Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

Resumo

Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.

Resumo

Linfócitos B são jogadores-chave na circulação de células imunes e eles principalmente para casa e residam em órgãos linfoides. Enquanto as células B normais só proliferam quando estimulados por linfócitos T, oncogênicas células B sobrevivem e expandir-se autonomamente em nichos de órgão indefinido. Linfoma de células do manto (MCL) é uma tal distúrbio de células B, onde a taxa de sobrevida mediana dos pacientes é de 4-5 anos. Isso exige a necessidade de mecanismos eficazes, pelos quais o homing e enxertia dessas células são bloqueados a fim de aumentar a sobrevivência e longevidade dos pacientes. Portanto, o esforço para desenvolver um modelo do rato de enxerto para estudar a eficácia da terapêutica MCL, bloqueando o localizador mecanismo na vivo é de extrema importância. Desenvolvimento de animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito ter sido exercida, como modelos de rato pré-clínicos relevantes são cruciais para novos agentes terapêuticos de tela. Este modelo animal é desenvolvido para evitar a rejeição do enxerto humano e estabelecer um modelo para doenças humanas, e pode ser uma ferramenta extremamente útil para estudar a progressão da doença de tipos diferentes de linfoma e executar testes pré-clínicos de drogas de candidato para malignidades hematológicas, como MCL. Estabelecemos um modelo do rato de enxerto heterólogo que irá servir como um excelente recurso para estudar e desenvolver novas abordagens terapêuticas para MCL.

Introdução

Linfócitos por natureza desempenham um papel importante na vigilância imune, e tráfico de linfócitos é um passo fundamental na montagem do antígeno imunidade específica^1,2. Este processo inclui a migração de ingênuo T linfócitos do timo para o fluxo de sangue e de lá para os órgãos linfoides secundários, incluindo os gânglios linfáticos, de Peyer ou baço, onde se encontram os antígenos cognatos. Os linfócitos B diferenciam na medula óssea e migram como ingênuo células em folículos de órgãos linfoides secundários³. Algumas dessas células B vincular o antígeno com o receptor e são ativadas por células T específicas. Proliferação e diferenciação dessas células B empurra as células ingênua B não está ativado, para a zona do manto do folículo. Células ativadas podem diferenciar na memória B células, que patrulham o corpo, ou maduro em imunoglobulinas secretoras células plasmáticas que migram para a medula óssea⁴.

MCL ocorre quando linfócitos ingênua B na zona de manto transformam em um tumor. Estas células do linfoma residem no microambiente dos órgãos linfoides e proliferaram independentemente do controle específico dos linfócitos T. No entanto, em uma determinada fase de densidade escapar deste nicho e recircular na corrente sanguínea em busca de nichos em outros órgãos. Considerando a complexidade das moléculas de adesão e a promiscuidade de quimiocinas e seus receptores, o mecanismo desse celular de tráfico na vivo é mal compreendido e, portanto, dificulta a terapia. Novos métodos são necessários para efetivamente bloquear este processo de migração para impedir que as células do linfoma B atingindo novos microambiente.

MCL é uma das mais difíceis de tratar tumores malignos de células B. O desenvolvimento de um fenótipo neoplásico de MCL é o resultado de uma cascata de várias etapas, caracterizada pela aquisição de propriedades biológicas únicas. No momento do diagnóstico, a maioria dos pacientes (70%) já está presente com uma doença disseminada, com a maioria dos casos, exibindo o envolvimento extranodal no baço, medula óssea e/ou o trato gastrointestinal^5,6. Em pacientes tratados, recaída por tumores resistentes dentro de alguns anos é comum, mesmo que a quimioterapia convencional induz a taxas de remissão de alta no curto prazo^7,8. Aqui nós apresentamos um novo modelo de doença que pode ajudar a entender a divulgação MCL e sua biologia subjacente: estabelecemos um humano MCL xenoenxertos rato modelo que originou as células do tumor primário dos pacientes. Esperamos que este modelo vai ajudar a desenvolver estratégias terapêuticas contra divulgação de MCL e possivelmente proporcionar novas perspectivas clínicas para melhor diagnóstico e tratamento dos pacientes recaíram.

Protocolo

As amostras de sangue humano foram utilizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo local de ética e comissões de experimentação humana do Hospital da Universidade de Genebra.

Animais procedimentos foram realizados em conformidade com o institucional ética Comissão de cuidado Animal em Genebra, na Suíça e o veterinário cantonais (número de autorização: GE/26/15).

