Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.
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Artigo de método
Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fusão das prateleiras palatinas secundárias para formar o palato secundário intacto é um processo chave no desenvolvimento de mamíferos e a sua ruptura pode levar ao palato secundário fissurado, uma anomalia congênita comum em humanos. A fusão secundária do palato tem sido amplamente estudada, levando a vários mecanismos celulares propostos que podem mediar esse processo. No entanto, esses estudos foram realizados principalmente em tecidos embrionários fixos em pontos de tempo progressivos durante o desenvolvimento ou em culturas de explantes fixas analisadas em pontos de tempo estáticos. A análise estática é limitada para a análise de processos morfogenéticos dinâmicos, como a fusão palatina e quais tipos de comportamentos celulares dinâmicos medeiam a fusão palatina, é incompletamente entendido. Aqui descrevemos um protocolo para imagens vivas da fusão de palato secundário ex vivo em embriões de camundongo. Para examinar os comportamentos celulares da fusão palatina, a queratin14 -cre específica do epitélio foi utilizada para rotular as células epiteliais do palato em ROSA26-mTmG embriões repórter flox . Para visualizar a actina filamentosa, utilizaram-se ratos repórter Lifeact-mRFPruby . A imagem viva da fusão secundária do palato foi realizada por dissecção de prateleiras palatais secundárias recentemente aderidas de embriões de dia embrionário (E) 14,5 embriões e cultura em meio contendo agarose em um prato de fundo de vidro para permitir a imagem com um microscópio confocal invertido. Usando esse método, detectamos uma variedade de novos comportamentos celulares durante a fusão palatina secundária. A percepção de como os comportamentos celulares distintos são coordenados no espaço e no tempo contribui grandemente para a nossa compreensão desse processo dinamométrico dinâmico. Este protocolo pode ser aplicado a linhas de mouse mutantes, ou culturas tratadas com inibidores farmacológicos para avançar a compreensão de como a fusão palatina secundária é controlada.
Introdução
A fusão de tecido é um passo importante no desenvolvimento de múltiplos órgãos. Principais defeitos de nascença humana, como fissura labial e palatina, espinha bífida e malformações do coração podem resultar de defeitos na fusão tecidual 1 . A fusão do palato secundário do rato foi amplamente estudada para identificar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a fusão tecidual no desenvolvimento 2 , 3 , 4 . No mouse, o desenvolvimento do paladar secundário começa em torno de E11.5 com o crescimento de uma plataforma palatina secundária de cad....
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Protocolo
Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os protocolos da Universidade da Califórnia no Santian Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparação de mídia de imagem ao vivo
- Preparação de meios de cultura líquidos
- Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 meios de comunicação.
NOTA: A mídia de imagem ao vivo foi feita logo antes da imagem. Esta mídia contém fenol-vermelho, o que pode l....
- Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 meios de comunicação.
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Resultados
A imagem viva da cultura de explantes de palato revelou vários processos celulares que mediam a fusão palatina 6 . Os contatos iniciais entre duas células epiteliais são feitos por protrusões de membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando duas camadas epitélias se encontram, elas formam um MES em camadas de células múltiplas seguido de intercalação para fazer uma MES de camada celular única integrada através da convergência ep.......
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Discussão
A imagem ao vivo da morfogênese do tecido com cultura de explante de órgãos 3D pode fornecer informações detalhadas sobre processos celulares que não podem ser mostrados na análise de coloração convencional de seções fixas de tecidos. Usando a cultura de explante in vitro do paladar secundário embrionário de rato, observamos vários comportamentos celulares interessantes, levando-nos a propor um novo mecanismo de fusão palatina que envolve convergência epitelial e extrusão celular.
U.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a M. Douglas Benson por conversas iniciais sobre imagens de paladar secundário. Também reconhecemos David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) por sua ajuda para ajustar as condições de imagem em microscopia confocal. Agradecemos Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugestões úteis para análise quantitativa de imagens usando o software Imaris. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01 DE025887.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| < reagentes> fortes< / fortes > | |||
| DMEM / F12 | Tecnologia da vida | 11330-032 | |
| Soro bovino fetal | Tecnologia da vida | 16000-044 | |
| L-glutamina | Tecnologia da vida | 25030-081 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A4544-100G | |
| Penicilina / estreptomicina | Life technology | 15140-122 | |
| Agarose de baixo ponto de fusão | BioExpress | E-3111-125 | |
| Prato com fundo de vidro de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Vaselina (vaselina) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Alelo = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Alelo = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Alelo = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscópio | |||
| Luz Branca SP5 microscópio confocal | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer |
Referências
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
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Reimpressões e permissões
