Comportamento de fase de vesículas carregadas em solução simétrica e assimétrica condições monitoradas com microscopia de fluorescência

Resumo

Experimentos na fase separado unilamellar gigante vesículas (GUVs) frequentemente negligenciam condições de solução fisiológica. Este trabalho apresenta abordagens para estudar o efeito de buffer de alta salinidade na separação de fases líquido-líquido em GUVs multicomponentes carregadas como uma função de trans-membrana solução assimetria e temperatura.

Resumo

Vesículas separada fase gigante unilamellar (GUVs) exibindo coexistindo ordenada pelo líquidom e líquido-desordenada domínios são uma ferramenta comum de Biofísica para investigar a hipótese de balsa lipídica. Inúmeros estudos, no entanto, negligenciam o impacto de condições de solução fisiológica. Por conta disso, o trabalho atual apresenta o efeito da assimetria de solução tampão e trans-membrana alta salinidade na separação de fases líquido-líquido em GUVs carregados desenvolvidos dioleylphosphatidylglycerol, ovo esfingomielina e colesterol. Os efeitos foram estudados sob condições isotérmicas e variação de temperatura.

Descrevemos equipamentos e estratégias experimentais aplicáveis para monitorar a estabilidade dos domínios líquidos coexistentes em vesículas carregadas sob condições de solução de alta salinidade simétrica e assimétrica. Isso inclui uma abordagem para preparar GUVs multicomponentes carregados no buffer de alta salinidade, temperaturas elevadas. O protocolo implica a opção de realizar uma troca parcial da solução externa por uma etapa de diluição simples, minimizando a diluição de vesículas. Uma abordagem alternativa é apresentada utilizando um dispositivo microfluidic que permite uma troca de solução externa completa. Os efeitos da solução na separação de fases também foram estudados sob diferentes temperaturas. Para tal, apresentamos o projeto básico e a utilidade de uma câmara de controle de temperatura construído in-house. Além disso, refletimos sobre a avaliação do estado de fase GUV, armadilhas associados e como burlá-los.

Introdução

Já desde a observação dos domínios de micro-empresas em vesículas de líquido-líquido fase separada gigante unilamellar (GUVs) por microscopia de fluorescência, GUVs têm sido usados como um sistema modelo para investigar os lipídios jangada hipótese^{1,2 , 3} . Como a área de sua BICAMADA autônoma encontra-se no intervalo do que de células biológicas, que são imita apropriada das membranas de plasma apresentando as balsas hipotéticos. Foram realizados numerosos estudos sobre tais GUVs com vesículas dispersadas em água pura, sacarose ou soluções de baixa salinidade^4,5,6,7,8. Nestas condições, no entanto, não refletem exposição fisiologicamente relevantes de biomembranas para ambientes de alta salinidade e trans-membrana solução assimetria como são as condições para as células.

Neste trabalho e em uma publicação anterior do nosso grupo⁹, os Estados de fase da carga GUVs multicomponentes foram examinados em função da presença de assimetria de sal e solução através da membrana. GUVs foram preparados a partir de misturas de diferentes proporções de dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ovo esfingomielina (eSM) e colesterol (Chol) em solução de sacarose (com osmolaridade de 210 mOsm/kg) ou buffer de alta salinidade (100 mM de NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). A escolha de lipídios foi justificada pelos dados já obtidos no diagrama de fase desta mistura^6,8.

Um número de métodos para a preparação de GUVs está disponível na literatura^10,11,12 (Observe que, aqui, não consideraremos os que envolvem a transferência de lipídios de à base de óleo para uma fase aquosa ^{13 , 14} por causa do perigo inerente dos restantes resíduos óleo na membrana, que pode afetar o comportamento de fase). A preparação de GUVs no buffer de alta salinidade está associada com desafios específicos. Para soluções de baixa força iônica, o método de electroformation^15,16 apresenta uma maneira rápida para preparar GUVs em rendimentos elevados com pequenos defeitos de^10,17. O método baseia-se depositar uma camada de lipídios sobre uma superfície condutora (eletrodo), secá-los e hidratante-los com uma solução aquosa, enquanto aplicando um campo de AC. No entanto, este método requer ajustes se o sal está presente na solução aquosa^18,19. Presume-se que a força motriz para o crescimento da vesícula por electroformation é electroosmosis¹⁶ que é dificultado em altas condutividades²⁰. Portanto, electroswelling de GUVs em soluções de alta salinidade não é uma abordagem direta como necessita de otimização para as diferentes concentrações de sal presentes na solução inchaço. Assistida por gel de vesículas inchaço^21,22 é uma alternativa potencial para electroformation com tempos de formação ainda mais rápidos. Esta abordagem baseia-se a hidratação do filme lipídico reforçada quando um gel (agarose ou álcool polivinílico (PVA)) é usado como substrato. Essas abordagens, no entanto, vêm com o risco de contaminação da membrana no caso baseada em agarose inchaço²³ e/ou temperatura limites como no caso do inchaço baseada em PVA. Da mesma forma, um protocolo para crescer GUVs sobre um substrato de papel de celulose foi recentemente estabelecido²⁴. Questões gerais desse método são a falta de controle sobre a pureza do substrato, bem como o uso de grandes quantidades de lipídios. Neste trabalho, iremos apresentar e apresentar as vantagens do método mais tradicional para a preparação de chefe, nomeadamente a espontânea inchaço método^25,26. Consiste de uma camada lipídica sobre um substrato lipofóbico, hidratante-lo na atmosfera de vapor de água e inchaço subsequente na solução desejada inchaço de secagem (ver Figura 1 e detalhes na seção de protocolo). Este método não oferece controle sobre a distribuição de tamanho de vesículas e resulta em vesículas no geral menores em comparação com métodos onde a produção é assistida por campo elétrico, substrato de polímero ou microfluidic significa. No entanto, a qualidade de vesículas e o tamanho é apropriado para examinar o estado de fase de membrana como explorada aqui.

Criação de assimetria entre as soluções através da membrana da vesícula está associado com determinados desafios também. Uma abordagem comumente usada é a diluição direta da suspensão vesículas na solução externa desejada^27,28. No entanto, isso também diminui a densidade de distribuição de vesículas. Outra estratégia é lentamente, trocar a solução externa em torno de GUVs, estabeleceu-se na parte inferior de uma pilha de fluxo que permite a solução de em - e saída. Para evitar perturbar ou mesmo perdendo as vesículas com o fluxo, taxas de fluxo baixas são aplicadas⁸, que processa esta abordagem tempo-ineficiente. Além disso, nenhuma dessas abordagens garante solução completa externa troca. Uma solução óbvia é para imobilizar vesículas para evitar perdê-los durante uma troca de solução externa. Por exemplo, biotinilado GUVs pode ser amarrado em uma superfície revestida streptavidin²⁹. No entanto, esta abordagem pode levar a variações composicionais no aderidas e daí a membrana não-aderido segmentos^30,31. Da aplicação magnética ou campos elétricos para aprisionar os resultados de vesículas na membrana de impor tensão³². Empregando a Pinça óptica para interceptar uma vesícula requer ter uma alça anexada (ou seja, uma pérola), enquanto o uso de macas ópticos pode envolver aquecimento local³³. Captura de GUVs também pode ser realizada por cultivá-las em fios de platina sem desprendimento final³⁴. Isso no entanto produz vesículas que não são isolados e geralmente ligados aos fios ou outras vesículas por tubos fina lipídico (amarras).

O trabalho apresentado destaca estratégias para superar as limitações acima referidas. Primeiro, apresentamos uma descrição detalhada do método inchaço espontâneo adaptado e otimizado para a produção de GUVs nos buffers de alta salinidade. Em seguida apresentamos duas abordagens para eficientemente criar condições de solução assimétrica por simples diluição ou a utilização de um dispositivo microfluidic. Porque o nosso objectivo é a análise do estado de fase membrana de GUVs em condições diferentes da solução, as seções subsequentes descrevem critérios para a análise estatística de sucesso e dicas de presentes para evitar falsa categorização.

