Artigo de método

Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

7.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56028

⸱

8 de março de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College

Neste artigo

Resumo

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

Resumo

Como um estado funcional da microcirculação, vasomotion microvascular é importante para a entrega de oxigênio e nutrientes e a remoção de dióxido de carbono e resíduos de produtos. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser um passo crucial no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação. Além disso, a ilhota pancreatic altamente vascularizada é adaptada para suportar a função endócrina. A este respeito, parece-me possível inferir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função da ilhota pancreática. Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições que microcirculação ilhota pancreatic faz a doenças relacionadas, tais como diabetes mellitus, pancreatite, etc. Portanto, este protocolo descreve como usar um monitor de fluxo do laser Doppler sangue para determinar o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion e para estabelecer parâmetros (incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência e parente velocidade de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion) para avaliação do status funcional microcirculatory. Em um modelo do rato de diabéticos induzido por estreptozotocina, observamos um estado funcional prejudicado de ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular. Em conclusão, esta abordagem para avaliar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo pode revelar os mecanismos relacionados com doenças de ilhotas pancreáticas.

Introdução

Como um parâmetro da situação funcional da microcirculação, microvascular vasomotion assume a responsabilidade para a entrega e a troca de oxigênio, nutrientes e hormônios e é fundamental para a remoção de produtos metabólicos, tais como o dióxido de carbono e resíduos de célula 1. vasomotion microvascular também regula a distribuição do fluxo de sangue e perfusão do tecido, afectando assim a pressão de sangue microcirculatory local e respostas à inflamação, que pode induzir a edema em muitas doenças. Portanto, vasomotion microvascular é extremamente importante para manter a função fisiológica do componente de células, tecidos e órgãos,2,3,4. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser uma das principais etapas no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação5.

Laser Doppler foi desenvolvido inicialmente para observação e quantificação no campo da microcirculação investigação6. Esta técnica, juntamente com outras abordagens técnicas (por exemplo, laser speckle7, oxigênio transcutâneo, etc.), tem sido considerada como o padrão ouro para avaliar o fluxo sanguíneo na microcirculação. A lógica que a perfusão sanguínea de microcirculação local (i.e., capilares, arteríolas, vênulas, etc) pode ser determinado pelos aparelhos equipados com laser Doppler, baseia-se o princípio de efeito Doppler. O comprimento de onda e a frequência da emissão estimulada de luz mudam quando partículas de luz encontram células do sangue em movimento em microvessels, ou permanecem inalterados. Portanto, na microcirculação, o número e a velocidade das células do sangue são os fatores-chave relacionados com a magnitude e a distribuição de frequência da luz Doppler-deslocados, enquanto a direção do fluxo sanguíneo microvascular é irrelevante. Usando métodos diferentes, uma variedade de tecidos têm sido utilizados para estudos microcirculatory, incluindo os mesenteries e dorsal câmaras dobras cutâneas de camundongos, ratos, hamsters e até mesmo os humanos8. No entanto, no actual protocolo, focalizamos o funcional status de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion, que é avaliada usando laser Doppler e um sistema de parâmetro de avaliação caseiro.

Microcirculação do pâncreas ilhéu é composta principalmente por microvessels de ilhotas pancreáticas e apresenta características distintivas. Uma rede capilar de ilhotas pancreáticas mostra uma densidade cinco vezes maior do que a rede capilar de sua contraparte exócrino9. Fornecendo um conduíte para a entrega da entrada de glicose e insulina divulgação, células endoteliais ilhéu entregam oxigênio às células metabolicamente ativas no Ilhéu células β. Além disso, também emergentes evidências demonstra que o ilhéu microvessels estão envolvidos não só na regulação da expressão do gene de insulina e células β-sobrevivência, mas também em afetar a função da célula β; promover a proliferação de células β; e produzir um número de angiogênico vasoativas, substâncias e fatores de crescimento10. Portanto, a este respeito, podemos concluir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função de células β ilhéu e envolver-se na patogênese de doenças como a pancreatite aguda/crónica, diabetes e outros doenças relacionadas com o pâncreas.

Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para as doenças mencionadas acima. Um procedimento passo a passo detalhado descrevendo a abordagem para determinar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo fornecer aqui. Medições típicas então são mostradas nos Resultados de representante. Finalmente, os benefícios e limitações do método são destacadas na discussão, juntamente com outras aplicações.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e órgãos reguladores. O presente protocolo sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do Instituto da microcirculação Animal ética Comissão (IMAEC) na faculdade médica da União (PUMC) a Pequim.

1. os animais

  1. Antes do início do experimento, manter três camundongos BALB/c por gaiola, com temperatura controlada (24 ± 1 ° C) e umidade (55 ± 5%), sob um ciclo claro-escuro de 12-h. Permitir que os ratos livre acesso à água e comida normal.
  2. Aleatoriamente, divida os ratos em um grupo controle de não-diabéticos e um grupo de diabético. Com precisão pesar cada rato individual e calcular o volume de injeção usando a massa corporal de cada rato.
  3. Depressa os ratos por 4h antes da injeção de estreptozotocina (STZ) e fornecer água regular como normal no dia experimental 1.
  4. Prepare o tampão de citrato de sódio 0,1 M em pH 4.3. Colocar 1 mL da solução num tubo de 1,5 mL microcentrifuga e enrolar o tubo microcentrifuga em papel de alumínio para evitar a exposição à luz.
  5. Dissolva o STZ em tampão de citrato de sódio (pH 4,3) a uma concentração final de trabalho de 5 mg/mL antes da utilização.
  6. Dê os ratos das injeções intraperitoneal grupo diabético de STZ na dose de 40 mg/kg, usando uma seringa de 1 mL e uma agulha 25-G. Injete os ratos do controle não-diabéticos com o mesmo volume de tampão citrato de sódio (pH 4,3).
  7. Repor os ratos em jaulas e fornecê-los com 10% de sacarose água e comida normal.
  8. Repita as etapas de 1,3-1,7 na experimentais dias 2 a 5 (ou seja, os próximos 4 dias consecutivos).
  9. Substitua a água de 10% de sacarose com água normal após a última injecção de STZ.
  10. Rápido, os ratos para 6 h, mas dar-lhes livre acesso à água e medir seus níveis de glicose do sangue, nove dias depois (experimental dia 14). Recolha uma amostra de sangue da veia cauda para confirmar a hiperglicemia usando um sistema de monitoramento de glicose de sangue.
    Nota: Os ratos com sangue os níveis de glicose > 200 mg / dL são considerados diabéticos.

2. preparação do instrumento

  1. Limpe as superfícies ópticas da ponta da sonda e o conector da sonda do aparelho Doppler laser com um pano não abrasivo para remover qualquer poeira ou partículas. Conecte o cabo na porta do instrumento (figura 1A).
  2. Monte o suporte de calibração, permitindo o fluxo padrão para estar em equilíbrio térmico com o ambiente experimental (temperatura ambiente, geralmente por 30 min). Agitar o fluxo padrão suavemente durante 10 s e deixá-lo descansar por 2 min.
  3. Posicione o contêiner padrão de fluxo no meio da base de calibração. Ajustar a braçadeira para a altura máxima e fixar a sonda na mordaça tal que aponta para baixo para o recipiente. Certifique-se que o padrão de fluxo está corretamente posicionado debaixo da sonda.
  4. Mova lentamente a sonda para baixo até que a ponta está submersa corretamente na norma de fluxo. Selecione e pressione "calibragem" do laser Doppler aparelhos e escolher o canal de trabalho que a sonda é conectada. Execute o programa de calibração até um aviso de "Calibração bem sucedida" é exibido na tela do laser Doppler aparelho.
  5. Fixe a sonda utilizando suportes de sonda. Manualmente, fixe a sonda para evitar o movimento.
  6. Manter a sala experimental, a temperatura constante (24 ± 1 ° C) e umidade (~ 50-60%).
  7. Desligue qualquer luz externa (tais como lâmpadas fluorescentes e local) antes de realizar o experimento para evitar mudança induzida por luz externa.

