Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Resumo

A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.

Resumo

A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental da biologia molecular que tem sido amplamente utilizada para a análise bioquímica das interações RNA-proteína. Essas interações foram tradicionalmente analisadas com géis de poliacrilamida gerados entre duas placas de vidro e amostras submetidas a eletroforese verticalmente. No entanto, os géis de poliacrilamida moldados em bandejas e submetidos a electroforese horizontalmente oferecem várias vantagens. Por exemplo, géis horizontais utilizados para analisar complexos entre substratos de ARN fluorescentes e proteínas específicas podem ser imaginados várias vezes à medida que a eletroforese progride. Isso proporciona a oportunidade única de monitorar complexos de RNA-proteína em vários pontos durante o experimento. Além disso, a eletroforese horizontal em gel possibilita analisar muitas amostras em paralelo. Isso pode facilitar muito as experiências de tempo, bem como analisar várias reações simultaneamente para comparar diferentes componentes e condições. Aqui nós prUm protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal para analisar as interações RNA-Proteína.

Introdução

Os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) provaram ser uma ferramenta bioquímica inestimável para analisar as interações específicas de proteína-nucleico ^{1 , 2 , 3} . Esses ensaios podem fornecer informações importantes sobre a afinidade de ligação das proteínas ao RNA ou DNA ³ , a estequiometria componente dos complexos de ácido nucleico-proteína ¹ e fornecem novos pontos de vista importantes sobre a especificidade de ligação das proteínas de ligação de ARN através de experiências de competição de substrato ¹ .

A configuração experimental tradicional para estes ensaios consiste em misturar a proteína purificada com um substrato de ARN radiomarcado. Os complexos resultantes são então analisados ​​com géis de poliacrilamida não desnaturantes (nativos) vertidos entre duas placas de vidro seguidas por eletroforese de amostra num aparelho vertical ³. Embora esta abordagem tenha sido utilizada de forma exaustiva para fornecer informações importantes sobre os mecanismos bioquímicos subjacentes à ligação das proteínas aos ácidos nucleicos, ela também possui várias limitações. Por exemplo, esta estratégia básica tem um rendimento relativamente baixo e não é facilmente adaptável para aplicações que exigem a análise de muitas reações vinculativas em paralelo. Além disso, com o aparelho vertical tradicional, é desafiador monitorizar complexos em várias ocasiões durante a eletroforese ^{3 , 4} .

Aqui apresentamos uma adaptação do ensaio EMSA que utiliza géis nativos de poliacrilamida em um aparelho de platina, eletroforese horizontal e substratos de ARN marcados fluorescentemente ^{4 , 5 , 6 , 7} . A incorporação dessas modificações relativamente simples ao nível básicoTegy oferece algumas vantagens poderosas. Em particular, o formato de plataforma horizontal facilmente se presta a analisar dúzias de amostras simultaneamente ⁴ . Além disso, para alguns complexos de RNA-proteína, tais como aqueles formados entre a proteína Bicaudal-C e sua eletroforese de substrato de ARN em um gel horizontal, proporciona uma capacidade aumentada para resolver complexos distintos de proteína RNA e discriminar estes de substrato de ARN não ligado.

Protocolo

1. Preparação do Gel de Poliacrilamida Nativo Horizontal ⁴ .

1. Preparação dos materiais necessários.
   1. Para o aparelho de gel horizontal, use uma caixa de gel (37 cm x 24 cm) com uma bandeja de 27 cm x 21 cm e uma capacidade para dois pentes de 24 poços. Esta configuração fornece um total de 48 amostras que podem ser analisadas simultaneamente.
   2. Prepare os seguintes reagentes: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (persulfato de amônio).
2. Geração de um gel de acrilamida nativo a 10%.
   1. Num balão de 500 mL, adicione 80 mL de TBE 5x, 100 mL de acrilamida a 40% e água até um volume final de 400 mL.
   2. Adicione 4 mL de APS a 10% e 400 μL de TEMED. Misture bem.
   3. Despeje a mistura na bandeja de fundição horizontal e deixe o gel polimerizar por 30 min. O gel terá aproximadamente 2 cm de espessura.
      NOTA: Os géis podem lançar uma exaustão para acelerarAté a polimerização. Após a polimerização, uma fina camada de líquido permanecerá no topo do gel.
   4. Despeje o líquido e lave com tampão corrente. Remova o (s) pente (s) com cuidado e enxágue os poços com tampão corrente usando uma seringa.
3. Preparação do buffer de operação.
   1. Prepare 2 L de buffer de corrida 1x TBE para a caixa de gel. Diluir 400 mL de 5XTBE com 1600 mL e misturar. Coloque 1x tampão TBE na sala fria para esfriar.
4. Pre-Running the gel
   1. Adicione 2 L de tampão de funcionamento a frio na caixa de gel e insira o gel.
   2. Antes de executar o gel a 120 V por 1 h a 4 ° C em uma sala fria. Durante esse período, prepare a reação de ligação.