As análises foram realizadas em condições isotérmicas, assim como sob temperaturas diferentes. Enquanto a temperatura control é comumente empregado, detalhes sobre câmaras de temperatura-controle experimental são raramente descritos. Aqui, apresenta-se uma configuração construída in-house para observar GUVs em diferentes condições de temperatura.

Protocolo

1. inchaço espontâneo de GUVs

Nota: clorofórmio é uma substância nociva, que é altamente volátil. Realizar todas as operações envolvendo o clorofórmio sob uma coifa. Não use plástico labware como pontas de pipetas ou recipientes de plástico para a transferência e/ou armazenamento de soluções de clorofórmio. Clorofórmio dissolve plástico, que contamina a solução. Utilize seringas de vidro e recipientes de vidro, em vez disso. Além disso, trabalhe tão limpa quanto possível, para evitar a introdução de impurezas, como eles podem interagir com as membranas. Observe que as concentrações de lipídios típicos em preparativos finais do chefe são na faixa de micromolar, assim impurezas nesse intervalo de concentração podem ter forte efeito sobre o comportamento da membrana.

1. Aparte do equipamento básico, tem os seguintes itens prontos.
   1. Prepare um politetrafluoretileno (PTFE, comumente conhecido como Teflon) chapa para deposição de lipídios de tamanho ~1.5 cm x 1,5 cm e espessura adequada. Desbastar a placa de um lado com uma lixa fina.
      Nota: O PTFE é lipofóbico e não irá ser molhada por soluções de clorofórmio se liso. Ambos os lados da placa de PTFE podem ser áspera para evitar confusão sobre o lado correto para deposição de lipídios. A espessura da placa deve ser escolhida para fácil manuseio, por exemplo, que não é muito flexível e pode ser facilmente coberta pela solução de hidratação (ver Figura 1). Aqui usamos placas de ~ 2 mm de espessura. Uma vez rugosas, a placa PTFE pode ser reutilizada para novas experiências após a limpeza apropriada (etapa 1.3).
   2. Preparar um frasco de vidro sealable do volume adequado (~ 15 mL) para o crescimento de hidratação e vesículas de filme lipídico final.
   3. Prepare um recipiente de vidro selável, no qual se encaixa o frasco de vidro de ~ 15 mL; ele será usado para criar uma atmosfera saturada com água para inchaço pré de lipídios filme, veja a Figura 1.
2. Preparar 4mm estoques de lipídios na proporção desejada de 1,2 - dioleoyl - sn - glicero - 3 - fosfo-(1 ' - rac - glicerol) (sal de sódio) (DOPG), ovo esfingomielina (eSM) e colesterol (Chol), com adicional de 0,1 mol % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiIC ₁₈) a uma concentração de lipídios totais de 4 mM. Use o clorofórmio como solvente. Consulte a tabela de materiais.
3. Enxaguar cuidadosamente a placa PTFE e o recipiente de vidro com detergente comercial, etanol e clorofórmio em que sequência e finalmente secá-los.
4. Usando uma seringa de vidro, depósito e distribuídas em 10-15 µ l de estoque de lipídios na face áspera da placa de PTFE para criar um filme lipídico uniforme. Use a agulha da seringa para espalhar a solução, se necessário.
5. Coloque a placa de PTFE sobre uma superfície limpa e desidratá-lo juntamente com o filme lipídico depositado durante 2 h a 60 ° C para remover o clorofórmio. Por uma questão de conveniência, deposite a placa dentro do recipiente de vidro limpo e sem lacre 15ml durante dessecação.
   Nota: A alta temperatura garante que o filme lipídico está em um estado de single-líquido homogêneo nesta e em todas as etapas subsequentes.
6. Após a dessecação, encha o recipiente de vidro previamente inchaço com água desionizada até um nível que não permita a flutuabilidade derrubar o frasco de vidro de ~ 15 mL (~ 1 cm), veja a Figura 1.
7. Colocar o vidro de ~ 15 mL frasco com a placa PTFE no recipiente e cobri-lo, a fim de que possam emergir uma atmosfera saturada de água, ver figura 1B.
   Nota: A água condensada para as paredes do recipiente interno dá uma boa indicação de saturação de vapor de água bem sucedida.
8. Deixe o filme lipídico depositado previamente inchar dentro do recipiente de vidro fechado, a 60 ° C, durante 4 h. Dentro deste período de tempo, preparar a solução desejada inchaço.
   Nota: Para preparações de vesículas que podem ser conduzidas em temperatura mais baixa, desta vez pode ser extremamente reduzida - até alguns minutos - se quente água saturada de nitrogênio ou argônio é usado para o pré-inchaço em vez disso.
   1. Preparar 200 mM sacarose ou 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 ajustado com HCl e calor a 60 ° C para fazer a solução inchaço.
9. Após o pre-inchaço, levar o copo de ~ 15 mL com a placa PTFE para fora do recipiente. Com uma seringa ligada a um filtro de 0,45 µm, adicionar ~ 5 mL da solução de inchaço dentro do frasco de vidro de 15 mL para hidratar o filme lipídico.
   Nota: Uma agulha para o filtro de fixação facilita a inserção da solução de inchaço. Pré-aquecimento da seringa e o filtro pode ser aconselhável para garantir um estado de fase líquido-single do filme lipídico ao adicionar a solução de inchaço. Filtrar a solução minimiza (in-) contaminações orgânicas de bactérias ou sal precipitado etc
10. selar o frasco de vidro de ~ 15 mL segurando o filme lipídico hidratado na placa de PTFE para minimizar a evaporação. Se necessário, use filme de parafina para melhorar a vedação. Deixar o filme lipídico hidratado a 60 ° C durante a noite para chefe final inchaço.

2. Colheita de GUVs

Nota: A agregação de GUVs inchada e retirado os resultados de substrato PTFE em uma moita de nuvem, como pequeno (~ 1mm) visível a olho nu. Ele aparece esbranquiçado quando nenhuma tintura de fluorescência é usada. Caso contrário, ele é de cor de acordo com o espectro de absorção do fluoróforo. A adição de DiIC ₁₈ processa a nuvem rosa (ver Figura 2). As vesículas estão concentradas no agregado e colheita maximiza o rendimento do vesicle.

~1/10

1. cool para baixo as vesículas à temperatura dentro ~ 1 h.. corte do fim pontudo de uma ponta de plástico da pipeta do pistão para o cluster ou agregado de vesículas para caber através do orifício.
   Nota: A taxa de resfriamento é particularmente importante se separação sólido-líquido fase é esperada como ele altera o tamanho dos domínios sólidos. Aqui, para retardar o resfriamento, colocamos a amostra em contato com um bloco de metal de tamanho 5 cm x 9,5 cm x 7,5 cm (H x L x W) que arrefecido à temperatura dentro de 1 h.
2. Pipeta até o cluster juntamente com um volume adequado de inchaço solução (ver Figura 2). Ressuspender o agregado na solução inchaço para criar condições de solução simétrica, ou toda a desejada solução iso-osmótica para criar condições de solução assimétrica.
   Nota: O limite inferior do volume é limitado pelo tamanho do agregado a ser colhido completamente. A solução externa é diluída e a fim de avaliar a concentração exacta, o volume da solução de vesículas tem que ser levado em conta.

3. Observação de GUVs para a fase de estado avaliação usando microscopia de fluorescência

Nota: os GUVs foram dopadas com DiIC ₁₈ como um marcador fluorescente. Este fluoróforo preferencialmente particiona em fase líquido-desordenada (Ld). Isto permite a observação de microscopia de fluorescência de domínios resultante da separação de fases nos GUVs. Realizamos a avaliação do estado de fase com microscopia de fluorescência-epi. Em princípio, estas observações são também viáveis usando laser confocal, microscopia (CLSM), que também permite a quantificação do sinal (por exemplo, para determinar a membrana unilamellarity). No entanto, CLSM requer equipamentos mais sofisticados e (geralmente) observações de epi-fluorescência antes da digitalização são úteis em qualquer caso.

