Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.
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Artigo de método
Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fusão das prateleiras palatinas secundárias para formar o palato secundário intacto é um processo chave no desenvolvimento de mamíferos e a sua ruptura pode levar ao palato secundário fissurado, uma anomalia congênita comum em humanos. A fusão secundária do palato tem sido amplamente estudada, levando a vários mecanismos celulares propostos que podem mediar esse processo. No entanto, esses estudos foram realizados principalmente em tecidos embrionários fixos em pontos de tempo progressivos durante o desenvolvimento ou em culturas de explantes fixas analisadas em pontos de tempo estáticos. A análise estática é limitada para a análise de processos morfogenéticos dinâmicos, como a fusão palatina e quais tipos de comportamentos celulares dinâmicos medeiam a fusão palatina, é incompletamente entendido. Aqui descrevemos um protocolo para imagens vivas da fusão de palato secundário ex vivo em embriões de camundongo. Para examinar os comportamentos celulares da fusão palatina, a queratin14 -cre específica do epitélio foi utilizada para rotular as células epiteliais do palato em ROSA26-mTmG embriões repórter flox . Para visualizar a actina filamentosa, utilizaram-se ratos repórter Lifeact-mRFPruby . A imagem viva da fusão secundária do palato foi realizada por dissecção de prateleiras palatais secundárias recentemente aderidas de embriões de dia embrionário (E) 14,5 embriões e cultura em meio contendo agarose em um prato de fundo de vidro para permitir a imagem com um microscópio confocal invertido. Usando esse método, detectamos uma variedade de novos comportamentos celulares durante a fusão palatina secundária. A percepção de como os comportamentos celulares distintos são coordenados no espaço e no tempo contribui grandemente para a nossa compreensão desse processo dinamométrico dinâmico. Este protocolo pode ser aplicado a linhas de mouse mutantes, ou culturas tratadas com inibidores farmacológicos para avançar a compreensão de como a fusão palatina secundária é controlada.
Introdução
A fusão de tecido é um passo importante no desenvolvimento de múltiplos órgãos. Principais defeitos de nascença humana, como fissura labial e palatina, espinha bífida e malformações do coração podem resultar de defeitos na fusão tecidual 1 . A fusão do palato secundário do rato foi amplamente estudada para identificar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a fusão tecidual no desenvolvimento 2 , 3 , 4 . No mouse, o desenvolvimento do paladar secundário começa em torno de E11.5 com o crescimento de uma plataforma palatina secundária de cada um dos processos maxilares bilaterais. O crescimento inicial das prateleiras palatais ocorre verticalmente ao longo da língua, até aproximadamente E14.0, altura em que as prateleiras palatais se tornam elevadas horizontalmente acima da língua. O crescimento direcionado medialmente resulta em contato físico entre os epitélios que compõem as duas prateleiras palatinas, formando o epíteto da linha médiaAl seam (MES) em E14.5. O MES interveniente deve ser removido entre as prateleiras palatinas secundárias para permitir a confluência mesenquimatosa e o desenvolvimento de um palato secundário intacto e completamente fundido por E15.5 3 .
Como uma camada de célula MES epitelial compartilhada é formada entre duas prateleiras palatais separadas e, em seguida, removida para alcançar a confluência mesenquimal, tem sido uma questão central no desenvolvimento do paladar. Com base em estudos de microscopia histológica e eletrônica de mouse (EM), estudos de cultura de explantes e experiências funcionais de genética de mouse, vários comportamentos celulares fundamentais foram implicados nesse processo. As projeções semelhantes a Filopodia do epitélio da margem mediana MEE de cada prateleira palatina facilitam o contato inicial 5 , 6 , seguido da intercalação dessas células epiteliais a um MES 6 compartilhado , 7 . Remoção do MES compartilhado resultanteFoi proposto prosseguir por três mecanismos não exclusivos. Estudos iniciais que utilizaram observação histológica e rastreamento de linhagem ex vivo com corantes vitais indicaram que o MES poderia ser removido por transição epitelial para mesenquimatosa (EMT) das células MES 8 , 9 , embora mais recentemente, o rastreamento genético das células epiteliais gerasse incerteza quanto à A contribuição a longo prazo das células epiteliais para o mesênquima palatino 10 , 11 , 12 . Um número significativo de células apoptóticas e uma redução em seu número em alguns mutantes que não sofrem fusão palatina adequada levaram à idéia de que a apoptose pode ser um grande motor da dissolução MES 2 , 3 . Finalmente, com base inicialmente em estudos envolvendo rotulagem epitelial e observação estática em pontos de tempo progressivos, células MESForam propostos para migrar nas dimensões oronasal e anteroposterior 11 , 13 , mas esses comportamentos celulares dinâmicos foram inicialmente não confirmados devido à incapacidade de observá-los no tecido palatal vivo. Recentemente, conseguimos observar diretamente esses comportamentos através do desenvolvimento de uma nova metodologia de imagem ao vivo que combina métodos genéticos de rótulos fluorescentes com imagens confocais ao vivo de prateleiras palatinas explantadas.
