Artigo de método

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

DOI:

10.3791/56011

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28 de julho de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, KU Leuven

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Resumo

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As proteínas de ligação ao ARN (RBPs) determinam o destino dos ARNs. Eles participam de todas as vias de biogênese de RNA e contribuem especialmente para a regulação de genes pós-transcrição (PTGR) de ARNs mensageiros (mRNAs). Nos últimos anos, uma série de proteomas ligados a mRNA de leveduras e linhas de células de mamíferos foram isoladas com sucesso através do uso de um novo método chamado "captura de intercepto de ARNm", que permite a identificação de proteínas de ligação de mRNA (mRBPs) Diretamente de um ambiente fisiológico. O método é composto de reticulação ultravioleta (UV) in vivo , pull-down e purificação de complexos de ribonucleoproteína messenger (mRNPs) por esferas de oligo (dT) e a posterior identificação das proteínas reticuladas por espectrometria de massa (MS). Muito recentemente, ao aplicar o mesmo método, vários proteomas ligados a mRNA de plantas foram relatados simultaneamente em diferentes fontes de tecido de Arabidopsis : mudas etioladas, tecido foliar,Protoplastos de mesofila foliar e células de raízes cultivadas. Aqui, apresentamos o método otimizado de captura de interome de mRNA para protoplastos de mesofila de folha de Arabidopsis thaliana , um tipo de célula que serve como uma ferramenta versátil para experiências que incluem vários ensaios celulares. As condições para o rendimento proteico ideal incluem a quantidade de tecido inicial e a duração da irradiação UV. No proteoma ligado a mRNA obtido a partir de uma experiência de média escala (10 células 7 ), as RBPs observaram que a capacidade de ligação de RNA foi representada de forma exagerada e foram identificadas várias novas RBPs. O experimento pode ser ampliado (10 9 células), e o método otimizado pode ser aplicado a outros tipos e espécies de células vegetais para isolar, catalogar e comparar geneticamente proteinas de mRNA nas plantas.

Introdução

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Os eucariotas usam múltiplos caminhos regulatórios da biogênese do ARN para manter os processos biológicos celulares. Entre os tipos conhecidos de ARN, o ARNm é muito diverso e traz a capacidade de codificação das proteínas e suas isoformas 1. A via PTGR direciona o destino dos pré-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes famílias de genes controlam a regulação do RNA, e em PTGR, mRBPs específicos orientam os mRNAs através de interações físicas diretas, formando mRNPs funcionais. Portanto, identificar e caracterizar mRBPs e seus mRNPs é fundamental para a compreensão da regulação do metabolismo do mRNA celular 2. Nas últimas três décadas, vários métodos in vitro - incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética de RNA (REMSA), evolução sistemática de ligandos por ensaios exponenciais de enriquecimento (SELEX) com base em construções derivadas da biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcados ou quantitativosEnsaios de ligação de ARN de fluorescência, cristalografia de raios X e espectroscopia de RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - foram amplamente aplicados a estudos de RBPs, principalmente de células de mamífero. Os resultados desses estudos de RBPs de mamíferos podem ser pesquisados ​​através da Base de Proteínas de Proteção de RNA (RBPDB), que coleta as observações publicadas 10 .

Embora essas abordagens in vitro sejam ferramentas poderosas, elas determinam os motivos de RNA vinculados a partir de um conjunto de sequências de RNA dado e, portanto, são limitadas na capacidade de descobrir novos RNAs alvo. O mesmo é verdade para estratégias computacionais para prever RBPs em todo o genoma, que se baseiam na conservação da seqüência e estrutura da proteína 15 . Para superar isso, um novo método experimental haFoi estabelecido que permite a identificação dos motivos RNA de que um RBP de interesse interage, bem como para a determinação da localização precisa da ligação. Este método, denominado "reticulação e imunoprecipitação" (CLIP), é composto de reticulação UV in vivo seguida de imunoprecipitação 11 . Estudos iniciais mostraram que a fotoativação de nucleotídeos de DNA e RNA pode ocorrer em comprimentos de onda ultravioleta de excitação superiores a 245 nm. A reacção através da timidina parece ser favorecida (classificação por ordem de redução da fotoreactividade: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Usando luz UV com um comprimento de onda de 254 nm (UV-C), observou-se que as ligações covalentes entre os nucleotídeos de ARN e os resíduos de proteínas são criados quando na faixa de apenas alguns Angstroms (Å). O fenômeno é, portanto, chamado de reticulação "zero-length" de RNA e RBP. Isto pode ser seguido por um rigoroso processo de purificação Com poucos antecedentes 13 , 14 .

Uma estratégia complementar ao CLIP é combinar reticulação UV in vivo com identificação de proteína para descrever a paisagem de RBPs. Vários desses proteomas ligados a ARNm do genoma foram isolados a partir de células de levedura, células-tronco embrionárias (ESC) e linhas celulares humanas ( ou seja, HEK293 e HeLa) utilizando esta nova abordagem experimental, chamada "captura de intercepto de mRNA" 18 , 19 , 20 , 21 . O método é composto de reticulação ultravioleta in vivo seguido por purificação de mRNP e proteômica baseada em MS. Ao aplicar esta estratégia, descobriram-se muitas RBPs "nítidas" que contêm RBDs não-canônicas, e tornou-se claro que mais proteínas possuem capacidades de ligação ao ARN do que se supunha anteriormente"> 15 , 16 , 17. O uso deste método permite novas aplicações e a capacidade de responder a novas questões biológicas ao investigar RBPs. Por exemplo, um estudo recente investigou a conservação do proteoma vinculado ao mRNA (RBP do núcleo) Proteoma) entre leveduras e células humanas 22 .