1. Decidir sobre um objetivo (por exemplo, 40 X ampliação com um 0,6 Abertura numérica (NA) como usado aqui) para observar os GUVs e usá-lo consistentemente ao comparar Estados de fase da mesma composição em diferente solution condições. Usar filtros de comprimento de onda de excitação e emissão apropriados para permitir observações de fluorescência com o fluoróforo usado (por exemplo, excitação a 560 nm ± 40 e 630 ± 75 nm com um divisor de feixe nm 585 no meio utilizado para DiIC ₁₈).
   Nota: Os limites de estado de fase dentro de um diagrama de fase dependerá da resolução que o objectivo atinge como ele define o tamanho mínimo de microdomínios a ser detectado.
2. Para análise, apenas selecione GUVs que cumprir os seguintes critérios de qualidade.
   1. Garantir a unilamellarity da membrana chefe por observação visual das vesículas diferentes e comparar suas intensidades; vesículas com a intensidade de emissão de fluorescência menor são mais provável unilamellar.
      Nota: O inchaço espontâneo pode produzir lotes de vesículas, onde uma grande fração das vesículas gigantes não são unilamellar.
   2. Executar uma verificação adicional por quantificar a intensidade de emissão de fluorescência da supostamente unilamellar gigante vesículas e verificar o sinal correspondente para dispersão da população. Se não inteiro entre diferentes GUVs são observadas diferenças, todos eles são susceptíveis de ser unilamellar.
      Nota: Se vesículas são preparadas a partir de lipídios convencionais usando um método estabelecido, tais como inchaço espontâneo, a abordagem descrita acima para a detecção de vesículas unilamellar é suficiente. Se estabelecer um novo protocolo de preparação do chefe ou usando lipídios não convencionais, estudos mais detalhados deverão confirmar unilamellarity. Por exemplo, os sinais de fluorescência de membrana das vesículas rotulados, preparados por um novo protocolo poderiam ser comparados de GUVs preparados por um método estabelecido; ou o poro da membrana proteína α-hemolisina pode ser inserido em vesículas membranas ²⁴. Corante adicionado ao exterior das vesículas em seguida insira seu interior ou não, dependendo da presença de uni - ou vesículas multilamellar, respectivamente.
   3. Certifique-se de que o chefe tem um diâmetro mínimo razoável para domínios ainda ser reconhecível.
   4. Certifique-se de que o chefe tem (quase) sem defeitos como partes salientes ou aderidas ou estruturas internas.
3. Transferir uma alíquota do chefe suspensão numa lâmina de microscópio e selá-lo corretamente. Preparar uma câmara de observação.
4. Depositar a amostra para o slide de microscópio. Cercá-lo por um espaçador de silicone com um recorte circular central. Para evitar contaminação, certifique-se de que o espaçador não está em contacto com a amostra. O interior do selo, colocando uma lamela em cima do espaçador de silicone.
   Nota: Em vez do silicone espaçador um pode usar graxa de silicone ou espaçadores polydimethysiloxane caseiro (PDMS). A câmara de vedação garante evaporação mínima da amostra e mantém as condições iso-osmolar.
5. Deixar a amostra por ~ 5 min para re-equilibrio de possíveis domínios.
   Nota: O estresse mecânico de pipetagem pode misturar os domínios de membrana, que precisam de tempo para reforma.
6. Coloque a lâmina de microscópio com a amostra para o palco do microscópio e analisar o estado de fase do lote chefe em uma abordagem estatística. Mais de 30 GUVs por lote de observar e determinar o seu estado de fase, de acordo com os seguintes critérios para avaliação de estado de fase de chefe com DiIC ₁₈ ( Figura 3).
   Nota: Depois de seu crescimento, vesículas podem mudar suas composições individuais devido ao domínio brotamento fora (por exemplo) ou à troca de material da membrana através de nanotubos. GUVs, portanto, apresentam variações composicionais dentro do mesmo lote ³⁵. Fase
   1. single-líquido ou líquido-ordenada (Lo) a ser ou líquido-desordenada (Ld): Certifique-se de que a forma geral do chefe é esférico e suave e DiIC ₁₈ é distribuído homogeneamente na membrana (primeiro imagens em painéis superior e inferior em < classe forte = "xfig" > Figura 3).
   2. Estado de coexistência de duas fases Lo + Ld: Certifique-se de que as vesículas apresentam domínios que aparecem circulares com limites suaves; de acordo com o DiIC ₁₈ particionamento comportamento domínios são vermelho brilhante (Ld) ou vermelho escuro/preto (Lo) (segundo imagens na parte superior e fundo painéis na Figura 3, em falsa cor). Verifique se os domínios são livres para difundir na superfície de vesículas e podem coalescer.
   3. Duas fases sólido (S) + estado líquido da coexistência (Lo + S ou S + Ld): Certifique-se de que os domínios podem aparecer como dedo ou arredondado, mas com limites angulares (terceiros imagens nos painéis superior e inferior na Figura 3). Observe o líquido domínios (vermelho) em uma sólida formação (preta) que não irá exibir a difusão. Ao contrário, domínios sólido (preto) será livres para difundir num fundo líquido (vermelho).
   4. Convivência trifásica S + Lo + Ld: observar três tipos de domínios aparecendo: domínios pretos (i) angulares (S), incorporado em (ii) dim (Lo) e (iii) brilhante (Ld) domínios vermelhos.
7. Atribuem a população de GUVs para o estado de fase que foi determinado a ser dominante entre uma amostra aleatória, como nos seguintes exemplos:
   1. se 20 single-líquido GUVs e 15 Lo + Ld GUVs são observados, considere o lote para ser um Single-líquido fase.
   2. Se 10 S + L GUVs, 30 GUVs Lo + Ld e 25 GUVs single-líquido são observados, considere o lote para ser um ld. Lo +

4. Observação de chefe no dispositivo Microfluidic

Nota: primeiro a fabricar o dispositivo microfluidic; detalhes do projeto de dispositivo microfluidic e montagem me deram outro lugar ^{36 , 37}; consulte a Figura 4 para uma breve descrição.

