Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Resumo

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Resumo

A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.

Introdução

Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou camada externa de tecido conjuntivo e fibroblastos. A grande maioria dos estudos em foco de biologia vascular em células endoteliais, investigando a formação de novos tubos de endoteliais célula-alinhado a angiogênese. Em comparação, a SMCs recebem relativamente pouca atenção. No entanto, SMCs são um tipo de célula fundamental na construção da parede arterial normal e em patologias vasculares.

A aorta é a artéria de maior calibre do corpo, recebendo o débito cardíaco do ventrículo esquerdo do coração. Ele está aflito por diversas doenças humanas, incluindo a arteriosclerose, aneurisma e dissecação. Em organismos adultos, a aorta e seus ramos principais são intensamente estudados modelos de doença vascular. Por exemplo, alta dieta gorda alimentou ratos que são nulos para o gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade ou apolipoproteína E, desenvolver aterosclerose, e estudos de mapeamento de destino recentes indicam que SMCs pré-existentes dão origem a vários tipos de células no placa aterosclerótica¹. Em aneurismas da aorta, as alterações patológicas incluem SMC apoptose e remodelação de^2,3da matriz extracelular.

Substancialmente menos é conhecido sobre a morfogênese SMC e patogênese durante os períodos embrionários e perinatais. Aqui, nós fornecemos protocolos para o estudo embrionário e perinatal da aorta SMCs na vivo, em explantes de tecidos e de células isoladas. Por exemplo, a primeira seção do protocolo delineia destino mapeamento e análise clonal em camundongos embrionários. CRE recombinase expressado sob o controle de um promotor específico células facilita a marcação de células específicas e sua progênie^4,5,6; no entanto, controle temporal de células específicas de rotulagem pode ser desafiador durante o desenvolvimento embrionário em camundongos. Neste contexto, com embriões expressando a CreER condicional sob um promotor ativo em SMCs (e.g.,Myh11 ou Acta2) e uma repórter de Cre, nós fornecemos métodos de injeção de tamoxifen ou seu metabólito ativo 4-OH-tamoxifeno em barragens de grávida e para analisar as pilhas etiquetadas em embriões ou prole pós-natal. Além disso, em contraste com os estudos de mapeamento de destino, que predominantemente utilizam Cre repórteres com um único repórter fluoróforo^1,7, análise clonal é substancialmente reforçada com repórteres de multi cores Cre.

As segunda e terceiros seções do protocolo descrevem métodos para isolamento e cultivo embrionários explantes da aorta e da aorta SMCs de neonatos, respectivamente. Essas abordagens permitem a manipulação das vias de sinalização, especificamente em explantes aórtica ou SMCs e para analisar os efeitos diretos dos agentes farmacológicos. Assim, o papel de genes específicos no tecido de interesse pode ser projectado de forma muito mais rápida do que através de manipulações genéticas tradicionais em camundongos. Além disso, os estudos isolados de SMC facilitam a análise de migração celular e a adesão, que são tecnicamente limitado em vivo.

Finalmente, a quarta seção do protocolo delineia a colocação de uma bomba mini osmótica subcutânea carregada com agentes farmacológicos em camundongos grávidos (ou não-grávidas). Esse método facilita a análise dos efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, causado por agentes que requerem infusão contínua por causa do metabolismo rápido. A alternativa de injeções frequentes não é prática para muitos agentes e deve ser evitada, como pode causar desconforto significativo na barragem grávida.

Protocolo

todos os protocolos do mouse são aprovados pelo Comité de uso na Universidade de Yale e institucional Cuidado Animal.

