Artigo de método

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

DOI:

10.3791/56039

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12 de setembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Resumo

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A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.

Introdução

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Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou ....

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Protocolo

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todos os protocolos do mouse são aprovados pelo Comité de uso na Universidade de Yale e institucional Cuidado Animal.

1. Clonal análise e mapeamento de destino embrionário In Vivo

Nota: nós usamos essas abordagens amplamente para avaliar as origens das células e sua arquitetura clonal em modelos de desenvolvimento e doença 7 , 8 , 9 , 10.

  1. Configurar acasalamento entre ratos com um CreER e ratos com um repórter Cre.
    Nota: Um CreER é usado para SMC marcaçã....

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Resultados

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Em uma análise clonal representativa da SMCs em mutante de embriões para o Eln (o gene que codifica a elastina de proteínas da matriz extracelular), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 ratos foram acoplados a Eln(+ /-) ratos também carregando o multi cor ROSA26R(Rb/Rb) repórter. Conforme descrito na etapa 1, plugues foram verificadas, grávidas barragens foram induzidas com uma injeção única tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5, e foram.......

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Discussão

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Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abordagens para e.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Dean Li para a partilha de protocolo do seu laboratório para isolamento de SMC da aorta. Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 para D.M.G), a American Heart Association (14GRNT19990019 brasileira de D.M.G.) e Universidade de Yale (Brown-Coxe Fellowship para A.M. e inicialização fundos para D.M.G.).

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
TamoxifenoSigmaT5648
óleo de milhoSigmaC-8267Veículo para tamoxifeno
4-OH-tamoxifenoSigmaH7904Metabólito ativo de tamoxifeno
ProgesteronaSigmaP8783-5GUso na metade da concentração de tamoxifeno
OCT compostoSakura tecido tek4583Para fazer crioblocos
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542Coloração IHC do núcleo, concentração final 5 mg/mL
Cy3 anticorpo anti-SMA diretamente conjugadoSigmaA2547Coloração IHC de SMA, diluição final 1:500
Anticorpo anti-CD31BD Pharmingen550274Coloração IHC de GFP, concentração final 0,006 mg/mL
Anticorpo anti-GFPThermo Fisher ScientificA-11121Coloração IHC de CD31, concentração final 0,0016 mg/mL
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, Alexa 647Life Technologiesa21244Coloração IHC, concentração final 0,004 mg/mL
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, Alexa 488Life Technologiesa11008Coloração IHC, concentração final 0,004 mg/mL
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014Para cultura de células
FBSThermo Fisher Scientific10437028
Anticorpo bloqueador de anti-integrina beta3BD Biosciences553343Clone 2C9. G2, concentração final 0,02 mg/mL
ColagenaseWorthington Biochemical Corp44H14977APara digerir a aorta
ElastaseWorthington Biochemical Corp34K15139Para digerir a aorta
Antibiótico-antimicótico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Recombinante humano FGFPromegaG5071
Recombinante humano EGFPromegaG5021
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Anfotericina BThermo Fisher Scientific15290026
Placas de cultura de tecidosCorningCLS430165
Alzet mini-bomba osmóticaDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Vertical Microscópio FluorescenteNikon 
  TCS  SP5Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2 ratosThe Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2Obtido do laboratório dos camundongos Dr. Pierre Chambon e Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2O Laboratório Jackson 8463
camundongos ROSA26R(mTmG/mTmG)O Laboratório Jackson  
camundongos ROSA26R(EYFP/EYFP)O Laboratório Jackson   006148 
ROSA26R (Confete/Confete) ratosO Laboratório Jackson 13731
camundongos ROSA26R(Rb/Rb)Laboratório do Dr. Irv WeissmanObtido do laboratório do Dr. Irv Weissman
Camundongos 026862

Referências

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  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....

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