Bypass cardiopulmonar em um modelo do rato: uma nova abordagem

Resumo

Este artigo descreve como realizar bypass cardiopulmonar em ratos. Este novo modelo facilitará a investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na lesão de órgão.

Resumo

Como extracorpórea prolongada torna-se mais essencial durante intervenções cardíacas, uma crescente demanda clínica surge para otimização do processo e para minimizar danos nos órgãos resultantes de circulação extracorporais prolongada. O objetivo deste trabalho foi demonstrar um modelo totalmente funcional e clinicamente relevante de bypass cardiopulmonar em um rato. Relatamos o dispositivo design, otimização do circuito de perfusão e técnicas microcirúrgicos. Este modelo é um modelo agudo, que não é compatível com a sobrevivência, devido à necessidade de vários desenhos de sangue. Devido a gama de ferramentas disponíveis para ratos (por exemplo, marcadores, nocautes, etc), este modelo facilitará a investigação sobre os mecanismos moleculares de danos nos órgãos e o efeito de bypass cardiopulmonar em relação a outros comorbidades.

Introdução

Desde a introdução do extracorpórea (CEC), para a clínica, ele tem desempenhado um papel essencial na cirurgia cardíaca¹. Na moderna cirurgia cardíaca, prolongado tempo de CEC é essencial para realizar procedimentos combinados e extensas reconstruções da aorta. Embora os avanços tecnológicos têm sido tremendos, o uso de circulação extracorporais é associado com intra e pós-operatória sistêmica e órgão local danificar^2,3.

Grandes modelos animais foram desenvolvidos para investigar o papel da CEC em processos fisiológicos^4,5. Embora estes modelos forneceu insights sobre alguns do CPB associada a complicações, eles são extremamente caros e ferramentas moleculares (por exemplo, anticorpos) são muito limitadas. Desenvolveu-se uma alternativa mais custo-eficiente em pequenos animais. Desde o seu desenvolvimento, vários estudos têm sido realizados para otimizar um modelo CPB em ratos e coelhos^5,6,7,8,9. Esses modelos fornecem uma boa base para medições de processos fisiopatológicos da doença; no entanto, eles são ainda insuficientes para investigar Imunologia celular e humoral, devido à falta de reagentes e anticorpos pertinentes. Isto prejudica o seu papel neste campo de pesquisa.

Recentemente desenvolvemos um modelo do rato do CPB. Devido a uma grande variedade de reagentes específicos de rato e camundongos geneticamente modificados, modelos de mouse são, em geral, o modelo de escolha para a pesquisa fisiológica, molecular e imunológico^10,11. Portanto, nosso modelo facilitará o estudo da CEC em relação a várias comorbidades, como existem muitas cepas de ratos disponíveis com doenças clinicamente relevante^12,13. Nesse sentido, este paper descreve, em detalhes, como executar CPB em camundongos. Oxigênio e parâmetros hemodinâmicos são monitorados de perto após a detenção de fundo respiratória e circulatória.

Protocolo

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com a lei alemã de proteção Animal (TierSchG) e foram aprovadas pelo Comitê de bem-estar dos animais locais (Baixa Saxônia Secretaria de defesa do consumidor e da segurança alimentar, protocolo TSA 14/1556). O peso mínimo de mouse apropriado para este modelo é de 25 g.

1. preparativos pré-operatório

Nota: todos os procedimentos são realizados sob condições limpas, não estéril, com instrumentos esterilizados.

1. Lugar 50-60 8 cm longo propileno oco fibras em paralelo em um tubo e se conectar com um adaptador T em ambos os lados. Preencher o espaço entre as fibras ocas e o ramo externo do adaptador em T com cola.
   1. Permitir pelo menos 24 h para a cola endurecer. Cortar as fibras ocas que se estendem do T-adaptador usando um micrótomo padrão e encostar o tubo do silicone para os sites de conexão.
2. Agulha 27G metal (a partir de um branule de 26G) Introduza uma cânula de poliuretano 2 Fr. Use uma lâmina cirúrgica e microtesoura sob um microscópio (ampliação de X 8-12), para fazer três ou quatro fenestrações de cerca de 0,15 cm cada dentro do terço distal da cânula para assegurar ideal venoso retorna fluxo.
   1. Remover o fio quando concluído. Use cotonetes para dissecção romba e retração de estruturas. Usar compressas de gaze (² de 5 x 5 cm) para absorver o excesso de líquido para evitar a desidratação do tecido.
3. Preparar o volume de escorva. Conclusão, adicione 30 UI de heparina por mL de solução e 2,5% v/v de uma solução de 8,4% de NaHCO ₃ para o buffer de escorva. Armazene esta solução a 4 ° C até usado.
4. Encher o circuito de CEC (ou seja,, bomba, caçador de ar, tubulação e ambas as cânulas) com solução de escorva µ l 850 através da cânula venosa. Uma vez preenchido, mantenha o CPB circular até que o animal está pronto para canulação.