1. Clonal análise e mapeamento de destino embrionário In Vivo

Nota: nós usamos essas abordagens amplamente para avaliar as origens das células e sua arquitetura clonal em modelos de desenvolvimento e doença ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. Configurar acasalamento entre ratos com um CreER e ratos com um repórter Cre.
   Nota: Um CreER é usado para SMC marcação; Myh11-CreERT2 ou Acta2-CreERT2 ratos ^{11 , 12} é comumente usado para essa finalidade. Usamos para marcação amplamente tecidos embrionários de ratos ROSA26R-CreERT2 ¹³.
   1. Para análise clonal, usar um multi cor Cre repórter (por exemplo, confetes ou ratos de arco-íris [Rb]) ^{8 , 14 , 15} e para o mapeamento de destino, use um repórter de Cre de cor única (por exemplo, ROSA26R-YFP ratos ¹⁶) ou o repórter de Cre duplo-cor ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) ¹⁷.
      Nota: Este regime de reprodução usa ratos adultos que são 2-6 meses de idade (geralmente ~ 30 g) e irão gerar embriões com um CreER e um repórter Cre.
2. Verifique se vaginal plugues de manhã usando um metal sondar e consideram o meio-dia no dia da detecção do plug como dia embrionário (E) 0.5.
3. Separar a fêmea do macho, quando é detectado um plug.
4. Prepare 4-OH-tamoxifeno e soluções de trabalho tamoxifeno.
   1. Para 4-OH-tamoxifeno, dissolver 5 mg em 50 µ l de etanol 100%, vórtice por 2 min e adicione 450 µ l de óleo de milho. No gelo, proceda à sonicação no nível de saída 2 durante 10 ciclos de s com descanso entre ciclos até amostra esfria para baixo. Depois de amostra é completamente dissolvida (normalmente ~ 4-5 ciclos de sonication), tomar 200 µ l de solução lisada e dissolver em 1.800 µ l de óleo de milho para fazer a solução final de trabalho (4-OH-tamoxifeno, 1 mg/mL).
   2. Para tamoxifeno, diluir a 50 mg/mL em etanol 100% e vórtice até que esteja dissolvido. Diluído em óleo de milho para fazer a solução final de trabalho (tamoxifeno, 10 mg/mL) e agitar a 45 ° C, para garantir que ele é completamente dissolvido.
5. Para indução embrionária precoce, injetar 4-OH-tamoxifeno intraperitonealmente uma barragem grávida.
   1. Usar injeções 4-OH-tamoxifeno (até ~ 150 µ g por grávida do mouse, ou cerca de 5 mg/kg de peso corporal) em 5.5 e posteriormente como rendem barragem viável, embriões e filhotes.
   2. Uso de tamoxifeno em doses de 0,5 - 1,5 mg (ou 17-50 mg/kg) para barragens grávidas com embriões em ~ E9 e daí em diante. Use uma agulha 30G para injeções todos.
      Nota: A filtração através de um filtro de 0,22 µm é normalmente usada para esterilizar todas as misturas antes da injeção.
6. Para análise clonal, usar injeções intraperitoneal de altas doses de 4-OH-tamoxifeno (por exemplo, 5 mg/kg) ou tamoxifeno (por exemplo, 50 mg/kg) para marcar células múltiplas.
   1. Para marcar células individuais, titula-se a dose de 4-OH-tamoxifeno ou tamoxifeno tal que no tecido de interesse (ou seja, a aorta), quase todos os embriões analisados (conforme descrito abaixo no final desta seção) tem ou não células rotuladas ou apenas células de uma única cor; Esta é a dose limiar.
7. Para marcar células no período gestacional meados-final e de traçar seu destino ou clonality no mouse pós-natal, injetar progesterona na cavidade intraperitoneal da barragem grávida concomitantemente com tamoxifeno em um 1:2 (progesterona: tamoxifeno) relação dose.
   Nota: Doses de tamoxifeno são 17-50 mg/kg, e doses de progesterona são 8.5-25 mg/kg (ou seja, metade das doses tamoxifeno). A injeção de progesterona pode atrasar o trabalho por ~ 1-2 dias.