Os RBPs da planta já foram encontrados envolvidos no crescimento e no desenvolvimento ( por exemplo , na regulação pós-transcrição do tempo de floração, no relógio circadiano e na expressão gênica nas mitocôndrias e cloroplastos) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Além disso, eles são pensados ​​para desempenhar funções nos processos celulares que respondem a estresses abióticos ( por exemplo, frio, seca, saLinidade e ácido abscísico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Existem mais de 200 genes de RBP previstos no genoma de Arabidopsis thaliana , com base em motivos de reconhecimento de RNA (RRM) e homologia de K (KH); Em arroz, aproximadamente 250 foram observados 35 , 36 . É notável que muitas RBPs preditas parecem ser únicas para as plantas ( por exemplo, nenhum orthologs metazoários para aproximadamente 50% das RBPs Arabidopsis previstas contendo um domínio RRM) 35 , sugerindo que muitos podem servir novas funções. As funções das RBPs mais preditas permanecem não caracterizadas 23 .

O isolamento de proteomas ligados a mRNA de mudas etioladas de Arabidopsis , tecido foliar, células radiculares cultivadas e protoplastos de mesofila foliar através do uso deA captura de intercepto de mRNA foi recentemente relatada 38 , 39 . Esses estudos demonstram o forte potencial de catalogação sistemática de RBPs funcionais em plantas em um futuro próximo. Aqui, apresentamos um protocolo para captura de intereleto de mRNA a partir de protoplastos de plantas ( isto é, células sem paredes celulares). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana são o principal tipo de célula foliar. Os protoplastos isolados permitem o acesso ideal da luz UV às células. Este tipo de célula pode ser usado em ensaios que expressam transitoriamente proteínas para caracterização funcional 40 , 41 . Além disso, o protoplasting foi aplicado a vários outros tipos de células vegetais e espécies 42 , 43 , 44 ( eg, Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; e Hong et al ., 2012).

O método abrange um total de 11 passos ( Figura 1A ). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são primeiro isolados (passo 1) e subsequentemente são irradiados com UV para formar mRNPs reticulados (passo 2). Quando os protoplastos são lisados ​​em condições de desnaturação (passo 3), as mRNP reticuladas são liberadas em tampão de lise / ligação e puxadas pelas pérolas oligo-d (T) 25 (passo 4). Após várias rodadas de lavagens rigorosas, os mRNPs são purificados e analisados ​​posteriormente. Os péptidos desnaturados de mRBPs são digeridos pela proteinase K antes dos mRNAs reticulados serem purificados e a qualidade do RNA é verificada por qRT-PCR (passos 5 e 6). Após o tratamento com RNase e a concentração de proteína (passo 7), a qualidade da proteína é controlada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) e coloração com prata (passo 8). A diferença nos padrões de banda proteica pode ser facilmente visualizada entre uma amostra reticulada (CL) e uma amostra não reticulada (não CL;A amostra de controle negativo de protoplastos que não está sujeita a irradiação UV). A identificação de proteínas é conseguida através de proteômica baseada em MS. As proteínas da amostra de CL são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida unidimensional (1D-PAGE) para remover a possível contaminação de fundo, são "digeridas em gel" em péptidos curtos usando tripsina e são purificadas (passo 9). A cromatografia líquida nano de fase inversa acoplada à espectrometria de massa (nano-LC-MS) permite a determinação da quantidade de proteínas definitivas no proteoma ligado ao mRNA (passo 10). Finalmente, os mRBP identificados são caracterizados e catalogados usando a análise bioinformática (etapa 11).

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Protocolo

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1. Aislamento de Protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis

NOTA: Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são essencialmente isolados como descrito por Yoo et al ., 2007, com várias modificações 40 .