2. Anestesia animal

1. para administrar anestesia, coloque o animal em uma câmara de indução abaixo dos 2,5% mistura de isoflurano/oxigênio v/v. Confirme a anestesia adequada avaliando o reflexo de retirada de pedal, reflexo de pitada de cauda e reflexo de piscar de olhos. Aplicar a pomada veterinária para evitar ressecamento do olho.
2. Colocar o animal sobre uma almofada de aquecimento com função de regulação de temperatura. Medir a temperatura do corpo com uma sonda inserida no reto e conectado ao sistema de aquisição de dados.
3. Após anestesia completa é alcançada, entubar o animal orotracheally usando um braunule de plástico de 20G, inseri-lo oralmente e empurrá-lo para a traqueia sob controle visual. Inicie ventilação mecânica usando um vaporizador de isoflurano, ligado a um ventilador de rato. Dependendo do peso do animal, ajustar a ventilação para que seja alcançado um volume tidal de 250-350 µ l.
4. Para garantir a completa analgesia, injetar carprofeno animais de peso corporal de 5 mg/kg por via subcutânea. É recomendável que a concentração de isoflurano ser mantido entre 1,3-2,5% de oxigênio. Concentração de isoflurano pode ser ajustada manualmente dependendo da fase do procedimento.

3. Procedimentos cirúrgicos

1. após intubação e anestesia completa é alcançada, realizar uma incisão de pele no pescoço com uma tesoura bem afiada, separe os músculos de forma contundente e expor o direito de veia jugular e carótida esquerda. Durante a preparação, coagular pequenos vasos usando um Coagulador veterinário ligado a pinça bipolar para garantir a perda de sangue mínima.
2. Após a preparação dos vasos jugular, cranialmente ligate do segmento distal da artéria carótida comum esquerda até sua bifurcação usando suturas de seda de 8-0.
3. Conectar-se a extremidade distal de uma cânula de 27 G para a tubagem de influxo arterial usando um conector de silicone (ID de 0,5 mm, 1 mm OD), deslizamento de sutura seda lugar 8-0 nós no segmento proximal da artéria e inserir a ponta da cânula na artéria carótida.
4. Após o correto posicionamento da ponta da cânula, avançar a ponta da cânula para que ela põe de 3 a 4 mm proximal para o arco aórtico. Fixar a ponta da cânula fixando com nodos seda 8-0.
5. Usando microcirúrgico fórceps e a tesoura, faz dissecação romba e afiada, expor a veia jugular direita por uma preparação sem corte de tecido lateralmente ao músculo esternocleidomastoideo, perto da clavícula e coloque um nó de seda de 8-0 na extremidade distal e um 8-0 laço na extremidade proximal.
6. Depois da ligadura da extremidade distal da veia jugular, coloque a ponta da cânula venosa na veia jugular certa e progresso para o átrio direito e fixá-lo com o nó de seda. Para retorno venoso ideal, pode ser necessário avançar a ponta venosa no ventrículo direito.
7. Uma vez que a posição correta da cânula é alcançada, realizar heparinização sistémica adicionando 2,5 UI de heparina por grama do peso do corpo animal através de injeção intravenosa direta na veia jugular.
8. Para monitorização de pressão invasiva em tempo real, Canule a artéria femoral esquerda. Expor a zona da virilha e suavemente separar a artéria femoral comum a veia femoral e o nervo femoral sob 25 ampliação X.
   1. Ligam a parte distal da artéria femoral. Temporariamente occlude a parte proximal com um deslizamento-nó e faça uma pequena incisão na parede anterior usando microfórceps.
   2. Depois, introduza uma cânula de poliuretano 1 Fr na artéria femoral e fixe-o com uma seda sutura de 10-0. Esta cânula é usada para extrair amostras de sangue para gasometria arterial.
9. Após a colocação do sucesso das cânulas arteriais e venosas, iniciar extracorpórea por ligar a bomba. O tempo de intubação para arranque do CPB é aproximadamente 45 min. iniciar usando uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, dependendo as medições da pressão sistêmica e aumento do fluxo sanguíneo dentro de 2 min para o fluxo total (4-6 mL/min), aumentando a velocidade da bomba.
10. Sob monitoramento completo, para executar uma esternotomia superior usando a tesoura afiada, a partir do manúbrio e indo 5 mm na direção caudal. Coagular as bordas esternais imediatamente para evitar sangramento. Expor o arco aórtico, puxando a artéria carótida direita em direção cranial.
11. Controle ótimo, circunferencialmente gratuitamente o arco aórtico do Timo e do tecido circundante, para facilitar a fixação. Coloque um laço de seda de 8-0 em torno da aorta ascendente. Para colocar a braçadeira transversal para cardioplegia, puxe o laço de seda na direção cranial para expor melhor a aorta ascendente.