8. Euthanize a barragem grávida com embriões de uma idade desejada, usando um método de soltar aberto, onde a represa é colocada num recipiente contendo algodão ou gaze embebida com isoflurano não diluído. Confirmar a morte, abrindo a cavidade torácica para induzir o pneumotórax, removendo os órgãos vitais, e/ou realizando deslocamento cervical.
9. Limpar o abdômen com etanol a 70%. Use a tesoura para abrir o abdômen e dissecar para fora do útero. Retire os embriões do útero e cuidadosamente separar os embriões a placenta e o saco vitelino usando fórceps.
10. Eutanásia os embriões no E15 ou mais velhos, realizando deslocamento cervical ou decapitação com tesoura cirúrgica ou uma lâmina afiada.
    Nota: Embriões mais jovens que E15 morrem rapidamente após eutanásia da mãe e/ou a remoção dos embriões de mãe.
11. Coloque os embriões em PBS gelado e corte um pequeno pedaço da cauda com uma tesoura de genótipo para o repórter CreER e Cre.
12. Consertar os embriões em 4% paraformaldeído a 4 ° C por 2 h. lavagem os embriões três vezes em PBS e então incubar os embriões em 30% de sacarose em PBS em tubos de 15 mL, esperando até que afundam, que pode demorar até dois dias.
13. Preenchimento plástico congelando moldes até 2/3 do nível máximo com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Coloque cada embrião verticalmente no molde, inteiramente submergido em outubro incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT) para minimizar bolhas.
14. Lugar congelar blocos de tecido na posição vertical em um gelo seco, banho de etanol 70% para congelar. Armazenar os blocos a -80 ° C.
15. Definir a temperatura do criostato a-22 ° C e cortar blocos para gerar seções transversais através da aorta inteira, 10-20 µm de espessura. Secar as lâminas no RT por 30 min antes de armazená-los no -80 ° C.
16. Descongelar os slides no RT, protegido da luz, para evitar o branqueamento de fluorophores. Lave os slides com PBS-Tween20 0,1%.
    1. Para análise clonal, mancham os slides para núcleos (DAPI, 5 mg/mL) e imagem diretamente outros fluorophores no reporter de arco-íris Cre (Cerulean: 433-nm de excitação máxima, 475-nm de emissão máximo; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
       1. Uso o seguinte filtros para detectar fluorophores com um microscópio fluorescente vertical: DAPI (excitação máximo largura de banda/350/50 nm, emissão/largura de banda de max 460/50 nm), Cerulean (excitação 436/20 nm, emissão 480/40 nm), texas vermelho (excitação 560 / 40 nm, emissão 630/75 nm) e um filtro personalizado para separar mOrange (excitação 577/10 nm, emissão 630/50 nm) mCherry.
    2. Para o mapeamento de destino com o repórter de Cre mTmG, detectar GFP (484 nm, 510 nm), por imagem diretamente ou usando immunostaining. Para a imagem latente com um microscópio fluorescente na posição vertical, use um filtro GFP (excitação 470/40 nm, nm de emissão 525/50).
    3. De imunocoloração, incubar seções com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, lavar com 0,1% Triton X-100 em PBS e então incubar com anticorpos secundários para 1 h. uso anti-CD31 (concentração final 0,0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) e Cy3-anticorpos primários diretamente conjugado anti-SMA (diluição final de 1: 500) e uso secundário antibodiedirectamente conjugada com fluorophores (diluição final de 1: 500) (consulte a Tabela de materiais) de s.
17. Imagem de slides com um microscópio fluorescente vertical (ampliação: 4x - 20 X) ou microscópio confocal (10 X X-63). Para alta ampliação, use um 63 da imagem latente confocal x objetivo de óleo com uma abertura numérica de 1,4-0,6 e um tamanho de quadro de 1.024 x 1.024 pixels.