1. Preparar fresco GUV inchaço solução (sal ou sacarose conforme item 1.8.1) e filtrá-la através de um filtro de 0,45 µm.
   Nota: Quaisquer impurezas nas soluções de fluxo podem entupir o dispositivo microfluidic.
2. Pistão de cortar 200 µ l pipeta pontas de plástico e colocá-los nos orifícios na parte do dispositivo PDMS. Adicione 100 µ l e 5 µ l da fresca e filtrada inchaço a solução no reservatório (ver Figura 5A) e cada um do corte Pipetar dicas, respectivamente. Centrifugue o dispositivo a 900 x g durante 10 minutos em uma centrífuga de rotor de balanço para pre-encher o aparelho e retirar o ar.
3. Pre-encha a seringa de vidro de 1 mL e anexado a um tubo com a solução de inchaço e mover a posição do êmbolo para 0 mL.
4. Colocar o tubo na saída do dispositivo de fluídico e coloque a seringa para a bomba de seringa.
   Nota: A escolha da seringa e da marca de bomba de seringa não é importante. No entanto, seringas de vidro são mais precisas e a bomba deve ser capaz de operar na faixa de fluxo µ l/min.
5. Conectar uma unidade de controle de pressão personalizado 8 nas entradas do controle microfluidic camada (ver Figura 5A). Ajustar a pressão para a unidade de controle de pressão de 3 bar (ar, nitrogênio ou argônio), mas o conjunto das válvulas para o dispositivo microfluidic para a posição fechada.
6. , Coloque o dispositivo microfluidic, agora está ligado com a unidade de controle da bomba e pressão de seringa, no palco microscópio confocal invertido.
   1. Uso um objetivo com a mesma ampliação e at como durante as observações em massa. Controlar se as estatísticas de estado de fase conforme explicado na etapa 3.7 permanecem os mesmos, se outro objetivo é usado para evitar artefatos de observação que são baseados em diferentes resoluções.
7. Carregar os GUVs para o dispositivo.
   1. Primeira, pipeta longe tudo mas 25 a 50 µ l da solução que se manteve no reservatório. Adicionar 150 µ l da solução de chefe (em sacarose ou sal de acordo com a etapa 1.8.1, mas combinando o solução utilizada para pre-encher o dispositivo no passo 4.1) para o reservatório e mistura pipetando suave. Definir a seringa de 10 µ l/min de vazão nos retirar modo por aproximadamente 20 min ou até mais de 90% das armadilhas são ocupados.
      Nota: O reservatório não deve ser permitido a secar. Se isso acontecer, as bolhas de ar vão entrar os micro-canais. Adicionar mais solução de chefe para o conteúdor durante o carregamento mas tome cuidado para não introduzir bolhas de ar quando pipetagem no dispositivo.
8. Abrir todas as válvulas de unidade de controle de pressão para fechar as anel microfluidic-válvulas em torno as armadilhas/GUVs. Conjunto da bomba de seringa para 0 µ l/min. Depois de 1h, observe o GUVs e gravar imagens confocal. Excitar e detectar os GUVs de acordo com o fluoróforo usado (por exemplo, excitação a 561 nm e deteção entre 580-620 nm quanto DiIC ₁₈). Usar os mesmos critérios de seleção da etapa 3.6 , e ter o cuidado de observar a localização de cada chefe (ou seja, a coluna e linha número, ver Figura 4)
9. trocar a solução em torno do GUVs .
   1. Conjunto da bomba de seringa para 0 µ l/min e pipeta embora todas mas de 25 a 50 µ l da solução no reservatório de chefe. Adicione 150 µ l da solução 2 (em sacarose ou sal de acordo com a etapa 1.8.1, dependendo a solução desejada, fora as GUVs) para o reservatório e mistura pipetando suave. Pipetar embora todas mas de 25 a 50 µ l da solução-tampão do reservatório de.
      Nota: Esta solução tem de ser filtrada usando um filtro de 0,45 µm também.
10. Repita a etapa anterior pelo menos 5 vezes para substituir completamente a solução no reservatório. Definir a seringa de 10 µ l/min de vazão em retirar o modo para ~ 10 min substituir a solução nos canais de micro-.
11. Reduzir a taxa de fluxo de 1 µ l/min. Abra as 8 pressão unidade válvulas de controle para 2 s e feche novamente (resultando na abertura e fechamento das válvulas microfluidic anel). Definir a taxa de fluxo de 0 µ l/min novamente.
12. Depois de 1 h, observar-se a GUVs e gravar imagens confocal. Novamente, tome cuidado para observação da coluna e linha da microcâmara onde cada chefe está localizado para permitir comparações do chefe a mesma antes e depois da troca de amortecedor externo.

5. Design e calibração da câmara de controle de temperatura

Nota: uma câmara apropriada para controle de temperatura pode ser obtida comercialmente ou construídos em casa. Controle de temperatura é normalmente conseguida por acoplamento térmico da câmara com o exemplo do chefe para um banho de água ou um elemento Peltier. Aqui, descrevemos o projeto e caracterização de uma câmara de repouso-construído-controle de temperatura de funcionamento com um termostato de água externa. Esses termostatos estão disponíveis em muitos laboratórios ou podem ser recuperados a partir de equipamentos antigos como lasers ou espectrômetros.

1. Montar uma câmara de fluxo de calor, aqui, feita de um bloco de alumínio, com conectores para um banho de água conforme mostrado na Figura 6. Selar as aberturas na parte superior e inferior e permitem a observação de campo brilhante da amostra por colagem vidros de cobertura para o bloco.
2. Flip câmara de fluxo no lado onde a amostra será colocada e pipetar uma gotícula de cerca de 100 µ l da solução utilizada em experimentos de acordo com a etapa 1.8.1. Opcionalmente, insira uma sonda de fibra óptica de temperatura (por exemplo, FISO FTI-10) ou adicionar um corante sensível à temperatura, em uma concentração adequada, por exemplo, 500 µM rodamina B.
3. Montar a câmara de observação GUV usando graxa de silicone depositada em forma de anel ou algum outro espaçador (PTFE ou borracha) e selá-lo com um vidro de tampa de 0.17 µm. Certifique-se de que a queda não está em contacto com o agente de vedação ou o espaçador para evitar a introdução de impurezas.
4. Lentamente gire o conjunto de ponta-cabeça e conectar o termostato externo de água com tubulação adequada para isso. Preste atenção especial aos eventuais fugas de água.
5. o menor conjunto desejado a temperatura do termóstato externo de água e deixe o sistema equilibrar até a leitura do sensor de temperatura é estável; o tempo necessário para a equilibração dará uma estimativa do tempo mínimo de resposta do sistema.
6. Realizar experimentos de controle pelo menos uma vez antes de começar a usar a câmara.
   1. Medir a temperatura da solução (por exemplo, com uma sonda de fibra de vidro) e compará-lo com a leitura do termostato na faixa de temperatura de interesse.
   2. Seleção para um deslocamento mínimo da leitura do termostato e linearidade das temperaturas medidas.
   3. Verificar se há um gradiente de temperatura dentro da câmara de observação usando um corante sensível de temperatura. Medir a temperatura da solução através da intensidade de fluorescência ou de vida de fluorescência, microscopia (FLIM) para diferentes distâncias da lamela inferior ⁴⁰ de imagem. Além disso, verifique se há qualquer gradiente de temperatura na região de observação do chefe, como mostrado na Figura 7.

6. Observações de chefe em temperaturas variando

Nota: normalmente, para GUVs cujas membranas potencialmente fase-separado e que parecem ser homogênea na observação da temperatura T _obs, separação de fases será induzido abaixo T _obs (se isso é observado depende do intervalo de temperatura investigado). Vice-versa, fase separadas vesículas devem tornar-se homogênea a uma temperatura superior a T _obs. No entanto, isto não precisa ser o caso para uma composição específica lipídios (complexo) e pode ser interessante verificar sempre a temperatura acessível toda gama ³⁸. O protocolo de observação e avaliação das temperaturas de transição de fase não depende do método específico usado para controle de temperatura.

1. Montar a câmara de observação de temperatura de acordo com a seção 5, omitindo a sonda de temperatura óptica de fibra ou o fluoróforo sensíveis à temperatura.
2. Defina o banho de água externa à temperatura (23 ° C) e deixe o sistema equilibrar durante 10-15 min.
3. Contar o número de vesículas fase separado utilizando os critérios da etapa 3.6; fase global estado da população chefe vai dar uma dica sobre a região da temperatura de transição do sistema. Se o estado de fase em toda a população de vesículas é bastante heterogêneo vá diretamente para a etapa 6.5.
4. Aumentar (se a maioria das vesículas são separados por fase) ou diminuir (se a maioria das vesículas é homogênea) a temperatura em intervalos grosseiros (por exemplo, 1-2 ° C) e deixar o sistema equilibrar para cerca de 2 min. re-avaliar o estado de fase de a população de chefe por significa de uma forma aleatória da amostra e variar a temperatura até que a população de vesículas mostra um estado de fase heterogênea.
5. , Uma vez que a população está perto do ponto de transição de fase (ou seja, a fase afirma entre GUVs individuais são bastante heterogêneos), diminuir o intervalo de temperatura (por exemplo, 0,5 ° C) para aumentar a resolução. Deixe o sistema equilibrar por ~ 2 min e re-avaliar o estado da população de chefe de fase por meio de uma amostra aleatória.
6. Uma vez que o ponto de transição de fase é passado, manter variando a temperatura, até que todos os GUVs são agora homogênea ou fase separada, respectivamente.
7. Verifique histerese avaliar se os tempos de equilibração são suficientes. Verificação de
   1. mudar a direção da temperatura, eu.e. se o exame foi feito para o aumento da temperatura, fazer a varredura, diminuindo a temperatura.
   2. Escolher pelo menos um subconjunto das temperaturas para avaliar a proporção de estado de fase (por exemplo, 80% fase separada) chefe população.
   3. Se desvios substanciais entre ambos os sentidos na relação estado fase indicam histerese, reduzir o tamanho do passo de temperatura e/ou aumentar o tempo da equilibração nas etapas 6.4 e 6.5.
   4. Se não há nenhuma histerese indicado por proporções iguais, considere aumentar o tempo de tamanho e/ou equilibração passo.
8. Plotar os rácios de estado de fase contra a temperatura. Para quantificação, ajustar os dados para um modelo adequado ( Figura 8).
   Nota: As curvas de transição de fase comumente apresentam uma trajetória sigmoidal, e o modelo de Boltzmann sigmoidal fornece um conjunto apropriado de encaixe parâmetros:
   