Em primeiro lugar, para visualizar comportamentos dinâmicos celulares em células epiteliais de paladar durante a fusão paladar, geramos um rato repórter específica-epitelial por cruzamento de ratinhos ROSA26-mTmG flox com ratinhos Keratin14-cre 14, 15. Imagens vivas confocais da cultura explante de palato dos embriões resultantes confirmaram alguns comportamentos celulares previamente propostos e eventos de romance identificados no processo de fusão 6 . As protrusões da membrana celular epitelial precederam o contato inicial da célula-célula seguido de convergência epitelial por intercalação celular e deslocamento celular oronasal. Notavelmente, também descobrimos que a extrusão celular, um processo relatado para desempenhar papéis importantes na homeostase epitelial, foi um mecanismo importante que conduzia a fusão palatina secundária do mouse 6 , 16 . Este método de imagem pode ser usado com outras linhas repórter; Utilizamos ratos transgênicos Lifeact-mRFPruby 17 , 18 para examinar a dinâmica do citoesqueleto da actina durante o processo de fusão. Outros repórteres também podem ser empregados para observar outros aspectos específicos da fusão palatina e este método pode ser adaptado para microscopia confocal de microscopia confocal ou microscópio de disco giratório, dependendo das necessidades de imagem e da disponibilidade do microscópio. A imagem ao vivo está se tornando cada vez mais uma abordagem fundamental na biologia do desenvolvimento. PartiParticularmente, a morfogênese craniofacial é complexa e os defeitos congênitos humanos que afetam o rosto são comuns. Este método de imagem ao vivo confocal ajudará a melhorar a compreensão dos mecanismos básicos de desenvolvimento subjacentes, bem como a origem de anormalidades craniofaciais humanas.
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Protocolo
Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os protocolos da Universidade da Califórnia no Santian Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparação de mídia de imagem ao vivo
- Preparação de meios de cultura líquidos
- Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 meios de comunicação.
NOTA: A mídia de imagem ao vivo foi feita logo antes da imagem. Esta mídia contém fenol-vermelho, o que pode levar à fototoxicidade em cursos longos de imagens ao vivo. Substituir por meios sem fenol-vermelho pode melhorar a imagem a longo prazo.
- Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 meios de comunicação.
- Preparação de solução de agarose de baixo ponto de fusão
- Dissolver 350 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 mL de água destilada autoclavada para fazer uma solução de reserva de 3,5%.
- Misturar bem a solução de agarose e incubar a 70 ° C num banho de água para dissolver completamente a agarose.
- Arrefecer a solução de agarose em um banho-maria a 37 ° C antes de adicioná-lo ao meio de imagem ao vivo.
- Adicione 1 mL da solução de reserva de agarose a 5 mL dos meios de imagem vivos líquidos para formar uma concentração final (0,6%).
- Mantenha a mídia com agarose em um banho de água a 37 ° C para evitar a solidificação prematura.
2. Preparação do paladar Cultura explícita para imagens ao vivo
- Dissecção de prateleiras palatinas secundárias E14.5 recentemente aderidas
NOTA: Em nossa experiência, a fusão de imagem requer começar com um par de prateleiras palatentas ligeiramente aderidas; Esta aderência evita movimentos de explantes que impedem que a fusão ocorra durante a imagem.- Dissecre embriões em estágio E14.5 em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e escolha a proteína fluorescente verde (GFP) - expressando (a partir deK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) ou (Red fluorescente de proteína) RFP-expressando (a partir de Lifeact-mRFPruby ) embriões positivos usando um microscópio de dissecação equipado com lâmpadas fluorescentes. Transferir tecido para meios de cultura pré-aquecidos de imagem ao vivo sem agarose.