  1. Crescimento de plantas
    1. Mergulhe cerca de 200 sementes de etiópia Col-0 de Arabidopsis thaliana em água esterilizada durante 2 dias a 4 ° C na escuridão para estratificação.
      NOTA: Este número de sementes é suficiente para uma amostra não CL e uma amostra de CL (ver passo 1.3).
    2. Prepare potes com uma mistura de solo e vermiculite de 50% ( v / v ) e remova os potes com água destilada em uma bandeja para molhar o solo.
    3. Semeie e distribua as sementes estratificadas em solo molhado. Não cubra as sementes com solo adicional porque as sementes de Arabidopsis precisam de luz para germinação.
      NOTA: As condições de crescimento da planta são um ciclo de 12 h de luz / 12 horas a 23 ° C,Com uma intensidade de luz de 100 μmol m -2 s -1 , numa sala de crescimento durante 5 semanas antes da floração. As plantas de 4 semanas de idade também podem ser usadas 40 .
      NOTA: Todos os materiais e reagentes descritos a partir do passo 1.2.1 para o passo 3.2.3 são para duas amostras ( ou seja, uma amostra não CL (a amostra de controle que não está sujeita a irradiação UV-C) e uma amostra CL (a pesquisa Amostra que é submetida a irradiação UV-C)).
  2. Preparação da solução enzimática isotônica
    1. Faça 80 mL de solução de enzima isotônica primária (manitol 400 mM, KCl 20 mM e tampão MES 20 mM (pH 5,7)) e aquecer imediatamente a solução em uma incubadora a 60 ° C durante 10 min.
    2. Adicionar 1,2 g de Celulase R10 ( p / v 1,5%) e 0,32 g de pó de Macerozyme R10 ( p / v 0,4%) à solução de enzima isotónica primária morna.
    3. Coloque cuidadosamente a enzima pó na solução, aplicando uma agitação suave. RapAqueça a solução em uma incubadora a 60 ° C durante 10 minutos até que a solução da enzima seja clara e clara.
    4. Arrefece-se a solução em gelo durante 3 min e adicionar 800 mL de 1 M de CaCl2 e 800 mL de 10% (w / v) de BSA à solução.
    5. Homogeneize a solução por pipetagem e filtragem através de um filtro de 0,22 μm. Alíquota esta solução de enzima isotônica final em duas placas de Petri em grande escala (150 mm x 20 mm).
  3. Preparação de tiras de folhas de roseta Arabidopsis
    NOTA: Recomenda-se 150 folhas para cada placa de Petri para uma amostra não CL ou uma amostra de CL.
    1. Escolha e cortar um total de 300 totalmente expandido 2 nd - ou 3 rd -pair folhas verdadeiras (média: 3 - 4 por roseta) em 0,5 a 1 mm de tiras de folha usando um novo e afiada lâmina de barbear.
    2. Transfira e submerga as tiras imediatamente na solução enzimática isotônica.
      NOTA: Para evitar qualquer contato com a luz, cubra sempre tEle pratos de Petri com papel alumínio. Não esmague as folhas. Confirme se todas as tiras estão submersas na solução e não flutuam na superfície.
  4. Isolamento de protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis
    1. Coloque as placas de Petri cobertas de alumínio em vácuo e dessecar as tiras folheadas ao vácuo durante 30 min. Posteriormente, incubar as placas de Petri na escuridão sem agitação à temperatura ambiente durante 2,5 h.
    2. Agite suavemente e brevemente os pratos horizontalmente à mão, tentando liberar os protoplastos inteiramente na solução enzimática.
  5. Colhendo e contando os protoplastos
    1. Filtre a suspensão de protoplastos através de uma malha de nylon de 35 a 75 μm. Alíquota do filtrado de cada amostra em dois tubos de fundo redondo de 50 mL (aproximadamente 20 mL de filtrado em cada tubo).
    2. Enxaguar cada placa de Petri com 10 mL de tampão W5 (154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl 2, KCl 5 mM e tampão MES 2 mM (pH 5,7)) para transferir o resto dos protoplastos para a solução enzimática. Adicione este filtrado de 10 mL de cada amostra aos tubos. Cubra os tubos com papel alumínio e mantenha-os no gelo.
    3. Gire todos os quatro tubos durante 5 min a 100 xg para sedimentar os protoplastos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda gentilmente os grânulos de protoplastos em cada tubo com 10 mL de tampão W5.
      NOTA: Ao ressuspender os grânulos de protoplastos, reverta suavemente o tubo de cabeça para baixo e gire suavemente o tubo manualmente até que os pellets tenham desaparecido. Não pipeteie o sedimento diretamente para evitar danificar as células.
    4. Repita o passo 1.5.3 uma vez e combine a suspensão de protoplastos de dois tubos de cada amostra em um tubo de fundo redondo de 50 ml. Mantenha os tubos no gelo.
    5. Conte os protoplastos usando um hemocitómetro.
      NOTA: Cada 20 células dentro de 25 cubos é igual a 2 x 10 5 protoplastos / mL. 150 folhas devem produzir aproximadamente 1 x 10 7 células.Modular para ter um número total igual de protoplastos nas amostras não CL e CL.
    6. Mantenha os protoplastos no gelo durante 30 min. Depois, gire os tubos por 5 min a 100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender os protoplastos em cada tubo com 20 ml de solução MMG (manitol 400 mM, MgCl 2 15, e 4 mM de tampão MES (pH 5,7)).

2. In-Vivo mRNA-proteína de reticulação por radiação UV

NOTA: Mantenha o tubo de amostra não CL no gelo. A amostra CL deve ser imediatamente irradiada por UV.

  1. Transfira a suspensão de protoplastos contendo 1 x 10 7 células do tubo de amostra CL para uma nova placa de Petri em grande escala (150 mm x 20 mm) e adicione 30 ml de solução gelada de MMg para cobrir a superfície da placa. Espalhe as células em todo o buffer de MMg por pipetagem suave. Coloque imediatamente a placa de Petri sem a cobertura superior em um aparelho de reticulação UV.
    NOTA: A altura entre a lâmpada UVE a placa de Petri é de 8 cm.
  2. Irradiate a amostra com luz UV de comprimento de onda de 254 nm e 0,00875 W / cm 2 de intensidade UV durante 1 min, 3 min ou 5 min. Após a irradiação, alíquote rapidamente a suspensão de protoplastos em dois novos tubos de fundo redondo de 50 mL. Lave o fundo do prato com mais 5 mL de solução gelada de MMg para coletar o restante dos protoplastos e adicione esta suspensão celular a estes dois tubos.
    NOTA: 1 min foi escolhido como a condição ideal. A explicação pode ser encontrada nos resultados representativos .

3. Lise de protoplastos sob condições de desnaturação

  1. Preparação de pellets de protoplastos para lise
    1. Gire o tubo de amostra não CL juntamente com os dois tubos de amostra CL do passo 2 a 100 xg durante 5 min e descarte o sobrenadante. Coloque o tubo da pastilha de protoplasto de amostra não-CL de volta no gelo.
    2. Adicione 10 mL de solução gelada de MMg a cada tubo de amostra CL, genTente ressuspender os grânulos e combiná-los novamente em um tubo redondo de fundo de 50 mL. Gire o tubo a 100 xg durante 5 min. Depois de remover o sobrenadante, mantenha o sedimento de protoplasto do tubo de amostra CL no gelo.
  2. Lise de protoplastos e lisina de protoplastos homogeneizantes
    1. Adicionar 9 mL de lise gelada / tampão de ligação (500 mM de LiCl, 0,5% ( p / v ) de Dodecyl Sulphate de Litio (LiDS), 5 mM de Dithiothreitol (DTT), 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0)) ao sedimento celular de cada amostra. Lerse lentamente os protoplastos, pipetando para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes até a suspensão ser homogêneamente verde-clara.
    2. Passe o lisado de protoplastos duas vezes através de uma seringa de vidro de 50 mL com uma agulha estreita (0,9 x 25 mm 2 ) para homogeneização. Incube o lisado sobre gelo durante 10 min. Congele os lisados ​​em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C por até 3 semanas.

