Descrevemos um método baseado em HPLC para a determinação de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico em fígado e leite de rato.
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Artigo de método
Determinação de ácidos sialic em amostras de fígado e leite de tipo selvagem e
Neste artigo
Resumo
Resumo
A CMAH (hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico) é responsável pela oxidação de ácidos citidina monofosfato-N-acetilneuraminico em mamíferos. No entanto, os seres humanos não podem oxidar o ácido monofosfato-N-acetilneuramínico da citidina para o ácido monofosfato-N-glicolneuraminico de citidina devido a uma deleção primária de exão do gene CMAH . Para entender os efeitos e as implicações da falta de atividade do CMAH com mais detalhes, um modelo de nocaute Cmah em camundongos é de grande interesse na pesquisa básica e aplicada. O método de análise para determinar o fenótipo deste modelo de rato é aqui descrito em detalhe e é baseado na detecção de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico no fígado e leite de camundongos de tipo selvagem e Cmah knock-out. Os ácidos sialicos endógenos são liberados e derivados com o-fenilenodiamina para gerar derivados fluorogénicos, os quais podem ser posteriormente analisados por HPLC. O protocolo apresentado pode serTambém aplicou para a análise de amostras de leite e tecido de várias outras origens e pode ser útil para investigar os efeitos nutricionais e da saúde do ácido N-glicoliluramina.
Introdução
O ácido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e o ácido N-glicolneuraminico (Neu5Gc) são os ácidos sialicos mais comuns na maioria dos mamíferos 1 . Embora capaz de sintetizar Neu5Ac de forma endógena, os seres humanos não são capazes de produzir Neu5Gc devido a uma deleção primária de exão no gene CMAH que codifica uma hidroxilase 2 , 3 de CMP-Neu5Ac. No entanto, os produtos alimentares baseados em animais podem ser fontes dietéticas de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , levando à produção de anticorpos anti....
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo assuntos de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Centro de Animal Experimental da Universidade Agrícola de Nanjing de acordo com as Diretrizes Nacionais para o Bem-estar Animal Experimental (Ministério da Ciência e Tecnologia, PR da China, 2006) com os animais alojados em um SPF Facilidade (ID de permissão: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Mouse Model
- Use ratinhos C57Bl / 6 de tipo selvagem do Centro de Medicina Comparada da Universidade de Yangzhou (China).
NOTA: Os ratos Cmah knock-out foram gerados com base na informação fornecida pelos estudos ante....
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Resultados
Uma visão geral esquemática do método de análise descrito é mostrada na Figura 1 e inclui o isolamento de ácidos sialicos a partir de amostras de leite e fígado de camundongos mutantes de tipo selvagem e Cmah knock-out, e a derivação de fluorescência e a análise por HPLC desses componentes. A Figura 2 e a Figura 3 mostram cromatogramas de HPLC representativos de ácidos sialicos der.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado permite a avaliação fenotípica de camundongos knock-out Cmah homozigotos, analisando e quantificando as quantidades relativas de Neu5Gc de amostras de leite e fígado. A análise foi realizada usando uma configuração padrão de HPLC com detecção de fluorescência. O passo mais crítico deste procedimento é a preparação das colunas de troca de aniões e a realização da cromatografia de troca de aniões; Para resolver adequadamente a resina e para coletar as frações corretas de lavagem e elu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de Ciências Naturais da China (números de subvenção 31471703, A0201300537 e 31671854 para JV e LL) e o Plano de 100 Estratos Estrangeiros (número de concessão JSB2014012 a JV).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produtos químicos: < / ácido | |||
| Sigma | A0812 | ||
| Ácido N-glicolilneuramínico | Sigma | 50644 | Alíquota de 1 mg deve ser suficiente |
| o-fenilenodiamina | Sigma | 694975 | |
| hidrogenossulfito de sódio | J & K Scientific Ltd | 75234 | |
| Ferramentas/Materiais: | |||
| 3 mL Tubos SPE | Supelco | Sigma 57024 | colunas de extração de fase sólida vazia |
| Luer torneira | Sigma | S7396 | para interromper o fluxo do tubo SPE |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Moedor de tecido Dounce | Sigma | D8938 | ajuste apertado |
| HPLC Análise: frasco de HPLC de | |||
| High-recovery | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| Sistema HPLC | Shimadzu | Nexera | |
| Detector de Fluorescência para HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Coluna | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4,6 mm |
| LCMS-grau H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grau Acetonitrila | Merck Millipore | #100029 | |
| Solução de hidróxido de amônio | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
Referências
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
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Reimpressões e permissões