- Corte a cabeça do embrião e remova a área superior do cérebro usando duas pinças finas No. 5 ( Figura 1 A-C ). Use uma pinça No. 5 para segurar o embrião enquanto as outras pinças No. 5 para cortar o tecido extra fora das prateleiras palatinas.
NOTA: Tijolos finos podem ser usados para cortar a cabeça do embrião (o primeiro passo) em vez de uma pinça No. 5. No entanto, duas pinças finas No. 5 darão um melhor controle para fazer cortes precisos. - Remova a mandíbula com cuidado sem danificar as prateleiras palatais, como mostrado na Figura 1 D e 1E . Para reduzir a chance de paladar prejudicial, mantenha a língua através da dissecção da mandíbula, fOllowed pela remoção cuidadosa da língua.
- Depois de remover a mandíbula e a língua, examine o lado oral do paladar secundário com um estereomicroscópio com fluorescência para confirmar o forte sinal do repórter no MES ( Figura 1 M ).
- Dissie as partes posteriores, incluindo o colo e o tronco cerebral após a remoção da mandíbula e da língua ( Figura 1 F ).
- Remova ambas maxilas com prateleiras palatinas aderentes ( Figura 1 G ).
- Corte o tecido do maxilar superior anterior, mantendo intactos o palato primário e secundário ( Figura 1 H e I ).
- Remova o septo nasal no lado nasal do explante expondo o MES.
NOTA: Estas etapas posteriores de dissecações precisam de atenção para não interromper os contatos entre duas prateleiras palatinas secundárias. A remoção do septo nasal ajuda aReduzir o sinal de fundo de outras áreas e também reduzir o movimento vertical do tecido, permitindo imagem estável ( Figura 1 J-L ). - Depois de dissecar as prateleiras palatais, examine novamente o sinal repórter da linha média para garantir que não haja danos na camada epitelial entre os tecidos.
- Configurando explantes de paladar em prato de cultura com mídia de imagem ao vivo
- Coloque mídia de imagem ao vivo em um prato de fundo de vidro de 35 mm.
- Coloque as prateleiras palatinas dissecadas lado oral voltado para baixo o mais próximo possível do fundo de vidro para imagem com um microscópio confocal invertido ( Figura 1 N ).
- Coloque pastilhas de gelo seco em uma superfície condutora próxima ao prato de cultura para acelerar a solidificação de agarose, diminuindo a temperatura rapidamente ou coloque o prato de cultura a 4 ° C. Uma placa fria, como uma usada para incorporação de parafina também poderia ser usada nessa sTage.
NOTA: Quando o gelo seco é usado, a mudança de mídia de agarose precisa ser monitorada cuidadosamente para evitar a congelação de mídia.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant
- Imagem e aquisição de dados
- Depois que a agarose foi semi-solidificada, monte o prato de cultura em um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara de incubação de 37 ° C. Use um microscópio confocal de microscópio confocal de luz branca e um microscópio confocal de disco giratório de observação celular.
NOTA: Utilizamos uma mídia modificada contendo HEPES 15 mM sem gás CO 2 . - Coloque vaselina entre o prato de cultura e cubra usando uma seringa para evitar a evaporação da mídia ( Figura 1 N ).
NOTA: Alguma condensação em cima da cobertura do prato de cultura após a cultura durante a noite (O / N) ocorre, mas o volume de mídia não muda, sugerindo que a vaselina evita a evaporação da mídia. - Localize a região de interesse com objetivos de baixa ampliação (10x) e use objetivos de ampliação maiores (objetivo 20x com zoom digital 3x ou um objetivo 40x com Immersol W) para imagens ao vivo em tempo de lapso.
NOTA: As prateleiras palatinas secundárias dissecadas não são planas. O paladar secundário é uma estrutura curvada e isso dificulta a imagem do MES inteiro no mesmo plano. A imagem de baixa ampliação (10x) pode permitir a imagem em palco inteiro, mas os objetivos de 40x proporcionam uma melhor resolução de imagem para examinar movimentos celulares detalhados em posições Z mais profundas. A curvatura é alta na região do palato médio. O paladar anterior e posterior são relativamente planos em comparação com o palato médio. Muitas vezes, imagem em direção a mid-anterior do paladar secundário para evitar regiões de maior curvatura. - Digitalize várias pilhas Z com 5 μm cada passo para 16-24 h usando excitação laser apropriada (488 nm para GFP e 532/561 nm para RFP) ( Figura 2 ).
