A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína
Neste artigo
Resumo
Resumo
A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental da biologia molecular que tem sido amplamente utilizada para a análise bioquímica das interações RNA-proteína. Essas interações foram tradicionalmente analisadas com géis de poliacrilamida gerados entre duas placas de vidro e amostras submetidas a eletroforese verticalmente. No entanto, os géis de poliacrilamida moldados em bandejas e submetidos a electroforese horizontalmente oferecem várias vantagens. Por exemplo, géis horizontais utilizados para analisar complexos entre substratos de ARN fluorescentes e proteínas específicas podem ser imaginados várias vezes à medida que a eletroforese progride. Isso proporciona a oportunidade única de monitorar complexos de RNA-proteína em vários pontos durante o experimento. Além disso, a eletroforese horizontal em gel possibilita analisar muitas amostras em paralelo. Isso pode facilitar muito as experiências de tempo, bem como analisar várias reações simultaneamente para comparar diferentes componentes e condições. Aqui nós prUm protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal para analisar as interações RNA-Proteína.
Introdução
Os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSAs) provaram ser uma ferramenta bioquímica inestimável para analisar as interações específicas de proteína-nucleico 1 , 2 , 3 . Esses ensaios podem fornecer informações importantes sobre a afinidade de ligação das proteínas ao RNA ou DNA 3 , a estequiometria componente dos complexos de ácido nucleico-proteína 1 e fornecem novos pontos de vista importantes sobre a especificidade de ligação das proteínas de ligação de ARN através de experiências de competição de substrato
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação do Gel de Poliacrilamida Nativo Horizontal 4 .
- Preparação dos materiais necessários.
- Para o aparelho de gel horizontal, use uma caixa de gel (37 cm x 24 cm) com uma bandeja de 27 cm x 21 cm e uma capacidade para dois pentes de 24 poços. Esta configuração fornece um total de 48 amostras que podem ser analisadas simultaneamente.
- Prepare os seguintes reagentes: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (persulfato de amônio).
- Geração de um gel de acrilamida nativo a 10%.
- Num balão de 500 mL, adicione 80 mL d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para demonstrar o poder e a versatilidade da eletroforese em gel nativo horizontal, analisamos a ligação da proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a um ARN marcado fluorescentemente contendo um local de ligação Bicc1. As proteínas Bicc1 funcionam como repressores translacionais específicos de mRNA para controlar as decisões do destino das células durante os estádios maternos do desenvolvimento animal 9 , 10 ,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os géis nativos de poliacrilamida são uma ferramenta inestimável para investigar as interações proteína-ARN e, tradicionalmente, esses géis são submetidos a eletroforese verticalmente 2 , 3 . Utilizamos uma modificação do protocolo que substitui géis de poliacrilamida nativos criados e submetidos a eletroforese horizontalmente 1 , 4 , 6 , 7<.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Laura Vanderploeg pela preparação de números. O trabalho no laboratório Sheets é suportado pela subvenção NSF 1050395 e pela concessão NIH (R21HD076828). O trabalho no laboratório Ryder é suportado por concessões do NIH R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle é apoiada por uma Bolsa de Oportunidades Avançadas da SciMed GRS através da Escola de Pós-Graduação da Universidade de Wisconsin-Madison e do Programa de Treinamento em Biotecnologia através do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (T32GM008349).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caixa de Gel Horizontal | OWL | N/A | Produto não é mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, caixas de gel da série A. Número de catálogo: A2-BP |
| 24 poços grandes grandes pentes horizontais de eletroforese | em gel OWL | N/A | Produto não mais fabricado. Caixas de gel semelhantes podem ser encontradas na Thermo Scientific, pentes de caixa de gel da série A. Número de catálogo: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Célula de eletroforese | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilamida / Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| tRNAs de levedura | Ambion | AM7119 | |
| Fluoresceína marcada RNA | IDT | N/A | O pedido pode ser feito sob medida para o comprimento e a sequência desejada Hidrato |
| sal tetrassódico EDTA | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapuro | US Biológico | T8600 | |
| Ácido Bórico | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Cloreto de potássio | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
Referências
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacteri....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