   y: fração de uniforme/fase-separados GUVs
   um ₁: o valor de fração inicial
   um ₂: o valor de fração final
   T: temperatura
   T _misturar: temperatura no máximo meia y
   Como y é a fração de GUVs homogêneas, A ₁ e A ₂ devem ser fixados como 0 e 1, respectivamente. Como a miscibilidade transição é considerada sigmoidal, uma vez que o valor de fração é medido para ser 0 a uma determinada temperatura, todos os valores de fração do intervalo de temperatura abaixo são considerados como 0. Vice-versa, uma vez que o valor de fração é 1 a uma temperatura específica, todos os valores de fração do intervalo de temperatura acima são assumidos como sendo 1.

Resultados

Chefe de inchaço

Com a abordagem de inchaço espontânea descrita aqui, GUVs composto por DOPG, eSM, e Chol foram cultivadas durante a noite em 210 mM sacarose ou 100 mM NaCl, 10 mM Tris, com pH 7,5, formando um agregado visível. Colheita a agregação garante vesículas de alto rendimento. A ressuspensão na solução inchaço resultou em condições de solução simétrica trans-membrana. Para criar condições assimétricas, a agregação foi resuspended em um iso-osmolar sacarose ou solução de alta salinidade, respectivamente (Figura 2). A diluição resultante corresponde a uma troca de solução quase externo, minimizando a diluição do número de GUVs.

Mapeamento de diagrama de fase de GUVs usando microscopia de fluorescência

A presença de 0,1 mol % dos específicos da fase DiIC₁₈ nas GUVs permitiu a observação de seus Estados de fase através de microscopia de fluorescência de campo amplo. Vesículas, apresentando separação de fases S + L foram observadas através de um x 63 / 1.2NA para ser capaz de resolver finamente estruturado dedo-como domínios. Para todos os restantes casos, um 40 x / 0,6 objectivo at foi usado. Para evitar artefatos durante a inspeção visual de GUVs e para maximizar a reprodutibilidade, determinados critérios foram definidos que determinou quais vesículas a considerar para a análise do estado de fase (etapa de protocolo 3.6).

GUVs preparados a partir de misturas ternárias de DOPG/eSM/Chol de uma ampla gama de rácios inchados em sacarose ou solução de alta salinidade e observado na temperatura de quarto exibiram homogênea Lo ou fases Ld, Lo + Ld e S + L de separação de fases, veja a Figura 3. Figura 9 mostra vesículas exemplarily defeituosas, que não devem ser incluídas na análise dos dados e também mostra como identificar vesículas multilamellar.

Devido à sua história desconhecida, GUVs são prováveis que exibem variação composicional de dentro-lote³⁵. Portanto, o estado geral da fase de uma composição específica foi determinado em uma abordagem estatística. Chefe de populações de uma certa composição de lipídios foram atribuídas ao estado de fase que foi observado para ser dominante em uma amostra aleatória (etapa de protocolo 3.6). Ainda, composições perto da região de coexistência Lo + Ld renderam frequentemente lotes onde o estado de fase dominante formado por uma maioria estreita. Para tais casos de vagos, a inspeção visual foi repetida pelo menos três amostras independentes. A fração de vesículas com estado de fase idêntica (por exemplo, exibem Lo + Ld separação de fases) presente dentro de amostras aleatórias foi em média, o número de ensaios que foi tomado como o resultado final (Figura 10).

Os protocolos descritos resultaram em crescimento de chefe suficiente sobre uma ampla gama de diferentes proporções de DOPG, eSM e Chol em soluções de alta salinidade e sacarose. Extensas regiões dentro do diagrama de fase ternários poderiam ser mapeadas em condições de simétrica, bem como assimétrica solução de alta salinidade (Figura 11). As diferenças no comportamento de fase de vesículas observadas as condições de solução diferente foram discutidas em outra parte em detalhe⁹.

Observações do comportamento de fase depois de troca de amortecedor completo usando o método microfluídicos

A criação de condições de solução assimétrica por diluição resulta em resíduos da solução inchaço do lado de fora. Nossa abordagem microfluidic permite uma troca de solução externa completa. Figura 5A mostra o dispositivo microfluidic totalmente montado no palco microscópio confocal juntamente com tomada fluídico e entradas de controle de pressão. Os tubos são conectados através de tubos metálicos de 90 ° para permitir espaço transmitidas luz imagem de cima.

Para observação dentro do dispositivo microfluidic, um microscópio confocal com um x 63 / 1.2NA lente de objetiva de imersão de água foi implementada. Tal como acontece com as observações anteriores a granel, DiIC₁₈ foi usado para manchar a membrana. Ao fazer as observações da fase estado de GUVs preso no dispositivo, deve ter cuidado para não interpretar mal os dados. Devido a proximidade das GUVs aos postos, os caminhos de excitação e emissão de luz podem ser parcialmente bloqueados pelo PDMS, levando ao aparecimento de falso de domínios (Figura 12). Aqui, a detecção de luz transmitida é útil para verificar a posição das GUVs nos postos. Este efeito indesejado é particularmente proeminente para pequenas GUVs de menos de 10 µm de diâmetro. Nestes casos, os dados foram rejeitados. A imagem confocal na Figura 13A mostra uma seção de vesículas planar que atravessa um domínio-Lo presente na vesícula chefe. Neste caso, corte transversal planar varreduras mais acima ou abaixo da seção que não mostraram o domínio devido ao seu tamanho pequeno em relação ao que do chefe, que é por que ele teria sido perdido e a vesícula considerados para estar em um estado de fase homogênea. Daí, um z-pilha confocal deve ser usado para inspecionar a superfície inteira do chefe. Para microscopia de campo amplo, isto não pode ser um problema, porque a vesícula inteira pode ser fotografada de uma só vez.

Finalmente, exemplos são dados de GUVs antes e após a troca da solução exterior onde fica claro que a fase de Estados das membranas são (Figura 14). Cada dispositivo tem 60 câmaras (cada um com um par de posts para prender um chefe único), permitindo que dezenas de experimentos por dispositivo (consulte a Figura 4). No entanto, algumas GUVs podem se perder durante a troca da solução externa. Isto pode ser minimizado pelas seguintes etapas: 1) usando a albumina de soro bovino (BSA) revestimento para impedir a adesão do chefe/ruptura nos postos; revestimento é feito por expor as paredes da câmara de 20 mg/mL BSA para 60 min e posterior lavagem com o buffer de trabalho. Uma outra molécula de adesivo que poderia ser usada é poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)-enxerto³⁹. 2) cuidado correspondência osmótica das soluções de interior e exteriores, para evitar GUVs flácidos, que poderiam passar através do centro dos posts ou estouro da GUVs. 3) otimizar o procedimento de preparação do chefe para obter maiores que ~ 8 µm de diâmetro para evitar a passagem através do centro dos posts de vesículas.

Estados de fase de projeto e caracterização de câmara de temperatura controlada para observação de chefe

Nós projetamos uma câmara de fluxo simples, que apresenta conexões com o termostato externo de água (Figura 6). Obtivemos oCâmara de trituração de um bloco de alumínio. Em geral, o material da câmara não precisa ser calor condutivo, como a amostra é acoplada ao banho de água pelo vidro tampa inferior como mostrado na Figura 6B e 6C.