3. preparação dos animais

  1. Autoclave a cirúrgica instrumentos e deixe-as arrefecer à temperatura ambiente antes do uso.
  2. Dê os ratos 10 min para aclimatar o ambiente experimental antes detectando ilhota pancreatic microvascular vasomotion pelo laser Doppler.
  3. Encha uma seringa de 1 mL com 1 mL de 3% de pentobarbital de sódio. Injecte a solução de pentobarbital de sódio (75 mg/kg, i.p.) para anestesiar os ratos.
  4. Cubra os olhos do rato com gaze médica pré-umedecidos para evitar ressecamento.
  5. Garantir que o rato perde completamente a consciência e já não responde a cauda ou retropé pitadas com fórceps. Monitore a anestesia durante todo o evento anestésica e intra-operatório cada 15 min. manter a anestesia, completando com 10% do volume inicial de injeção da solução de pentobarbital quando necessário.
  6. Coloque uma almofada de aquecimento com uma camada semi isolante abaixo do animal e coloque o animal em posição supina e transferi-lo para a estação de trabalho do laser Doppler aparelho. Corrigi o mouse para a plataforma de trabalho com fita cirúrgica.
  7. Cotonete da pele abdominal do mouse com betadine e em seguida etanol 75% é usado para limpar a área abdominal limpo.
  8. 2% lidocaine/0.5% bupivacaína (50/50) mistura Injecte por via subcutânea.  Cortar um ~ 3 cm-furo de diâmetro no centro de uma compressa de gaze. Cobrir a região abdominal com a compressa de gaze.
  9. Levante a pele abdominal com fórceps e fazer uma incisão vertical inicial ao longo da linha mediana do abdômen, usando uma tesoura, bisturi ou pele.
  10. Segure o músculo subjacente com fórceps e incise para entrar na cavidade abdominal. Não feri nenhum órgão. Dobre a pele e o músculo subjacente no peito para revelar o interior da cavidade abdominal. Delicadamente, expor o corpo do pâncreas e do baço, usando um par de pinças nariz sem corte.

4. dados aquisição para análise

  1. Executar o software do aparelho laser Doppler clicando em "Arquivo" → "Novo" para criar um novo arquivo de medição. Para configurar os monitores conectados, sob a guia "Geral", configurar a monitoramento de duração para "Graça executar." Use o padrão de fábrica para a guia "LDF Monitor" clique em "Next".
  2. Configurar o display gráfico em "Exibir caixa de diálogo configuração." Selecione os canais de "Velocidade de fluxo, Conc," verificando as respectivas caixas. Selecione os seguintes parâmetros: "Fonte de dados para o canal" e "rótulo, unidades e cor." Clique em "Next".
  3. Inserir informações de usuário sobre o assunto e medição (i.e., nome e número de assunto, operador, monitoramento de tempo, comentários, etc.) no "arquivo caixa de diálogo informações" e clique em "Next" para concluir a configuração de medição.
    Nota: Uma janela de medição é criada automaticamente pelo software (figura 1B).
  4. Manualmente, avança o eletrodo para o pâncreas. Certifique-se que a distância entre as sonda e pâncreas tecidos é dentro de 1 mm. Uma distância inadequada dá uma leitura do fluxo de sangue artificialmente aumentada ou diminuída.
  5. Clique no ícone de barra de ferramentas "Iniciar" para começar a gravar os dados de unidades (PU) de perfusão microvascular sangue. Colete os dados de PU continuamente por 1 min cada execução. Clique em "Stop" para parar a medição. Selecione "Arquivo" → "Salvar como" ao nome e salve o arquivo de medições acabado.
  6. Manualmente, reposicionar a sonda após cada corrida para evitar efeitos aditivos e a exaustão localizada de contrátil e capacidade de relaxamento. Repita as etapas de 4,1-4,4 para colher dados de PU microvasculares multi-ponto (ou seja, três pontos aleatoriamente escolhidos de tecido pancreático) para cada rato. Medir os dados do plutônio de uma placa não-reflexivo como um controle de linha de base.
  7. Feche a camada muscular abdominal e a camada de pele com uma sutura. Coloque os animais em gaiolas limpas após os experimentos.
  8. Manter o animal morno colocando a gaiola de recuperação meio-sobre a almofada de aquecimento.
    Nota: Preste atenção ao calor, higiene, fluido e ingestão de alimentos e infecção. Administra os ratos com 2 mg/kg de carprofeno por 48 h como dor pós-operatória.  Realizar eutanásia pela injeção i.p. de pentobarbital de sódio de 150 mg/kg, quando os ratos são observados em um estado de dor ou sofrimento que não pode ser aliviado.