4. mRNP Pull-down e PurificationPor Oligo-d (T) 25 Beads

NOTA: Todos os materiais e reagentes descritos a seguir, do passo 4.1 ao passo 4.4, são apenas para uma amostra ( ou seja, uma amostra não CL ou uma amostra de CL). O lisado de protoplastos deve ser adicionado imediatamente aos tubos que contêm esferas após o lubrificante do sobrenadante do grânulo / tampão de ligação ser descartado.

  1. Preparação de esferas magnéticas oligo-d (T) 25 para captura de oligo (dT)
    1. Destilar o lisado de protoplastos congelados à temperatura ambiente. Quando o lisado estiver totalmente descongelado, mantenha o tubo de lisado no gelo.
    2. Alíquota 1,8 mL de pérolas magnéticas oligo-d (T) 25 (5 mg / mL) em 6 novos tubos de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL em gelo. Em cada tubo, lave a suspensão do talão homogeneamente com 600 μL de lise / tampão de ligação, pipetando brevemente para cima e para baixo e girando suavemente a 4 ° C durante 2 min. Mantenha as contas no gelo.
  2. Obrigatório
    1. Lugar, colocarTodos os 6 tubos que contêm as contas em uma prateleira magnética a 4 ° C durante 3 min, o que resultará na captura magnética das esferas e na limpeza da suspensão.
      NOTA: Quando os tubos são colocados no suporte magnético, aguarde até que as contas sejam completamente capturadas, pelo menos 3 min.
    2. Descarte o sobrenadante e alíquote imediatamente 9 mL de lisado de protoplastos nestes 6 tubos. Misture bem por pipetagem até aparecer uma suspensão marrom homogênea e incubar as pérolas em lisado de protoplastos a 4 ° C durante 1 h aplicando rotação suave.
      NOTA: Recomenda-se um tempo de incubação de 30 min a 1 h.
  3. Lavando
    1. Coloque os tubos de volta no suporte magnético a 4 ° C durante 3 min. Quando todas as contas são capturadas no lado dos tubos, colete o lisado de protoplastos em 6 novos tubos de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL e armazene-os temporariamente a 4 ° C. NÃO descarte imediatamente o lisado de protoplastos; Mantenha o lisadoA 4 ° C.
    2. Adicionar 1,5 mL de tampão de lavagem gelado 1 (LiCl 500 mM, LiDS a 0,1% ( p / v ), DTT 5 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM (pH 8,0)) às esferas Em cada tubo. Ressuspenda as contas e aplique uma rotação suave durante 1 min. Coloque os tubos de volta no suporte magnético a 4 ° C durante 3 min e descarte o sobrenadante. Repita este passo de lavagem com o tampão de lavagem uma vez.
    3. Repita o mesmo procedimento deste passo de lavagem duas vezes utilizando 1,5 mL de tampão de lavagem gelado 2 (LiCl 500 mM, DTT 5 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM (pH 8,0)) e uma vez que utiliza 1,5 mL de tampão de baixo teor de sal gelado (LiCl 200 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM (pH 8,0)).
      NOTA: Se os mRNPs foram isolados eficientemente do lisado de protoplastos, deve haver um "halo" visível ao redor da pastilha de grânulos na amostra CL durante o passo de lavagem com o tampão de lavagem 2 ( Figura 1B ).
  4. Elução
    1. Adicionar 500 μLDe tampão de eluição (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) e EDTA 1 mM (pH 8,0)) nas esferas em cada tubo. Ressuspender gentilmente as esferas e incubar a 50 ° C durante 3 minutos para libertar os ARNs de poli (A). Ressuspenda gentilmente as contas uma vez por pipetagem. Coloque os tubos de volta no suporte magnético a 4 ° C durante 5 min.
    2. Transfira e combine todos os eluentes (aproximadamente 3 mL no total) para um tubo de fundo cônico, limpo e estéril, com 15 ml de cônica no gelo.
      NOTA: A qualidade e a quantidade de RNA podem ser imediatamente determinadas usando um dispositivo de espectrofotômetro.
      NOTA: A concentração de ARN de cada amostra é de aproximadamente 10 ng / μL, com uma razão A 260 / A 280 de 1,9. O índice A 260 / A 280 deve estar entre 1,6 e 2,0 porque os ARNs de poli (A) isolados geralmente são maiores que 70% puros. Se a concentração de ARN for muito baixa, aumente o número de protoplastos iniciais para um máximo de 10 9 . AmostrasPode ser congelado em nitrogênio líquido e mantido a 80 ° C para armazenamento a longo prazo.
    3. Repita o passo 4.2 para o passo 4.4 para duas rodadas adicionais e reutilize as esferas de oligo-d (T) 25 para esgotar os ARNs de poli (A) do lisado de protoplastos.
      NOTA: Após três rodadas de procedimento suspenso, deve haver um total de 9 mL de eluente para cada amostra não CL ou CL. Execute todos os trabalhos a 4 ° C para evitar a degradação do RNA. Siga o passo 4.5 ou o passo 4.6 para reutilizar ou regenerar os grânulos.
  5. Preparação de esferas de oligo-d (T) 25 reutilizadas
    1. Lave as contas duas vezes com 1 mL de tampão de eluição gelada e uma vez com 1 mL de lise gelada / tampão de ligação para ajustar a concentração de sal de LiCl de volta a 500 mM.
    2. Siga o passo 4.1, descarte o sobrenadante, transfira o lisado de protoplastos armazenado em cada tubo e repita todo o procedimento do passo 4.2 para o passo 4.4 para mais duas rodadas.
  6. Regeneração de oligo-d (T) 25 esferas
    NOTA: As contas podem ser armazenadas e usadas para outra experiência (a reutilização máxima é de três vezes).
    1. Siga o passo 4.4, adicione 1 mL de NaOH 0,1 M às esferas e incube por rotação à temperatura ambiente durante 5 min. Para cada tubo, lave duas vezes com 1 mL de tampão de lavagem 1 e três vezes com 1x PBS (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween-20 para equilíbrio. Mantenha as pérolas de cada tubo em 300 μL de 1x PBS esterilizado sem RNase (pH 7,4) contendo 0,1% de Tween-20 a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
      NOTA: Os grânulos usados ​​para amostras de Arabidopsis CL nesta experiência só podem ser usados ​​para as mesmas amostras de plantas na próxima vez.