Independentemente da concepção exata, deve ser avaliado o desempenho da câmara. Especificamente, nós procuramos pela linearidade da temperatura da amostra com a temperatura do conjunto de externamente, qualquer deslocamento de temperatura sistemática e um gradiente de temperatura dentro da câmara. Os dois primeiros pontos foram abordados pela medição direta da temperatura dentro da câmara por uma sonda de fibra óptica de temperatura (por exemplo, FISO FTI-10). Nós também procuramos por um gradiente de temperatura dentro da suspensão do chefe. Tal um gradiente podia derivar de fluxo de calor para o exterior da câmara. Medições de temperatura espacialmente resolvidos pode ser obtido por um fluoróforo sensível de temperatura⁴⁰, veja a Figura 7.

Plotagem de dados e montagem para obter T_mistura de fase separada GUVs

Plotando a fração de GUVs homogêneas sobre a faixa de temperatura observada resultou em uma trajetória de ponto de sigmoidally em forma de dados. Combinamos os dados para o modelo de Boltzmann (protocolo secção 6.8), da qual o T_misturar poderia ser deduzido (Figura 8).

Figura 1: etapas experimentais durante o protocolo de inchaço espontâneo (painel superior) com correspondentes da fase de crescimento de vesículas (painel inferior). (A) A lipídios homogênea filme é espalhado em um prato PTFE áspera e secas de qualquer solvente. (B) os lipídios secados filme pre-então está inchada num ambiente saturado de água dentro de um recipiente fechado com água para facilitar a hidratação da bicamada. O frasco de vidro vazio contém a placa PTFE e permanece aberto durante esta etapa de hidratação. (C) os lipídios pre-inchados filme finalmente torna-se totalmente hidratado pela adição da solução de inchaço desejada na chapa de PTFE revestidos de lipídeos dentro do frasco de vidro. Para evitar a evaporação, o frasco de vidro é selado corretamente durante a incubação durante a noite. Para minimizar as variações de composição dentro de um lote, todas as etapas precisam ser realizadas a uma temperatura onde a mistura de lipídios é totalmente miscível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: chefe colheita. Filme de lipídios (A) A depositado, consistindo em DOPG/eSM/Chol no molares rácios de 20/20/60 com 0,1 mol % DiIC₁₈ estava inchado no buffer de alta salinidade composta de 100 mM de NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5. Adicionalmente, a tampa do recipiente de vidro foi selada com película de parafina. A região ampliada de interesse contém o agregado resultante do chefe. Sua aparência vermelha é uma consequência da presença de DiIC₁₈. (B) o GUVs foram colhidas com uma ponta de pipeta truncado. Nesta imagem, o agregado foi pipetado juntamente com 50 µ l de solução, de inchaço que foram transferidos para um frasco de fresco. (C) criar trans-membrana assimétrica de condições da solução, o agregado foi diluído em outra solução isotônica de externa. Aqui, o agregado juntamente com os 50 µ l de solução de inchaço foi resuspended em solução de sacarose µ l 950 resultando em uma diluição de 20x da solução de inchaço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: chefe de imagem. Amplo campo de imagens de fluorescência de GUVs dopados com 0.1 mol % DiIC₁₈ preparado e observada em sal simétrica ou soluções de sacarose, consistindo de diferentes proporções de DOPG, eSM e Chol (buffer de sal, da esquerda para a direita: 40/20/40, 50/20/30; 30/60/10; em sacarose, da esquerda para a direita: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). As imagens retratam GUVs em diferentes Estados de fase (coexistentes) avaliados de acordo com os critérios definidos no passo protocolo 3.6. Aqui, vesículas foram fotografadas através de um 40 X / 0,6 objetivo de at. Escala de barras = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Layout de design de canal microfluidic. GUVs digite a camada inferior de fluídico (canais descritas) através da entrada abaixo um reservatório. Um filtro bloqueia os restos indesejados do dispositivo. Então entram uma matriz de 60 câmaras (8 linhas e 15 colunas) cada contendo mensagens para o único chefe de captura (ver inserir). Cada câmara pode ser isolada dentro de uma anel válvula atuada por uma camada de controle (canais pretos cheios) acima da camada fluídico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: dispositivo Microfluidic. (A) fotografia de um dispositivo microfluidic usado para prender o GUVs único e totalmente trocar a solução externa. Rótulos indicam o reservatório para adicionar soluções (1), o 8 x entradas de pressão ligado para a unidade de controle na pressão (2), e a tomada fluídico ligado para a seringa e a bomba (3). Painel (B) mostra a unidade de controle de pressão com 8 válvulas cada regulação 1 tubo conectada ao dispositivo microfluidic. Aqui se abrem as válvulas #1 e #2 e, portanto, as válvulas correspondentes do anel estão fechadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: câmara de controle de temperatura. () Câmaraantes da assembleia. (B) câmara montado (para cima) com óculos de capa de 2 mm colada à parte superior e inferior. O espaçador de borracha laranja mede 0.5 mm de altura e é selado com uma lamela de 0,17 mm para observação da suspensão GUV fechada. Nesta imagem, uma sonda de temperatura é inserida para fins de calibração (fibra marrom saindo da câmara à direita). (C) a montagem Final no palco de um microscópio invertido sem a sonda de temperatura. O espaçador borracha laranja está agora virado para baixo. A borracha é adesivo suficiente para prender a amostra no lugar. Note que a luz pode ser transmitida através da amostra permitindo tanto epi-fluorescência e observações de campo brilhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: dados espacialmente resolvidos de temperatura dentro da câmara de observação obtidos através de medições de FLIM de um corante sensível de temperatura (aqui: 500 µM rodamina B) ⁴⁰. os pontos de dados obtidos em 0, 10, 30, 300 e 400 µm acima o deslizamento da tampa inferior. Os pontos vermelhos e azuis de dados foram medidos para a temperatura do banho de água situado a 30 ° C e 12 ° C, respectivamente. Os pontos de dados preto indica a esquerda do banho de água para equilibrar a temperatura ambiente. Pequenas variações em toda a câmara foram observadas, mas ficou abaixo de 0,5 ° C (barras cinza). A altura total da câmara é de cerca de 500 µm de acordo com a espessura do espaçador (veja acima). As barras de erro indicam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: localizando a temperatura miscibilidade. O gráfico mostra os pontos de dados individuais homogéneos (single-líquido estado) a fração de GUVs preparado a partir de DOPG/eSM/Chol na proporção de 30/40/30 dopada com 0,1 mol % DiIC₁₈ de três amostras aleatórias independentes (N = 20-40). Barras de erro representam o erro padrão dos meios. Pontos de dados foram equipados com o modelo de Boltzmann descrito na etapa 6,8 (linha preta contínua), da qual o domínio mistura temperatura T_misturar foi deduzida (linha contínua vermelha siga a abcissa) de acordo com o máximo de metade da sigmoidal curva na ordenada (tracejado preto). Valores iniciais e finais (₁ e₂) foram corrigidos para 0 e 1, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: vesículas defeituosas. Exemplos de vesículas gigantes preparado a partir de 20/60/20 DOPG/eSM/Chol e dopado com 0,1 mol % se DiIC₁₈ que não atendem aos critérios definidos no passo 4.2 fotografada por microscopia de fluorescência de campo amplo. Intervalos de exposição de intensidade de imagens individuais foram otimizados para a intensidade de fluorescência da vesícula retratada cada vez. Devido à presença de material adicional da membrana e encapsuladas vesículas menores, o estado de fase da vesícula em (A) não pode ser claramente definido. O aparecimento de vesículas este gigante não permite qualquer inspeção visual confiável para lamelaridade. Painel (B) retrata uma vesícula de que o interior é repleto de material da membrana. Como consequência, o sinal de fluorescência da membrana exterior vesículas é sobreposto com seu sinal interno, tornando impossível uma visualização de lamelaridade e domínios potenciais. (C) as intensidades de fluorescência das três vesículas gigantes diferentes são mostradas na comparação direta dentro da mesma escala de intensidade de visor. Esta imagem mostra que vesículas multilamellar gigantes (1, 2) podem ser identificadas por seu sinal de aumento da fluorescência, em comparação com o chefe (3). Aqui, multilamellar, bem como a exposição de vesículas gigante unilamellar separação de fases Lo + Ld. Vesículas em todas as imagens foram fotografadas através de um 40 x / 0,6 objetivo de at. Escala de barras = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: fração da fase Lo + Ld separados em média, pelo menos três amostras independentes de GUVs. Vesículas são compostos por 30/40/30 DOPG/eSM/Chol, perto da fronteira da região de coexistência Lo + Ld. As barras de erro para condições de sacarose simétrica ilustram a dispersão de lotes. O rótulo de ordenada descreve soluções dentro/fora as vesículas; sacarose: sacarose 210 mM; sal: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5; Barras de erro indicam desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: diagrama de fase de GUVs preparados a partir de DOPG, eSM e Chol mapeado em condições diferentes da solução usando sacarose 210mm (sacarose) e 100 mM de NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (sal). Chefe de fase afirma que foram exploradas em sacarose/sacarose (A; parte superior), sacarose/sal (entrada/saída) (A; secção poligonal inferior), sal sal (B; parte superior) e sal/sacarose (B; secção poligonal inferior). Os cartuns ilustram o padrão de domínio dominante dentro as seções destacadas e as respectivas condições de solução. Estados de fase de vesículas representados nas seções poligonais inferiores foram observados as condições de solução assimétrica, após diluição de chefe x 20. Adaptado da referência⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: artefatos em presas GUVs. Exemplo de um pequeno chefe, onde um domínio falso pode ser visto devido a proximidade com os posts (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Transmitida de campo brilhante luz imagem mostrando os posts (grEy) é sobreposto com a imagem de fluorescência confocal do chefe (laranja). Os posts são vistos para criar um padrão de interferência na imagem brilhante-campo. O fluorescência sinal fechar os posts (à direita) é reduzido, dando a aparência de separação de fases. Barra de escala = 5 µm.