1. preparação de células mononucleares do sangue periférico primário (PBMC) pela separação de gradiente de densidade

Nota: obteve-se 3-5 mL de sangue periférico de pacientes que apresentam com MCL numa fase leucêmicas. O diagnóstico foi estabelecido de acordo com critérios de diagnósticos por citometria de fluxo (CD5 +, CD23−, CD200 +, população monoclonal de células B) e posteriormente confirmado pela presença de t(11;14) a translocação cromossômica e superexpressão de ciclina D1. Em todos os casos, o anticorpo monoclonal de células B constituíam para > 90% da população total de células B. As células restantes foram principalmente monócitos e algumas células T.

1. Diluído (1:1) 5 mL de amostra de sangue do MCL com 5 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).
2. Inverta os meios de comunicação de gradiente de densidade (Tabela de materiais) várias vezes antes do uso para assegurar uma mistura completa.
3. Adicione 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 15 mL usando um aspirador pipeta.
4. Suavemente da camada da amostra de sangue diluído sobre a mídia de gradiente de densidade no tubo de centrífuga de 15 mL, usando um aspirador (o sangue a relação da mídia gradiente de densidade deve ser 2:1, por exemplo, 10 mL de sangue com 5 mL de mídia gradiente de densidade). Deve ter cuidado para não misturar as duas camadas (figura 1B, C).
5. Centrifugar a amostra a 400 x g, durante 40 min à temperatura ambiente com os freios de centrífuga desligados.
6. Delicadamente, usando uma pipeta Pasteur estéril, Aspire a camada média (esbranquiçado, fino anel marcado com uma seta (Figura 1, E)) que contém as células mononucleares e transferi-los para um tubo limpo.
7. Lavagem de células mononucleares
   1. Estimar o volume da suspensão celular transferidos e adicione-lhe 3 volumes de estéril 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% albumina de soro bovino (BSA).
   2. Misture a suspensão pipetando subindo e descendo várias vezes.
   3. Centrifugar a suspensão de 400-500 x g durante 10-15 min à temperatura ambiente.
   4. Desprezar o sobrenadante para obter o centrifugado e repetir a etapa de lavagem.
   5. Remover o sobrenadante e ressuspender as células no volume desejado, por exemplo, 1 ou 2 mL de PBS.
   6. Conte o número de células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer (câmara de Neubauer).

2. enriquecimento de células B por células B seleção negativa

1. Dilua as células em PBS para uma concentração final de 50 x 10⁶ células/mL.
2. Transferi as células para um 5 mL redonda poliestireno tubo inferior. Adicione 100 µ l de anticorpo cocktail do kit do enriquecimento da célula B a 2 mL de suspensão de células e misture suavemente pipetando acima e para baixo (Figura 2-1).
3. Incube as celulas em temperatura ambiente por 10 min.
4. Brevemente vórtice partículas magnéticas fornecido no kit do enriquecimento de células B por 30 s (Figura 2-2). Adicione 150 µ l das partículas magnéticas a 2 mL da amostra.
5. Incube a amostra por mais 5 min à temperatura ambiente.
6. Trazer o volume da amostra de 2,5 mL com 1X PBS contendo 2% de soro de vitela fetal (FCS) e o ácido 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Colocar o tubo no imã e incubar o tubo por outro 3-5 min (Figura 2-3).
7. Pegue o ímã com o tubo no lugar e em um movimento contínuo, decantar o tubo para que a suspensão de eritrócitos enriquecido é coletada em um tubo fresco (Figura 2-4). Conte as células por um contador de célula automática ou manualmente usando um hemocytometer para obter o rendimento total de células B.
   Nota: Normalmente, o rendimento é de 10 ~⁵ B células/mL para o normal de células B e 5-50 x 10⁶ células/mL para MCL.
8. Confirmando a pureza do enriquecimento da célula B
   1. Leve ~ 50.000 células e incubar as células com anticorpos anti-CD19/CD20 (01:20 diluição) e anticorpo anti-CD45 acoplado ao fluorochromes diferentes (01:10 diluição) à temperatura ambiente por 15-30 min.
   2. Lavar com 1 mL de 1X PBS + 1% de BSA, Centrifugar as células a 400-500 x g por 5 min e ressuspender as células em ~ 200 µ l de PBS.
   3. Adquirir as amostras de células por citometria de fluxo e analisar para a pureza das células B. A pureza é principalmente > 90% por esse método (Figura 3).