5. Tratamento com Proteinase K e Purificação de ARNm

  1. Tratamento com Proteinase K
    1. Adicione 8 μL de solução de Proteinase K (2 μg / μL) a 1 mL do eluente de cada amostra para digerir as proteínas reticuladas com UV. BrVortex iefly.
  2. Purificação de ARNm
    1. Incubar o eluente a 37 ° C durante 1 h. Purifique o RNA usando o kit de purificação de RNA para remover contaminantes residuais.
      NOTA: Após a purificação, os ARNs estão prontos para o teste de qualidade de ARN usando o ensaio qRT-PCR.
      NOTA: Outros kits, como kit mini RNA e reagente TRIzol, também podem ser usados 14 .

6. Ensaio qRT-PCR

  1. Transcrição reversa
    1. Obtenha síntese eficiente do cDNA de primeira linha usando o sistema de transcrição reversa, com 1 μg de RNA como modelo. Diluir a amostra a 5 ng / μL com água livre de nuclease.
  2. Quantificação de cDNA usando qRT-PCR
    1. Amplifique e quantifique o cDNA usando a mistura mestre qPCR e o ciclador de PCR em tempo real, com 10 ng de cDNA como modelo. Use o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 10 minutos(Estágio 1, um ciclo) e 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min (estágio 2, 40 ciclos).
      NOTA: O gene de referência usado aqui foi um gene de controle interno endógeno, UBQ10 (AT4G05320). Os iniciadores de qRT-PCR para ARNr UBQ10 e 18S foram descritos em Li et al ., 2014 e Durut et al ., 2014, respectivamente , 45 , 46 . As sequências iniciais estão listadas na Tabela de materiais .

7. RNase Treatment e mRBP Concentration

  1. Tratamento com RNase
    1. Adicione aproximadamente 100 U de coquetel RNase contendo RNase A e RNase T1 em 8 mL de eluente. Inclua uma amostra de controle negativo com um cocktail RNase em que o eluente seja substituído por água livre de nuclease. Em breve vortex e incubar a 37 ° C durante 1 h.
  2. Concentração de mRBP
    1. Após a digestão com RNase, concentre o eluente usinG unidades de filtro centrífugo. O volume final é de 75 μL, com um rendimento proteico total de aproximadamente 2 μg de cada amostra após a concentração. Coloque as amostras a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

8. SDS-PAGE e coloração de prata

  1. SDS-PAGE
    1. Misture 25 μL do eluente concentrado (amostra CL) ou a amostra de controle (amostra não CL) com 15 μL de 2 x tintura de carga. Aquecer a amostra a 95 ° C durante 5 min e carregá-la em um gel SDS-PAGE contendo 5% de gel de empilhamento e 12% de gel de resolução, incluindo um marcador de proteína.
    2. Condensar as proteínas a 60 V por 40 min e separar a 160 V por aproximadamente 1 h até o corante de carga atingir a extremidade do gel de resolução.
  2. Ensaio de coloração de prata
    1. Lave o gel SDS-PAGE duas vezes com água ultrapura por 5 min cada vez. Execute a coloração de prata das proteínas usando um kit comercial de manchas de prata.
      NOTA: As bandas de proteínas devem ser mostradas dentro de 5 min. Se as faixas forem visíveis além de 5 min com cores muito claras, sugere-se aumentar o número de protoplastos iniciais até o máximo de 10 9 .