Figura 13: exemplos de dois GUVs diferentes, capturados pelos posts PDMS, onde os Estados de fase são claramente visíveis. Lo (A) + Ld fase vesículas separadas de DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) uma vesícula de 40/30/30, exibindo Ld ou Lo monofásico. Uma z-pilha confocal da vesícula inteira foi examinada para confirmar que não há domínios (fora de foco) estavam presentes. As bordas dos posts são vistas no lado direito das imagens (cinza). Barra de escala = 5 µm.

Figura 14: comportamento resultante de fase após uma troca de fluídico completa usando o dispositivo microfluidic. O mesmo chefe é mostrado antes e após a troca da solução para o (A) simétrica sal/sal (entrada/saída) de sal/sacarose (entrada/saída) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, barra de escala é de 2 µm) e (B) simétrico sacarose/sacarose (entrada/saída) de sacarose/sal (DOPG (entrada/saída) eSM/Chol 30/40/30, escala bar = 3 µm). Adaptado da referência⁹.

Discussão

Produção de sucesso de GUVs para observações de estado de fase em condições de alta salinidade simétricas e assimétricas

Os protocolos aqui apresentados apresenta uma estratégia para avaliar a influência de assimetria de buffer e a solução de alta salinidade em estado de fase de membrana de GUVs carregadas sobre uma escala larga das composições. Um dos principais desafios para alcançar este objetivo foi a produção de GUVs carregados nos buffers de alta salinidade.

Nós produzimos com sucesso GUVs em solução de sacarose e alta-solução salina tampão por uma simples abordagem inchaço espontânea, que inclui uma etapa de pré-hidratação do filme lipídico depositado e uma etapa final de hidratação durante a noite para crescimento de vesículas. É importante notar que a deposição de lipídios deve ser feita em uma placa PTFE áspera para garantir lipídico mesmo espalhar-se para produzir vesículas unilamellar. Além disso, é essencial para executar cada passo durante a preparação de vesículas em uma temperatura onde o filme lipídico está em um estado de fase fluida e homogênea. Outra coisa, a população de vesículas pode ser polydisperse na composição e influenciar a análise de estado de fase final da população. O protocolo específico para o inchaço espontâneo de GUVs rende uma moita de vesículas que por um lado, oferece a possibilidade de re-suspendê-lo em pequenos volumes para obter altamente concentrada dispersões de vesículas e por outro lado, fornece solução assimétrica condições através da membrana, minimizando a diluição das vesículas^8,28. É essencial que durante a diluição de vesículas ou solução externa trocar, dentro e fora osmolarities permanecem combinado como alterações de morfologia causadas por incompatibilidades de osmolaridade podem induzir ou impedir de separação de fase Lo + Ld⁴¹ ou, no caso de hipotônica condições, pode levar à vesícula estourando.

Aqui, tenta otimizar protocolos de electroformation em solução de alta salinidade resultou na produção de não GUVs enquanto inchaço PVA-assistida rendeu vesículas multilamellar. Mesmo que ele requer mais longos tempos de preparação e resultados em lotes de vesículas de inferior qualidade^10,17, o sucesso da produção de vesículas carregadas por espontânea inchaço vem com vantagens adicionais. Exige um esforço mínimo ao mesmo tempo, resultando em rendimentos suficientes para análises de estatística em lotes e, ao contrário de electroformation, sem equipamentos sofisticados ou otimização foram necessárias. Além disso, sem contaminações por oxidação lipídica têm sido observadas^42,43. De acordo com a literatura não há nenhuma diferença entre as composições lipídicas das vesículas e as ações correspondentes do qual eles foram cultivados^7,17. Além disso, a formação de vesículas sobre um substrato PTFE não solicita a inclusão de quaisquer contaminações em contraste com gel-assistida métodos inchaço onde moléculas estrangeiras podem ser introduzidas pelo substrato²³. Electroformation vem com mais inconvenientes relacionados à diluição excessiva vesículas ao criar condições de solução assimétrica. GUVs produzidos por electroformation estão normalmente presentes como uma dispersão homogênea (em contraste com a suspensão de vesículas altamente concentrado na forma de um grupo formado durante o inchaço espontâneo). Qualquer diluição da solução externa diluiria substancialmente o número de vesículas também. Além disso, ao longo deste trabalho, observou-se que DOPG/eSM/Chol GUVs produziram pela electroformation em sacarose tornou-se instável, se diluído em tampão de alta salinidade. Fluorescência de patches de lipídios do slide de microscópio indicado que vesículas explodiriam antes sua inspeção visual foi possível. Tal instabilidade pode ser atribuída a uma tensão elevada da membrana das vesículas preparado pela electroformation em comparação com aqueles obtidos por inchaço espontâneo¹⁰.

Embora a diluição de vesícula é uma abordagem fácil e rápida para criar condições de solução GUV assimétricas, ele apenas realiza uma troca parcial solução externa, embora em uma fração de alta (aqui: 95%, Figura 2), como após diluição, vestígios de que o solução de inchaço permanecerá. A escolha do grau da troca da solução externa é um trade-off entre pipetagem até a moita de vesículas em conjunto com a solução de inchaço (seção 2) e não diluir demais. Portanto, nós introduzimos uma abordagem alternativa microfluidic discutida em outra parte em detalhe³⁷ que permite uma troca rápida e completa solução externa durante observações de estado de fase de chefe para verificar as fase estado de observações para diluído vesículas. As observações de variações de estado de fase quando se muda de simétrica para condições de solução assimétrica de fato foram observadas para estar de acordo. Além disso, ambos os métodos para gerar condições de solução assimétrica mostradas aqui são comparativamente rápido (comparar ref.⁸) e vem sem riscos conhecidos de alterações de composição local (comparar referências^30,31), aumento da tensão de membrana (comparar referência³²), ou aquecimento local (comparar referência³³), quanto os métodos alternativos discutido na introdução. Durante a captura de microfluidic, um equilíbrio osmótico entre a vesícula interior e o exterior não é apenas essenciais para evitar artefatos de estado de fase como mencionado acima, mas também causada por condições de solução hipertônica de deflação podem causar os GUVs presos a escorregar através do posts depois de uma troca de solução externa.