NOTA: Para reduzir a potencial fototoxicidade, use a potência mínima do laser e o tempo de exposição. Isto é importante especialmente no caso de imagens multicoloridas. Use 22% de potência laser de 552 nm para membranaTomato (mT), 30% de potência laser 495 nm para membranaGFP (mG) e 25% de potência laser de 561 nm para membrana RFP. O tempo médio de exposição foi de 550 ms. - Use o software de análise de imagem para realizar rastreamento celular e análise quantitativa.
- Depois que a agarose foi semi-solidificada, monte o prato de cultura em um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara de incubação de 37 ° C. Use um microscópio confocal de microscópio confocal de luz branca e um microscópio confocal de disco giratório de observação celular.
4. Análise da Imagem de Dados
NOTA: Aqui, Imaris foi usado. Análises de dados semelhantes também podem ser realizadas com os pacotes de software ImageJ ou Volocity.
- Renderização de superfícies tridimensionais (3D) a partir de seqüências de imagens.
NOTA: Esta seção permite a geração de uma superfície de um filme gerado com um sinal de membrana GFP.- Clique em Editar | Mostre o ajuste da tela e use o controle deslizante de histograma para ajustar a intensidade do sinal de modo que o sinal da membrana seja transparenteO comprimento do filme ( Figura 3 A ).
- Corrige o sinal branqueado usando Image Processamento | Correção de atenuação . Ajuste os valores Intensity Front e Intensity Back para que o sinal da membrana seja claro ao longo do tempo do filme. Alguns testes e erros podem ser necessários na configuração desses valores.
NOTA: O valor Intensity Back (posição Z mais profunda) será menor do que o valor Intensity Front (Surface Z position) devido à penetração limitada do laser. Esses valores também podem ser alterados para normalizar a intensidade do sinal na série Z. Ambos os valores podem ser ajustados para obter correção de branqueamento. A correcção de atenuação também é chamada de correção de atenuação de emissão 19 . - Para gerar uma superfície a partir do sinal da membrana, selecione Surpass | Superfícies , escolha um canal de origem e um tipo de limite (Absolute Intensity) e sob Configurações de Algoritmo seLect Segmente apenas uma Região de Interesse E Processo de imagem inteira , finalmente , clicando na seta para a frente; Continue empurrando a seta para a frente (use as configurações padrão ou especifique os níveis de detalhe da área de superfície e o método de Threshold por teste e erro), verificando se a superfície gerada reflete o sinal de fluorescência. Para especificar uma Região de Interesse, selecione a região e o (s) tempo (s) a serem renderizados cortando as posições X, Y, Z.
NOTA: selecione Processo de imagem inteira finalmente para que ajustes e limiares sejam aplicados em todo o filme. - Gere uma superfície clicando no botão de seta para a frente novamente. Em seguida, ajuste o limiar alterando o histograma em Filtros para corresponder ao sinal da membrana.
- Após a geração da superfície, escolha a superfície em Superfícies / Configurações para visualizar o sinal de superfície e finalize o processo de geração de superfície, pressionando o forw duploArd botão de seta ( Figura 3 B ).
- Vá para a superfície | Edite e clique em Mascarar tudo nas Propriedades de máscara para gerar uma imagem de canal em máscaras.
- Depois de clicar em OK, a janela do canal de máscaras será aberta automaticamente; Selecione o canal GFP, defina voxels fora da superfície até o valor máximo da intensidade do sinal (encontrado no ajuste Editar | Exibição ) e voxels dentro da superfície para o valor mínimo de intensidade GFP (também encontrado em Editar | Ajuste da tela ), em configurações de máscara para gerar uma máscara do sinal da membrana.
- À medida que a máscara do sinal de membrana será exibida na exibição de Volume , gere imagens invertidas usando o processamento de imagem | Mudança de contraste | Inverter ( Figura 3 C ).
- Detecção de pontos de imagens de superfície invertida.