4. Bypass cardiopulmonar e gasometria arterial

1. para gasometria arterial (BGA), usar tubos capilares de vidro para coletar sangue arterial de 60-90 µ l através do cateter de artéria femoral.
   1. Usar uma pinça pequena do tubo do silicone e retire o tubo do cateter. Liberar a pressão lentamente sobre a mordaça para permitir o enchimento controlado do tubo capilar.
   2. Reanexar o tubo do silicone para o cateter. Inserir os tubos capilares o analisador de gás do sangue para medições nos seguintes pontos tempo:
      10 min após início da CEC com ventilação (BGA1)
      após 25 min de CEC e a 15 min de parada respiratória (BGA2)
      após 40 min de CEC e 30 min de parada respiratória (BGA3)
      após 55 min de CEC, 45 min de respiratória e 20 min de parada cardíaca (BGA4)
2. sob fluxo estável do CPB, initia parada respiratória te parando ventilação.
3. Após o término da ventilação, conjunto a almofada de aquecimento para 28 ° c e começar a refrigeração topicamente o animal à temperatura de 28 º c dentro o primeiro 20 min de parada respiratória, usando gaze embebida em soro fisiológico frio.
4. Uma vez atingida uma temperatura de 28 º c e depois de um total de 30 min de parada respiratória, administrar 0,3 mL de solução de KCl de 7,45% no circuito CPB para iniciar cardioplégica.
5. Para cruzar o aperto da aorta, puxe o laço de seda previamente colocado (etapa 3.10) na direção cranial para melhor exposição e coloque uma pinça de micro-serrefine na parte ascendente da aorta.
6. Realizar um total de 60 min de parada respiratória e 30 min de parada cardíaca. Retire o grampo de micro-serrefine para iniciar a reperfusão do coração, a aorta ascendente. Simultaneamente, re-ventilar e aquecer o animal a 37 ° C.
7. Após a reperfusão é concluída e o animal chegou a normotermia, encerrar o CPB, desligando a bomba e continuar a monitorar medidas fisiológicas (por exemplo, a temperatura do corpo, ECG e pressão arterial invasiva) por 20 min.
8. No final do experimento, extrair sangue do animal sob anestesia completa (5% de isoflurano) e coletar sangue e órgãos para ainda mais análise ¹⁴.

Resultados

Este protocolo descreve o circuito de perfusão, procedimentos cirúrgicos e monitoramento de parâmetros fisiológicos durante a CEC de um rato. Quando realizada por um micro-cirurgião adequadamente qualificado, os resultados são consistentemente e reproducibly obtidos.

Para manter a perfusão adequada do tecido, a pressão arterial média é sempre mantida entre 40 e 60 mmHg, ajustando o fluxo de sangue do CPB e adicionando de volume ...

Discussão

Nós desenvolvemos um modelo clinicamente relevante pleno funcionamento da CEC em um rato. Com mais de 30 cepas de ratos a ter doenças cardiovasculares, nosso modelo poderia ser um ponto de partida para o desenvolvimento de novos protocolos potenciais relacionados à CEC. Além disso, devido a infinidade de reagentes específicos de rato e camundongos nocaute-para fora, este modelo não pode apenas substituir o actual modelo de rato da CEC, mas irá facilitar a dissecação dos mecanismos moleculares envolvidos em danos nos órgã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	volume de escorva, 1:1 com Tetraspan
Tetraspan 6% HES Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	volume de escorva, 1:1 com Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 UI por ml de solução de escorva
NaHCO3 Solução a 8,4%	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% em solução de primer
KCL 7,45% Solução	B. Braun Melsungen AG	PZN: 2418577	0,1 mL para cardioplegia
Carprofeno	Zoetis Inc., EUA	PZN: 00289615 08859153	5 mg / kg / BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., EUA	C10PU-MCA1301	artéria carótida
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., EUA	C20PU-MJV1302	veia jugular
Vasofix Cateter de segurança 20G	B.Braun Medical	4268113S-01	intubação orotraqueal
8-0 Sutura de seda trançada	Ashaway Line & Twine Mfg. Co., EUA	75290	ligadura
Isoflurano	Piramal Critical Care Deutschland GmbH	PZN:9714675	narcose
CLINITUBES capilares sanguíneos	Radiomed GmbH	51750132	amostragem de sangue 60 - 95 microlitros
Tesoura de mola - lâminas de 6 mm	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instrumentos
Tesoura de mola - lâminas de 2 mm	Ferramentas de ciência fina Instrumentos de GmbH	15000-03
Ferramentas	Fine Science GmbH	13009-12
Instrumentos de Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51
Porta-agulhas Castroviejo Micro - 9cm	Ferramentas de Belas Ciências GmbH	12060-02	instrumentos
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	Instrumentos
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instrumentos
MiniVent Ventilador para Ratos (Modelo 845)	Harvard Apparatus	73-0044	ventilação mecânica
Vaporizador de isoflurano Drager 19.1	Drä gerwerk AG & Co. KGaA		anestesia 1,3 - 2,5%
Dispositivo de aquisição de dados PowerLab 4/35	ADInstruments Ltd, Nova Zelândia	PL3504	pressão invasiva, ECG, temperatura
ABL 800 Flex	Radiometer GmbH		análise de gases sanguíneos
NMRI camundongos	Charles River Laboratories	Crl:NMRI(Han)	macho, 30 - 35 g, 12 semanas de idade, alojado pelo menos 1 semana antes do experimento

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