2. Reação de encadernação ⁸

1. 2.1.Prepare os seguintes componentes de reação.
   DTT 20 mM
   BSA 10 mM
   TRNAs de levedura 10 mM
   Tampão de ligação 5X (HEPES 50 mM pH 8,0, EDTA 5 mM, 25KCl 0 mM, Tween-20 a 0,2%)
   RNA marcado com fluoresceína 100 nM adquirido comercialmente
   Proteína Bicaudal-C concentrada
   50% de glicerol em H ₂ O tratado com DEPC
   H ₂ O tratado com DEPC
2. Monte os componentes de reação de ligação em um tubo de microcentrífuga sem RNase.
   1. Ao tubo, adicione 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNAs de levedura 10 mM, 10 μL de tampão de ligação 5x.
3. Adicionar proteína a uma concentração final de 250 nM em 50 μL. Adicione água a um volume final de 45 μL.
4. Adicione 5 μL de substrato de ARN marcado fluorescentemente. Use um substrato de 32-nucleotídeos marcado com fluoresceína de 3 'adquirido comercialmente.
5. Misturar e incubar no escuro durante 30 min à temperatura ambiente.

3. Análise de Amostras no Gel Nativo de Poliacrilamida Horizontal

1. A cada reação, adicione 15 μL de glicerol a 50% e misture suavemente.
2. CarefuAdicione 30 μL de cada reacção ao gel. A quantidade de amostra que pode ser carregada num único poço varia dependendo da espessura do gel e do tamanho dos poços. Carregamos volumes tão pequenos quanto 15 μL e até 45 μL em um único poço de géis criados com um pente de 24 po e despejados até uma espessura de 2 cm.
3. Depois de conectar a fonte de alimentação ao aparelho de gel, ligue a alimentação e ajuste a tensão. Execute o gel a 4 ° C a 120 V.
   NOTA: Para o aparelho de gel horizontal, isso acaba sendo de aproximadamente 5 V / cm. Para o aparelho de gel vertical, isto é 16 V / cm.
   1. Para evitar danos ou branqueamento do ARN marcado de forma fluorescente, realize eletroforese no escuro.
   2. Vários tempos de eletroforese dependendo dos detalhes do complexo RNA-proteína que está sendo analisado.
      NOTA: Uma grande vantagem da análise EMSA horizontal é que a eletroforese pode ser interrompida, a imagem em gel e depois a gePosso voltar para o aparelho e a eletroforese pode continuar por tempos mais longos.

4. Imaging the Gel

1. Execute análise com qualquer instrumento projetado para detecção e imagens de substratos fluorescentes.
2. Coloque o gel na imagem.
3. Ajuste as configurações da imagem. Para os ligandos de ARN marcados com fluoresceína, use as seguintes configurações: FAM (comprimento de onda 473 nm), 750 Tensão de fotomultiplicador (PMT), tamanho de pixel de 100 μm.
4. Digitalize o gel para capturar a imagem.

Resultados

Para demonstrar o poder e a versatilidade da eletroforese em gel nativo horizontal, analisamos a ligação da proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a um ARN marcado fluorescentemente contendo um local de ligação Bicc1. As proteínas Bicc1 funcionam como repressores translacionais específicos de mRNA para controlar as decisões do destino das células durante os estádios maternos do desenvolvimento animal ^{9 , 10 ,}

Discussão

Os géis nativos de poliacrilamida são uma ferramenta inestimável para investigar as interações proteína-ARN e, tradicionalmente, esses géis são submetidos a eletroforese verticalmente ^{2 , 3} . Utilizamos uma modificação do protocolo que substitui géis de poliacrilamida nativos criados e submetidos a eletroforese horizontalmente ^{1 , 4 , 6 , 7<...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caixa de Gel Horizontal	OWL	N/A	Produto não é mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, caixas de gel da série A. Número de catálogo: A2-BP
24 poços grandes grandes pentes horizontais de eletroforese	em gel OWL	N/A	Produto não mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, pentes de caixa de gel da série A. Número de catálogo: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Célula de eletroforese	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilamida / Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
tRNAs de levedura	Ambion	AM7119
Fluoresceína marcada RNA	IDT	N/A	O pedido pode ser feito sob medida para o comprimento e a sequência desejada Hidrato
sal tetrassódico EDTA	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapuro	US Biológico	T8600
Ácido Bórico	Fisher Scientific	BP168-500
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8

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