9. Trypsin Digest of Protein Bands and Peptide Purification

  1. Sumário de tripsina
    NOTA: Execute um segundo gel 1D-PAGE tomando mais 25 μL de solução concentrada de mRBP de cada amostra para identificação de mRBP; Os géis corados com prata não podem ser usados ​​porque não são compatíveis com a análise de MS.
    1. Depois de executar o gel 1D-PAGE, repare o gel na solução de fixação (metanol a 50% ( v / v ) e ácido acético a 10% ( v / v ) durante 1 h. Manchar o gel na solução de mancha (0,1% ( p / v ) de Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% ( v / v ) de metanol e 10% ( v / v ) de ácido acético) durante 20 minutos com agitação suave. Destilar o gel na solução de descontinuação (40% ( v / v ) de metanol e 10% ( v/ V) ácido acético) durante 1 h. Após a coloração, mantenha o gel em 5% ( v / v ) de ácido acético.
      NOTA: Durante a descodificação, a nova solução de descontinuação pode ser substituída até que o fundo esteja totalmente descodificado.
    2. Corte as bandas de interesse do gel. Corte as bandas ainda mais em pedaços de aproximadamente 1 mm 3 para a posterior digestão óptima da tripsina e extração de péptidos. Hidratar os pedaços do gel com 50 mL de bicarbonato de amónio 100 mM (NH 4 HCO 3) durante 10 min. Cubra as peças de gel completamente.
      1. Remover a solução de hidratação cuidadosamente e desidratar os pedaços do gel com acetonitrilo (CH3CN), durante 10 min. Remova cuidadosamente a solução de acetonitrilo.
      2. Repita o processo de hidratação para desidratação duas vezes. Finalmente, remova a solução de acetonitrilo.
        NOTA: O tempo de execução do gel depende do propósito da experiência. Um longo período de tempo permite uma boa separação de proteínas, de modo que a proibição de gel especificada manchadaDs podem ser cortados para análise posterior. Se o objetivo é manter as proteínas e remover contaminantes, é suficiente um tempo de execução curto.
    3. Adicionar 500 μL de solução de DTT 6,6 mM e incubar os pedaços de gel por 10 min. Remova a solução de DTT e lave as peças de gel duas vezes com 500 μL de solução de acetonitrilo a 95% ( v / v ).
      1. Após a lavagem, remova a solução de acetonitrilo e incuba os pedaços de gel com 500 μL de solução de ácido iodoacético 55 mM (IAA) durante 10 min na escuridão.
      2. Após a incubação, retire a solução e lave os pedaços de gel novamente com 500 μL de solução de acetonitrilo a 95% ( v / v ). Secar os pedaços de gel.
    4. Incorporar os pedaços de gel completamente com 25 uL de tampão de digestão (50 mM NH 4 HCO 3, CaCl 2 5 mM, e 6 ng / mL de tripsina) e manter em gelo durante 45 min para permitir que a tripsina permear no gel. Incubar os pedaços de gel durante a noite a 37 ° C para en Digestão zymatic.
  2. Purificação de péptidos
    1. Adicionar 80 uL de 50 mM NH 4 HCO 3 para os pedaços de gel no tampão de digestão e vortex repetidamente para extrair os peptídeos trípticos. Coletar o extrato. Repita este passo de extração duas vezes com 80 μL de 50% ( v / v ) de CH3CN e 5% ( v / v ) de ácido fórmico (FA).
      NOTA: O extracto final total deve ser de aproximadamente 240 μL.
    2. Coloque e concentre os extratos em aproximadamente 10 μL por concentração de vácuo ou liofilização e adicione 25 μL de solução aquosa de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% ( v / v ). Desalme as amostras com colunas μ-C18, seguindo o protocolo do fabricante.
    3. Elui-se os péptidos com 4 - 10? L de 60% (w / v) CH 3 CN e 0,1% (v / v) de FA. Liofilizar (congelar-se) os péptidos e armazená-los a -20 ° C até a análise.
Título "> 10. Nano-LC-MS

