinson 3 | 2021-04 | Homogeneização do lisado de protoplasto |
| Rotador Modelo L26 | Labinco BV | 26110912 | Incubação de amostras por rotação |
| de Oligo-d(T)25 esferas magnéticas (5 mg/mL) | New England BioLabs | S1419S | mRNPs e mRNAs de ligação e |
| Rack magnético | suspenso Invitrogen | CS15000 | mRNPs e mRNAs de ligação e pull-down |
| Unidades de filtro centrífugo (unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4) | EMD Millipore | UFC800308 | concentração de mRBP |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | de ensaio de coloração de prata |
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit) | purificação de RNA | molecular 1064100300 STRATEC | |
| (Espectrofotômetro NanoDrop 1000) | Qualidade e quantidade de RNA | ND-1000 | Thermo Fisher Scientific |
| Ciclador de PCR em tempo real (StepOne Real-Time PCR cycler) | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | quantificação de cDNA |
| µ-colunas C18 (Ponta Millipore Zip µ-Colunas C18) | purificação de peptídeos | Sigma-aldrich | 720046-960EA |
(Espectrômetro de massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap) | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | de proteômica baseada em espectrometria de massa |
| (instrumento de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC) Ultimate 3000) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | de proteômica baseada em espectrometria de massa |
(coluna Easy Spray Pepmap RSLC C18) | Thermo Fisher Scientific | ES800 | Proteômica baseada em espectrometria de massa |
| C18 pré-coluna (Pré-coluna Acclaim Pepmap 100 C18) | Thermo Fisher Scientific | 160321 | Proteômica baseada em espectrometria de massa |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Primers para ensaio qRT-PCR | Sequências | ||
| UBQ10 mRNA (Li et al., 2014) | Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAGAAAGAGATAA | ||
| 18S rRNA (Durut et al., 2014) | Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
Referências
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582
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Reimpressões e permissões