5. calcular os parâmetros de Vasomotion Microvascular

  1. Use o comando "Export" do laser Doppler software para exportar o tempo e dados brutos do plutônio como um arquivo *. xlsx e abra o arquivo em uma planilha.
  2. Calcular a unidade de perfusão de base média (PUb) (consulte a etapa 4.6).
  3. Calcular a média de sangue da perfusão (PUum) por 1 min de uma medição da seguinte forma: média de perfusão sanguínea (PUum) = PU - PUb (equação 1).
  4. Calcule a frequência (ciclos/min), para cada 1 min de medição.
    Nota: A frequência de vasomotion microvascular é definida como o número de picos que ocorreu em uma onda de vasomotion microvascular por minuto.
  5. Calcule a amplitude (ΔPU) para cada 1 min de medição.
    1. Calcular a amplitude de vasomotion microvascular como a diferença entre o máximo (PUmáx) e mínimo (PUmin): Amplitude (ΔPU) = PUmáx - PUmin (equação 2).
  6. Calcule a velocidade relativa (PU) para cada 1 min de medição.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Uma fotografia do laser vasomotion microvascular medição Doppler aparelhos equipados com um diodo semicondutor é mostrada na figura 1A. Software de interface do usuário é apresentado na figura 1B. Usando o método acima mencionado, os parâmetros hemodinâmicos de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foram detectados para controle de não-diabéticos e ratos diabéticos. Uma variedade de técnicas, incluindo laser Doppler flowm...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Nos casos que envolvem disfunção microvascular (por exemplo, diabetes, pancreatite aguda, doenças microvasculares periféricas, etc.), algumas doenças levam à redução do fluxo sanguíneo. Para além de alterações no fluxo sanguíneo, existem indicadores importantes, tais como vasomotion microvascular, que espelham o estado funcional da microcirculação. O indicador específico, vasomotion microvascular, geralmente é definido como a oscilação do Tom em camas microvasculares microvascular. O protocolo atual, um...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por doações de Peking Union Medical faculdade juventude fundo e os fundos de pesquisa Fundamental para as universidades Central (Grant no. 3332015200).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MoorVMS-LDF2Moor InstrumentsGI80PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) pode ser usado como um aparelho alternativo para coletar dados
MoorVMS-PC SoftwareMoor InstrumentsGI80-1Software de MoorVMS-LDF2
Suporte de calibraçãoMoor InstrumentsGI-calFerramenta de calibração
Base de calibraçãoMoor InstrumentsGI-calFerramenta de calibração
Fluxo de calibração padrãoMoor InstrumentsGI-calFerramenta de calibração
One Touch UltraEasy glucometerJohnson and Johnson#1955685Confirmar hiperglicemia
One Touch UltraEasy tirasJohnson and Johnson#1297006Confirmar hiperglicemia
EstreptozotocinaSigma-AldrichS0130Dissolver em tampão citrato de sódio (pH 4,3)
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichP3761Concentração de trabalho 3
EtanolSinopharm Inc.200121Concentração de trabalho 75%
SacaroseAmresco335Concentração de trabalho 10%
Gaze médicaChina Health Materials Co.S-7112Pinça cirúrgica
ponta rombaShang Hai Surgical Instruments Inc.N-551Fitas
cirúrgicas3M Company3664CUEsponja
gazeFu Kang Sen Medical Device CO.BB5447
Bisturi CirúrgicoYu Lin Instrumentos Cirúrgicos Inc.cirúrgicade pele 175C
Carent255-17
SuturaNing Bo Surgical Instruments Inc.3325-77Seringa Cirúrgica
e Agulha 25-GMISAWA Inc.3731-2011Escala: 1 ml
% de de cirúrgica Tesoura cirúrgica

Referências

  1. Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
  2. Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  3. Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
  4. Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301(2008).
  5. De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
  6. Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
  7. Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
  8. Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
  9. Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
  10. Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
  11. de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
  12. Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
  13. Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
  14. Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
  15. Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
  16. Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
  17. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
  18. Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
  19. Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
  20. Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
  21. Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
  22. Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
  23. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
  24. Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Perfus o Sangu neaDiabetes Induzida por STZMonitoramento de FluxoAn lise de Vasomo oImagem In VivoAvalia o da Microcircula oFluxo Sangu neo Pancre tico

Artigos relacionados