  1. Cromatografia líquida nano de fase reversa
    NOTA: Execute a análise LC-MS com um espectrômetro de massa que é acoplado em linha com um instrumento de cromatografia líquida. Este instrumento deve estar equipado com uma coluna C18 (partícula de 2 μm, tamanho de poro de 100 Å e dimensão de 50 μm x 15 cm).
    1. Ressuspender os péptidos liofilizados em 16 μL de solução (2% ( v / v ) de CH3CN e 0,1% ( v / v ) FA). Injetar e carregar 5 μL de solução de péptido a uma taxa de fluxo de 5 μL / min em uma précoluna C18 (tamanho de partícula de 3 μm, tamanho de poro de 100 Å, nanoviper e dimensão de 75 μm x 2 cm).
    2. 10.1.2. Separe os péptidos usando um gradiente de 95 minutos com um caudal de 300 nL / min. Durante este gradiente de separação, aumente a fase móvel B de 4% a 10%, 10% a 25% e 25% a 45% em 5 min, 50 min e 18 min, respectivamente. Finalmente, aumentam abruptamente a fase móvel B para 95% em 1 min. Depois deCada gradiente de separação de 95 minutos, aplique um passo de enxaguamento inerente contendo um gradiente de 10 minutos de 4% a 95% em 5 min.
      NOTA: A fase móvel A é 99,9% H 2 O e 0,1% ( v / v ) FA, e a fase móvel B é 19,92% H 2 O, 80% ( p / v ) CH 3 CN e 0,08% ( v / v ) FA.
  2. Ensaio de espectrometria de massa
    1. Operar o espectrômetro de massa em modo dependente de dados com uma faixa de massa de 400 a 1.600 m / z.
    2. Selecione até dez dos iões mais intensos no MS1 para gerar os espectros de fragmentação. Defina a resolução para 70,000 de largura total a meio máximo (FWHM) para MS1 e 17,000 para MS2, com um alvo de controle de ganho automático (AGC) de 3.000.000 e 1.000.000 de íons e um tempo máximo de injeção de iões (256) e 64 ms para MS1 E MS2, respectivamente.
    3. Defina a exclusão dinâmica em 10 s para evitar a fragmentação repetida dos íons mais abundantes.
      NOTA: Aqui, íons com uma ou mais de seis cargas são eXcluído para MS2.
  3. Proteômica qualitativa: identificação de péptidos e proteínas
    1. Analise os espectros de fragmentação usando um software como o software de estúdio Peaks 47 , 48 , 49 .
      NOTA: Outros pacotes de software também estão disponíveis para identificação de peptídeos, como NovoHMM 30 e PepNovo 37 para seqüenciamento de novo e SEQUEST 54 e Mascot 55 para pesquisa de banco de dados.
    2. Combine os espectros com a mesma massa (Arabidopsis thaliana . Use os seguintes parâmetros de busca: uma tolerância de massa precursora de 10 ppm através do uso do monMassa oisotópica; Uma tolerância de massa de fragmento de 20 mmu; Tripsina como enzima de digestão, com um máximo de 2 clivagens perdidas; Carbamidometilação de cisteína como modificação fixa; Oxidação da metionina como modificação variável; E um máximo de 3 modificações pós-translacionais variáveis ​​por péptido. Após a identificação, ajuste manualmente os limiares de pontuação para a identificação confiável de péptidos e proteínas, de modo que uma taxa de descoberta falsa (FDR) <5% seja adquirida.
  4. Proteômica quantitativa: análise estatística de dados de espectrometria de massa
    1. Use LC-MS ( por exemplo, Progenesis) para a quantificação sem etiqueta de dados proteômicos.
      NOTA: As áreas de pico do péptido MS1 (ou intensidade) estão ligadas aos péptidos identificados pelo software de estúdio de acordo com a massa, com o erro tolerado no máximo de 10 ppm.
      NOTA: Este software calcula a abundância de um péptido integrando as áreas de pico de todos os estados de carga entre 2 + e 8 + . Os dados quantitativos estão ligados à identificação do peptídeo PEAKS por um script interno (correspondência de massa com o erro tolerado no máximo de 10 ppm).
    2. Calcule as mudanças médias de log2-fold (CL / non-CL) para cada péptido. Agrupe as mudanças de dobra dos péptidos exclusivos por proteína.
      NOTA: Em cada grupo, a mudança de dobra final de uma proteína é igual à média das mudanças de dobra de seus péptidos.
    3. Calcule o valor p usando o teste t de Student para cada grupo para avaliar a significância estatística. Aplique o pacote de software R (versão 3.3.0) para corrigir os valores de p para o FDR de todos os grupos usando o método Benjamini-Hochberg (BH).
    4. Desenhe o traçado do vulcão usando o pacote de função "calibrar" (versão 1.7.2) compatível com o pacote de software R (versão 3.3.0).
      NOTA: Aqui, os valores de p ajustados em log10 (-log10 (valor adj. P)) são uma função das mudanças log2-fold de todas as proteínas identificadas. As proteínas sãoTratados como acessos positivos no proteoma vinculado ao mRNA se suas alterações de log2-fold forem maiores que 2, com ou sem significância.

11. Catálogo do Proteome identificado com mRNA identificado

  1. Classifique as proteínas identificadas do passo 10 em três categorias com base nos itens de "funções moleculares e processo biológico" através da base de dados Gene Ontology (GO) e "família e domínio" através do banco de dados InterPro.
  2. Como a categoria I, ou "proteínas ribossómicas", contém todas as proteínas ribossómicas detectadas, definem proteínas da categoria II ou "RBP principais", como contendo os domínios de proteínas anotadas que interagem com RNAs ou ligação à ligação de ARN com funções conhecidas ou desconhecidas em biologia de RNA .
  3. Como as proteínas com funções conhecidas ou desconhecidas na biologia do ARN sem domínios de ligação de ARN anotados são colocadas na categoria III, ou "RBPs Candidatos", definem enzimas da categoria III com base em anotações do IBanco de dados ntEnz.

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Resultados

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Observamos um halo característico, que envolve o grânulo do talão na amostra CL, no passo de lavagem 4.3 com o tampão de lavagem 2 ( Figura 1B ). Embora não tenha sido investigado, esse fenômeno provavelmente pode ser explicado pela interferência de complexos de mRNP reticulados com agregação de grânulos durante a captura magnética, fazendo com que um agregado mais difuso se forme. Isso indica que a captura de pérolas oligo-d (T) 25 foi efetiva

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós aplicamos com sucesso a captura de interome de mRNA, desenvolvida para leveduras e células humanas, para plantar protoplastos de mesofila foliar. As células do mesofílio da folha são o principal tipo de tecido moído nas folhas das plantas. A principal vantagem deste método é que ele usa reticulação in vivo para descobrir as proteínas de um ambiente fisiológico.