2. Explantes Embryonic Aorta cultura

Nota: esta abordagem foi usada anteriormente para avaliar o papel da integrina beta3 em estenose do explantados Eln ^{(- / -)} aorta embrionárias ^{9 , 18}.

1. eutanásia em uma barragem cronometrado-grávida em E15.5 por inalação de isoflurano em excesso, conforme passo 1.8, acima.
2. Colheita e eutanásia os embriões, conforme etapas 1.9-1.10, acima.
3. Posição do embrião passivamente e fixar os membros estendidos ao Conselho de dissecação. Visualizar com um estereoscópio de dissecação e use uma tesoura para cortar uma incisão vertical do abdômen através do osso esterno no tórax superior. Embora dissecar o timo, traqueia, pulmões, esôfago, fígado e intestino.
4. Gentilmente puxe o coração ventralmente usando fórceps e usar tesouras para dissecar a aorta longe a face dorsal das cavidades torácicas e abdominais. Para liberar a aorta, corta a raiz proximal e as distais posições abdominais.
5. Coloque a aorta em PBS estéril gelada em uma capa de cultura de células. Transferir a aorta para uma placa de 24 e a cultura em DMEM com 0,5% FBS para até 24 h a 37 ° C.
   Nota: O meio de cultura pode ser complementado com um anticorpo de bloqueio (por exemplo, anti-integrina αvβ3 anticorpo em 0,02 mg/mL ⁹; Veja a Tabela de materiais) ou um agente farmacológico.
6. Lave a aorta duas vezes com PBS e então corrigi-lo com paraformaldeído 4% por 20 min.
7. Lavar três vezes com PBS e transferência da aorta com um tubo de 1,5 mL com 30% de sacarose em PBS. Depois a aorta coletores, fazer blocos congelados do tecido, corte de seções e delgados, como descrito nos passos 1.13-1,15, acima.

3. Isolamento de SMC da Aorta Perinatal

Nota: esta abordagem está sendo usada para comparar a biologia da SMCs na aorta isolada de ratos perinatais Eln ^{(- / -)} e sua.

1. Euthanize murino um filhote no dia pós-natal (P) 0,5, por deslocamento cervical ou por decapitação com tesoura cirúrgica ou uma lâmina afiada, como descrito na etapa 1.10, acima.
2. Executar etapa 2.3 e então, depois de abrir o tórax e abdômen, punção do ventrículo esquerdo com agulha 23G. Tubos plásticos de uso para conectar a agulha para seringa estéril contendo PBS mantido verticalmente em uma posição elevada para que PBS flui para o ventrículo esquerdo por gravidade. Permita a infusão de PBS estéril em ventrículo esquerdo até o fígado blanches.
   1. Usar fórceps para remover o tecido adventícia do lado de fora da aorta e dissecar a aorta, conforme descrito na etapa 2.4.
3. Digerir a aorta em uma única solução de DMEM (500 µ l) suplementado com 225 U/mL colagenase, 2.25 elastase U/mL e 1 x antibiótico antimicótico por 45 min a 37 ° C. manualmente agitar o tubo cada 5-10 min.
4. Do bairro de cultura celular estéril, titurate o tecido digerido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 200 µ l para gerar uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão de célula única para um tubo de 15 mL, adicionar 2 mL de DMEM e centrifugar a 920 x g durante 5 min à 25 ° C.
5. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 3 mL de meio de cultura SMC (DMEM contendo 10% FBS suplementado com rhFGF de 1 µ g/mL, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL penicilina/estreptomicina e anfotericina B de 2,5 µ g/mL). Transferir para uma placa de cultura de 35 mm.
   Nota: Após o isolamento inicial, ~ 400.000 células são obtidas de uma único P0.5 sua aorta; ~ 300.000 dessas células são SMCs.
6. Cultura as células a 37 ° C e mudar de meio de cultura fresco SMC a cada 3 dias. Usando as técnicas padrão com tripsina, passagem das células quando confluentes. Para experiências, usar células de passagens 3-7.

4. Ratos de colocação de mini bomba osmótica em grávidas (ou Non-grávida) subcutâneos

Nota: esta abordagem foi usada anteriormente para fornecer continuamente um agente farmacológico (por exemplo, integrina β3 e β5 inibidor cilengitide) de embriões no útero ⁹. A bomba foi inserida na barragem grávida no E13.5 e mantida até o parto.