NOTA: Esta seção permite que o centro de cada célula sejaMarcado com um local único e rastreado em espaço e tempo.- Selecione a cena de superação | Manchas | Criar ; Em Configurações de Algoritmo, selecione Segmento apenas uma Região de Interesse , Processo de imagem inteira finalmente e Pontos de Faixa (ao longo do tempo) .
- Clique na seta para a frente e especifique uma Região de Interesse; Selecione a região e a (s) hora (s) para rastrear pontos; Continue empurrando a seta para a frente, escolha o canal mascarado como um canal fonte e determine o diâmetro XY estimado dos pontos.
- Como clicar no botão de seta para a frente, irá abrir automaticamente uma janela de filtro; Ajuste o limite de detecção de pontos alterando valores no histograma para gerar pontos únicos no centro de cada célula ( Figura 3 D ).
- Ao clicar no botão de seta para a frente novamente, abrirá a janela Algoritmo . Escolha o modelo de rastreamento de movimento autoregressivo 20 e especifique o máximo de rastreamento diPosição e tamanho máximo de espaço para conectar faixas que se tornam descontínuas por um curto período de tempo.
- Ao clicar no botão de seta para a frente novamente, abrirá a janela Filtros, definirá o limite de duração da faixa, ajustando o histograma para que cada célula seja rastreada. Ao clicar no botão de seta para frente duplo finalizará a detecção de pontos.
- Para corrigir a deriva do tecido, clique em Manchas | Track Editor e selecione Correct Drift . Uma janela Algoritmo será aberta automaticamente; Selecione a derivação translacional selecionada , inclua o resultado inteiro e corrija as posições dos objetos .
- Gerando gráficos vantajosos para análise quantitativa.
NOTA: O Scatterplot do programa é uma ferramenta para gerar gráficos multidimensionais (X, Y, Z, Cor e Escala) com vários objetos. Essas parcelas são úteis para visualizar tendências de muitos movimentos celulares ao longo do tempo.- Faça parcelas 2D ou 3D de dados de rastreamento celular usando oVantage-Add New Vantage plot menu ( Figura 3 E e 3F ).
- Selecione Volume ou Pontos e Escolha Criar / Categoria e Tipo de Lote
- Ajuste os valores do gráfico para gerar diferentes gráficos do Vantage.
- Exporte gráficos usando a função Snapshot .
NOTA: Os dados estatísticos também podem ser exportados como uma planilha para uma análise quantitativa adicional, clicando em Área de números de traçados | Salvar .
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Resultados
A imagem viva da cultura de explantes de palato revelou vários processos celulares que mediam a fusão palatina 6 . Os contatos iniciais entre duas células epiteliais são feitos por protrusões de membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando duas camadas epitélias se encontram, elas formam um MES em camadas de células múltiplas seguido de intercalação para fazer uma MES de camada celular única integrada através da convergência ep...
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Discussão
A imagem ao vivo da morfogênese do tecido com cultura de explante de órgãos 3D pode fornecer informações detalhadas sobre processos celulares que não podem ser mostrados na análise de coloração convencional de seções fixas de tecidos. Usando a cultura de explante in vitro do paladar secundário embrionário de rato, observamos vários comportamentos celulares interessantes, levando-nos a propor um novo mecanismo de fusão palatina que envolve convergência epitelial e extrusão celular.
U...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a M. Douglas Benson por conversas iniciais sobre imagens de paladar secundário. Também reconhecemos David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) por sua ajuda para ajustar as condições de imagem em microscopia confocal. Agradecemos Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugestões úteis para análise quantitativa de imagens usando o software Imaris. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01 DE025887.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| < reagentes> fortes< / fortes > | |||
| DMEM / F12 | Tecnologia da vida | 11330-032 | |
| Soro bovino fetal | Tecnologia da vida | 16000-044 | |
| L-glutamina | Tecnologia da vida | 25030-081 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A4544-100G | |
| Penicilina / estreptomicina | Life technology | 15140-122 | |
| Agarose de baixo ponto de fusão | BioExpress | E-3111-125 | |
| Prato com fundo de vidro de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Vaselina (vaselina) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Alelo = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Alelo = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Alelo = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscópio | |||
| Luz Branca SP5 microscópio confocal | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer |
Referências
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Reimpressões e permissões