3. desenvolvimento do modelo de Mouse de enxerto heterólogo

1. Suspenda ~ 40-60 x 10⁶ células em 150-200 µ l de PBS 1x (volume necessário para injetar por rato).
2. Injetar 150 µ l de suspensão de células por via intravenosa (i.v.) em cada veia da cauda de camundongos imunodeficientes 6-7 semanas da gama (NSG) do scid NOD independentemente do gênero (Figura 4A).
3. Permitir que os ratos desenvolver linfoma humana para ~ 10 semanas.
   Nota: Células do linfoma primário de humano leva muito mais tempo para desenvolver o tumor, em comparação com linhas de células do linfoma humano (~ 3 semanas).
4. Quando os animais começam a apresentar sintomas de doença fatal, como a perda de peso, cabelo babado, paralisia dos membros posteriores, diminuição da atividade, etc., sacrificar os ratos por CO₂ asfixia seguida por punção cardíaca coração para obter sangue.
5. Coletamos diferentes órgãos como a medula óssea, baço e fígado dissecando os ratos e coletar sangue periférico por sangue de desenho do coração no momento do sacrifício para análise de enxertia do tumor (Figura 4B -F).

4. quimerismo análise de células de Tumor incorporada em diferentes órgãos

1. Depois de coletar os diferentes órgãos, processá-los por ruptura mecânica para gerar suspensões única célula após a lise de células vermelhas do sangue (RBC) usando 200 µ l de tampão de potássio de cloreto de amónio 1x para o sangue e medula óssea, 500 µ l para o baço e 2 mL para o fígado .
2. Contar e mancha as células usando anticorpos específicos de célula B humana, ou seja, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45.
   Nota: Ratos NSG carecem de células B e, portanto, para análise, células estão manchadas com marcadores de célula B específico humana.
3. Analise as células derivadas de cada órgão, por citometria de fluxo, por retenção de células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
4. Quantificar as células do tumor engrafted em diferentes órgãos derivados de ratos MCL injetado baseados em células fechadas conforme indicado no passo 4.3 (Figura 4).
   Nota: Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes.

Resultados

O manuscrito descreve um protocolo otimizado para o desenvolvimento bem sucedido de um modelo de mouse de enxerto para enxertia das células MCL. Preparação de uma população celular puro (en este caso MCL células), é muito crítico para desenvolver bem sucedidas xenografts MCL. A Figura 1 representa as etapas preparativa para isolamento de células mononucleares do sangue do paciente MCL pela separação de gradiente de densidade. As células mononucleares são tran...

Discussão

Ensaios clínicos são possíveis para drogas que estão em um estágio avançado de desenvolvimento, mas não podem ser usadas para a descoberta de medicamentos. Os esforços para desenvolver animais destinatários para xenotransplante de células humanas para testar drogas cedo do palco há muito tem sido exercidos. Aqui nós apresentamos um modelo animal que evita a rejeição do enxerto humano e pode estabelecer um modelo para doenças humanas, tais como MCL. Este é actualmente um modelo de transplante do estado da arte para estuda...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meios Ficoll-paque	GE Healthcare	17-1440-02	para separação de células mononucleares
Meio RPMI 1640	Tecnologias Gibco-Life	61870-010	para diluição de amostra de sangue
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	lavagem de células
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A8412	para preparação de PBS com 1% BSA usado na lavagem de células durante o isolamento
CD19-APC700	Beckman Coulter	B49212	marcador de célula pan-B humana
CD20-APC	Beckman Coulter	A21693	marcador de célula pan-B humana
CD20-ECD	Beckman Coulter	IM3607	marcador de célula pan-B humana
CD5-PC 5.5	Beckman Coulter	PN A70203	marcador
CD23-PE	Pharmingen	555711	Proteína de superfície celular tipicamente ausente no MCL
CD45 KO	Beckman Coulter	B36294	Marcador de pan-leucócitos
CD200-PE	Pharmingen	552475	Proteína de superfície celular tipicamente ausente em
camundongos MCL NOD scid gama (NSG)	Charles River Laboratories	5557	usado para desenvolver xenoenxertos MCL neste estudo
Kit de enriquecimento de células B humanas de fácil separação	Tecnologias de células-tronco	19054	usadas para enriquecer células B para obter células puras para injeção em camundongos
FACS	Beckman Coulter	Navios	usado para caracterizar a amostra MCL e estudar os órgãos para enxerto MCL
1X tampão de potássio cloreto de amônio tampão			lise de sangue vermelho (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2· 2H2O 3,722 mg/l )

de célula T humana de