Mesmo que o inchaço espontâneo foi aplicado com sucesso para crescer sem carga vesículas de um sistema DOPC/eSM/Chol, em outros casos, a ausência de cargas podem afectar o GUV inchaço devido a consequente falta de repulsão entre os bilayers individuais⁴⁴ . Estendendo o período pré-inchaço ou introduzindo headgroups volumosos lipídica pode contrariar esta questão⁴⁵. Além disso, a estabilidade da vesícula após sua diluição em soluções diferentes daquele usado para inchaço pode diferir para composições diferentes lipídios e meios de diluição, que aqui não temos investigado. Também não exploramos a possibilidade de ajustar o diâmetro médio do chefe com o método de preparação aqui apresentado. Mas parâmetros tais como a composição de vesículas e inchaço solução são susceptíveis de influenciar os resultados. A aplicação de métodos alternativos⁴⁶ pode produzir vesículas maiores para os lipídios e soluções utilizados aqui, no entanto, eles podem vir com outros inconvenientes associados com o método. A abordagem acima descritas para produzir GUVs em condições de alta salinidade simétricas e assimétricas fornece uma ferramenta potencial para estudos adicionais de vesículas constituído por composições diferentes lipídios e dispersos em diferentes meios. Que não exploramos as possibilidades, futuros julgamentos mostrará como geralmente os métodos de preparação e diluição de chefe podem ser aplicados.

Observando a separação de fases em diferentes temperaturas

Existem diferentes configurações experimentais adequadas para estudar GUVs a diferentes temperaturas. Enquanto essas configurações não são comumente descritas em detalhe dentro da literatura, o trabalho atual apresenta uma montagem básica aplicável para tais estudos.

_content "> controle medições mostram que a temperatura disto internamente projetou e construiu a câmara é precisamente controlada por um termostato e gradientes de temperatura dentro da Câmara estão dentro da resolução de temperatura experimental. Assegura-se que as condições experimentais térmicas são consistentes com a leitura do termostato.

Durante a avaliação dos Estados de fase chefe sobre uma escala de temperatura larga, é importante que as observadas vesículas são bem equilibradas após a temperatura ter sido alterada. Uma maneira de assegurar isto é para verificar se há histerese. Se houver histerese, os passos de temperatura devem ser diminuídos e/ou vezes de equilibração aumentaram. Como temperatura controle neste trabalho é estabelecida por um termóstato à base de água, a gama de temperaturas de funcionamento está idealmente limitada a 0 - 100 ° C. Este intervalo pode ser expandido usando outros líquidos de controle de temperatura como óleo ou empregando outras configurações, por exemplo, um dispositivo Peltier. Na prática, a temperatura também é limitada pela possível condensação ou evaporação. Além disso, para temperaturas longe da temperatura ambiente, a ocorrência de um gradiente de temperatura de estado estacionário em toda a câmara de observação se torna mais provável. Além disso, os equipamentos de imagem podem ser prejudicado em temperaturas extremas. Para intervalos de temperatura típico apropriados para estudos de vesículas lipídicas (~ 10-50 ° C^7,9) danos ao equipamento de observação devem ser considerado, mas normalmente não é esperado.

Artefatos de observação de domínio de vesículas

Há um número de fontes para artefatos de observação usando microscopia de fluorescência de campo amplo. Primeiro de tudo, um deve estar ciente de que a resolução máxima r do objeto aplicado para a inspeção visual dos Estados de fase de vesículas determina o limite de detecção dos domínios de lipídios de acordo com:

onde λ é o comprimento de onda de emissão, e nd é a abertura numérica do objectivo. Um objetivo típico com um 40 x ampliação e um at de 0,6 que detecta de emissão verde acender cerca de 560 nm atingiria uma resolução óptica de ~0.6 µm. portanto, estudos que comparam a Estados de fase de vesículas, feitas a partir de misturas de lipídios particular entre diferentes condições devem usar o mesmo objectivo para a mesma mistura de lipídios.

Outro artefato é a ocorrência de domínios de lipídios em consequência da foto-oxidação lipídica devido a uma exposição prolongada à luz de excitação⁴¹. Foto-dano ocorre preferencialmente em metades de lipídios de hidrocarboneto insaturado. Na verdade, algumas composições de lipídios, tal formação de domínio das vesículas inicialmente homogêneas foi observada aqui após um longo período de exposição à luz de excitação (~ 30 s). Para combater esse problema, a luz de excitação foi mantida focada em um campo de visão por apenas alguns segundos para a avaliação do estado de fase. Portanto, o DiIC₁₈ era adequado para os nossos propósitos. Outros corantes, no entanto, podem ser muito mais sensíveis e podem precisar de ser tratado em intensidades de excitação mais baixas e com tempos de exposição à luz de excitação mais curtos.

Tensão de cisalhamento mecânico da transferência das vesículas pipeta mistura potencialmente domínios temporariamente, assim, distorcer o comportamento de fase de vesículas aparentes. Para alguns lotes, vesículas diferentes apresentaram comportamentos diferentes fase 0 min e 5 min após a pipeta de transferência no sentido do lamela de microscópio. Também a tensão de cisalhamento induzida pelo fluxo do fluido no dispositivo microfluidic tem demonstrado resultar em domínio⁴⁷de mistura. Vesículas devem ser deixadas sem ser perturbado por uma quantidade suficiente de tempo para equilíbrio antes de observação. Dentro deste estudo, vesículas presas no dispositivo microfluidic foram deixadas sem ser perturbado por 1h após o carregamento de vesícula e as trocas de solução antes de observação.

Para evitar alguns das dificuldades acima mencionadas, bem como a restrição imposta pelo limite de difração de luz, métodos alternativos, tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear⁴⁸ ou de técnicas de microscopia de super resolução⁴⁹ poderia ser empregada.

Conclusão e perspectivas

O trabalho apresentado demonstra um conjunto de métodos que permite a análise da influência das condições de alta salinidade simétrica e assimétrica solução na separação de fases de membrana. Todos os métodos apresentados são adequados para outras aplicações. O dispositivo microfluidic, por exemplo, fornece uma plataforma para estudar a cinética de formação de domínio e desaparecimento após a indução de assimetria de solução. Além disso, aparência de domínio em função da concentração de sal poderia ser analisada assim. Todos os métodos também podem ser usados para examinar a influência sobre o comportamento de fase usando outras soluções de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol), sal de sódio	Avanti Polar Lipids	840475C	abreviado como DOPG no texto
esfingomielina de ovo de galinha	Avanti Polar Lipids	860061	abreviado como
eSM colesterol (lã ovina, > 98 %)	Avanti Polar Lipids	700000	abreviado como Chol
1,1'-dioctadecil-3,3,3',3',3'-perclorato de tetrametilindocarbocianina	Sondas moleculares	D-282	abreviadas como DiIC18
Clorofórmio, grau HPLC (≥ 99,8%)	Merck
NaCl (> 99,8%)	Roth
HCl (37%)	Roth
Tris (≥ 99,9%)	Roth
Sacarose (≥ 99,5 %)	Sigma Aldrich
Parafilm
Frasco roscado 45x27 mm, 15 mL	Kimble		Soda fundo plano, tampa de rosca branca
medidor de pH	Mettler Toledo	MP220
Osmômetro	Gonotec	Osmomat030
Microscópio de epifluorescência	Zeiss	Axio Observer Microscópio
	Leica	TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA	Zeiss	LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA	Leica	506174
Objective 63x, 0.9 NA	Leica	506148
Lâmina de microscópio, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Glä ser
Lamínula, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Glä
		"M"	Bremix
, 5 mL, 10 mL	Braun
0.45 µ filtro de seringa m	GVS North America	Cameo 25AS, acetato de 1213723	, estéril