Neste protocolo, apresentamos principalmente uma série de condições experimentais otimizadas ( por exemplo, o ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos o laboratório do Prof. Joris Winderickx, que forneceu o aparelho de reticulação UV equipado com a lâmpada UV convencional. A KG é apoiada pelo fundo de pesquisa KU Leuven e reconhece o apoio da subvenção FWO G065713N.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
REAGENTS
0.8 M MannitolSigmaM1902-500GSolução de enzima isotônica primária &
Solução MMg
2 M KClMERCKArt. 4935Solução enzimática isotônica primária &
tampão W5
0,2 M MES (pH 5,7)
(ácido 4-morfolineetanossulfônico)		Sigma-aldrichM2933Solução enzimática isotônica primária,
tampão W5 &
solução MMg,
Esterilização por filtração
Celulase R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.CELULASE
" ONOZUKA"
R-10, 10 g		Solução enzimática isotônica final
Macerozyme R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10gSolução enzimática isotônica final
10% (p/v) BSA
(albumina de soro bovino)		Sigma-aldrichA7906-100GSolução enzimática isotônica final &
Esterilização por filtração
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000Solução enzimática isotônica final, tampão
W5 e
Tampão de digestão
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60Tampão W5
2 M MgCl2SigmaM8266-100GSolução MMg
1 M LiCl
(cloreto de lítio)		Acros199885000Lise/tampão de ligação,
Tampão de lavagem 1,
Tampão de lavagem 2 &
Tampão com baixo teor de sal
5% (w/v) LiDS
(Sulfato de Dodecil de Lítio)		Sigma-aldrichL4632-25GLise/tampão de ligação,
Tampão de lavagem 1 &
Esterilização por filtração
1 M DTT
(Ditiotreitol)		Thermo Fisher Scientific
Tampão de lavagem 1 &
Tampão de lavagem 2		307866Lise/tampão de ligação,
1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hidroximetil)aminometano, ácido clorídrico S.G. (HCl))Acros &
Fisher Chemical		167620010 &
H/1200/PB15		Lise/tampão de ligação,
Tampão de lavagem 1,
Tampão de lavagem 2,
Tampão com baixo teor de sal e
Tampão de eluição
0,5 M EDTA (pH 8,0) (ácido etilenodiaminotetracético)Sigma-aldrichED-500GLise/tampão de ligação,
Tampão de lavagem 1,
Tampão de lavagem 2,
Tampão com baixo teor de sal e
Tampão de eluição
Tween 20MERCK8.22184.0500Regeneração de esferas de oligo-d(T)25
0,1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295Regeneração de esferas de oligo-d(T)25
1x PBS (pH 7,4)
(solução salina tamponada com fosfato)
contendo
(NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		Regeneração de oligo-d(T)25 grânulos Solução de
proteinase K (2 μ g/μ L)Thermo Fisher Scientific11789020Digestão de proteínas
Corante de carregamentoInvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR master mixPromegaA6001qRT-PCR
RNase CocktailThermo Fisher ScientificAM2286Digestão de RNA
MetanolSigma-aldrich322415Fixação em gel e descoloração em gel
Ácido acéticoSigma-aldrich537020Fixação em gel e descoloração em gel
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278Coloração em gel
1 M NH4HCO3
(Bicarbonato de amônio)
 		Sigma-aldrich09830-500GGel hidratação &
Tampão de digestão
CH3CN
(Acetonitrila)		Sigma-aldrich34851-100MLGel desidratação &
Solução de dissolução de peptídeos
IAA
(ácido iodoacético)		Sigma-aldrichI4386-10GAgente alquilante
TFA
(ácido trifluoroacético)		Sigma-aldrich302031-10X1MLSolução de dissolução de peptídeos
FA
(ácido fórmico)		Sigma-aldrich06554-5GExtração de peptídeos
Solução de tripsina (6 ng/μ L)PromegaV5280Tampão de digestão
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EQUIPMENT
SoilPeltracomLP2DCrescimento vegetal
Vermiculita 3Sibli AS05VERMICULIETde crescimento vegetal
(150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500Suporte para suspensão de protoplasto
0,22 μ m filtroMilliporeSE2M229104Homogeneização da solução enzimática isotônica final
RazorbladeAgar ScientificT585Tiras de folhas de roseta
35-75 μ m malha de nylonSEFAR NITEX74010Protoplast suspensão filtração
50 mL tubos de fundo redondoSigma-aldrichT1918-10EACarrier para suspensão protoplast
Hemocitômetro
(Bü hemocitômetro rker)		MARIENFELD650030para contagem de células Protoplast

(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101in vivo Lâmpada UV de reticulação UV

(Sankyo-Denki G8T5)		SANKYO
DENKI		SD G8T5in vivo
Seringa de vidro de 50 mLFORTUNA OptimaZ314560Homogeneização do lisado de protoplasto
Agulha estreita (0,9 x 25 mm)Microlança Becton Dickinson 32021-04Homogeneização do lisado de protoplasto
Rotador Modelo L26Labinco BV26110912Incubação de amostras por rotação
de Oligo-d(T)25 esferas magnéticas
(5 mg/mL)		New England BioLabsS1419SmRNPs e mRNAs de ligação e
Rack magnéticosuspenso InvitrogenCS15000mRNPs e mRNAs de ligação e pull-down
Unidades de filtro centrífugo
(unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-4)		EMD MilliporeUFC800308concentração de mRBP
Pierce Silver Stain KitThermo Fisher Scientific24612de ensaio de coloração de prata

(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		purificação de RNAmolecular 1064100300 STRATEC
(Espectrofotômetro NanoDrop 1000)Qualidade e quantidade de RNAND-1000Thermo Fisher Scientific
Ciclador de PCR em tempo real
(StepOne Real-Time PCR cycler)		Thermo Fisher Scientific4376600quantificação de cDNA
µ-colunas C18
(Ponta Millipore Zip µ-Colunas C18)		purificação de peptídeosSigma-aldrich720046-960EA

(Espectrômetro de massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap)		Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRde proteômica baseada em espectrometria de massa
(instrumento de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC) Ultimate 3000)Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANOde proteômica baseada em espectrometria de massa

(coluna Easy Spray Pepmap RSLC C18)		Thermo Fisher ScientificES800Proteômica baseada em espectrometria de massa
C18 pré-coluna
(Pré-coluna Acclaim Pepmap 100 C18)		Thermo Fisher Scientific160321Proteômica baseada em espectrometria de massa
Nome EmpresaNúmero de catálogoComentários
Primers para ensaio qRT-PCRSequências
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
ensaio Placa de Petri Aparelho de reticulação UV de reticulação UV Kit de purificação de RNA Dispositivo de espectrofotômetro de da Espectrômetro de massa de Instrumento de cromatografia líquida Coluna C18

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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