1. Anestesiar os ratos com 2-5% de isoflurano em oxigênio (taxa de fluxo de 1 L/min) para indução e 1-3% para manutenção. Use o reflexo de dedo-pinch para monitorar o nível de anestesia e ajuste o agente anestésico, conforme necessário. Administrar a buprenorfina subcutânea (0,05 - 0,1 mg/kg) para analgesia.
2. Raspar a parte inferior das costas com clippers. Use cortinas estéril, luvas e instrumentos e manter os ratos em uma placa de aquecimento cirúrgico durante a cirurgia.
3. Coloque cada rato na posição prona e esfregar as costas com betadine, seguido de álcool isopropílico. Aproximadamente 3-5 cm rostral à base da cauda na parte inferior das costas, usar um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele 0,5 - 1,0 cm de comprimento, sem ferir o músculo subjacente.
4. Inserir a incisão com uma pinça hemostática e criar uma bolsa subcutânea rostral para implantação de bomba abrindo e fechando as mandíbulas hemostato.
5. Preencher uma bomba osmótica mini com o agente de escolha, conforme o fabricante ' as diretrizes de s (consulte a Tabela de materiais). Introduza a bomba preenchida no bolso e fechar a incisão com grampos ou suturas não absorvíveis de 6-0. Certifique-se de que o tempo cirúrgico total é menos de 10 min.
6. Post-operatively, monitorar os ratos cada 15 min até que eles se recuperaram de prostração esternal. Administre subcutânea buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) a cada 6-12 h por 48 h. Quando os ratos têm recuperado da anestesia geral, monitorá-los diariamente. Remover os grampos ou suturas pós-operatório de 7-10 dias.

Resultados

Em uma análise clonal representativa da SMCs em mutante de embriões para o Eln (o gene que codifica a elastina de proteínas da matriz extracelular), Eln^{(+ /-)}, Acta2-CreER^T2 ratos foram acoplados a Eln^{(+ /-)} ratos também carregando o multi cor ROSA26R^(Rb/Rb) repórter. Conforme descrito na etapa 1, plugues foram verificadas, grávidas barragens foram induzidas com uma injeção única tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5, e foram...

Discussão

Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abordagens para e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tamoxifeno	Sigma	T5648
óleo de milho	Sigma	C-8267	Veículo para tamoxifeno
4-OH-tamoxifeno	Sigma	H7904	Metabólito ativo de tamoxifeno
Progesterona	Sigma	P8783-5G	Uso na metade da concentração de tamoxifeno
OCT composto	Sakura tecido tek	4583	Para fazer crioblocos
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	Coloração IHC do núcleo, concentração final 5 mg/mL
Cy3 anticorpo anti-SMA diretamente conjugado	Sigma	A2547	Coloração IHC de SMA, diluição final 1:500
Anticorpo anti-CD31	BD Pharmingen	550274	Coloração IHC de GFP, concentração final 0,006 mg/mL
Anticorpo anti-GFP	Thermo Fisher Scientific	A-11121	Coloração IHC de CD31, concentração final 0,0016 mg/mL
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, Alexa 647	Life Technologies	a21244	Coloração IHC, concentração final 0,004 mg/mL
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, Alexa 488	Life Technologies	a11008	Coloração IHC, concentração final 0,004 mg/mL
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	Para cultura de células
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
Anticorpo bloqueador de anti-integrina beta3	BD Biosciences	553343	Clone 2C9. G2, concentração final 0,02 mg/mL
Colagenase	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	Para digerir a aorta
Elastase	Worthington Biochemical Corp	34K15139	Para digerir a aorta
Antibiótico-antimicótico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Recombinante humano FGF	Promega	G5071
Recombinante humano EGF	Promega	G5021
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Anfotericina B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Placas de cultura de tecidos	Corning	CLS430165
Alzet mini-bomba osmótica	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Vertical Microscópio Fluorescente	Nikon
TCS  SP5	Leica
Branson Sonifier 450	VWR
Myh11-CreERT2 ratos	The Jackson Laboratory	19079
		Acta2-CreERT2	Obtido do laboratório dos camundongos Dr. Pierre Chambon e Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2	O Laboratório Jackson	8463
camundongos ROSA26R(mTmG/mTmG)	O Laboratório Jackson
camundongos ROSA26R(EYFP/EYFP)	O Laboratório Jackson	006148
ROSA26R (Confete/Confete) ratos	O Laboratório Jackson	13731
camundongos ROSA26R(Rb/Rb)	Laboratório do Dr. Irv Weissman		Obtido do laboratório do Dr. Irv Weissman