Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa para estudar comportamentos celulares em tempo real. Aqui, descrevemos um protocolo para Time-Lapse vídeo-microscopia das células do córtex cerebral primário que permite uma análise detalhada das fases promulgada durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais primárias diferenciada de neurônios e glia.
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Artigo de método
Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, as células progenitoras são submetidos a várias rodadas de simétricas e assimétricas de divisões celulares para gerar novos progenitores ou neurônios postmitotic. Mais tarde, alguns progenitores alternar para um destino gliogenic, adicionando às populações astrocyte e oligodendrocyte. Usando o Time-Lapse vídeo-microscopia de culturas de células do córtex cerebral primário, é possível estudar os mecanismos celulares e moleculares, controlando o modo de divisão celular e parâmetros do ciclo celular de células progenitoras. Da mesma forma, o destino das células postmitotic pode ser examinado usando proteínas fluorescentes repórter célula específica ou pós-imagem imunocitoquímica. Mais importante ainda, todas estas características podem ser analisadas a nível de célula única, permitindo a identificação dos progenitores comprometidos com a geração de tipos de células específicas. Manipulação da expressão genética também pode ser executada usando a transfeccao mediada por viral, permitindo o estudo dos fenômenos não-celular-autónomos e célula autónomos. Finalmente, o uso de proteínas fluorescentes fusão permite o estudo da distribuição simétrica e assimétrica de proteínas selecionadas durante a divisão e a correlação com o destino de células-filhas. Aqui, descrevemos o método vídeo-microscopia de lapso de tempo para células murino córtex cerebral primário por até vários dias de imagem e analisar o modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular e destino das células recém-gerado. Também descrevemos um método simples para transfect células progenitoras, que podem ser aplicadas a manipular os genes de interesse ou simplesmente rotular células com proteínas de repórter.
Introdução
Células-tronco neurais (NSC) gerar neurônios e células de macroglial durante o desenvolvimento do córtex cerebral. No início-corticogenesis, NSCs passam por várias rodadas simétrica da divisão de pilha e expandir o pool de progenitor. Em seguida, NSCs dividir assimetricamente para gerar neurônios diretamente ou indiretamente através de de intermediários1. Somente no mid - ao tarde-corticogenesis, progenitores alternar para gerar astrócitos e oligodendrócitos2,3,4. No entanto, os completos mecanismos que controlam a proliferação celular e diferenciação,....
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo animais vivos descritos neste protocolo são conduzidos de acordo com as leis nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade local (CEUA/UFRN), sob a licença 009/2014. O protocolo a seguir é realizado em um ambiente estéril. Espera-se familiaridade com a cultura de células básica.
1. Microdissecção do telencéfalo dorsolateral
- Prepare o meio de dissecção (100 mL): 98,5 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL).
- Filtre e esterilize o mei....
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Resultados
Culturas primárias de células do córtex cerebral isoladas de embriões E14 contêm tanto células progenitoras quanto neuronais. Durante o período de aquisição de imagens, os progenitores realizam várias rodadas de divisão celular, aumentando o número de células (Figura 5 e Vídeo Figura 1).
A transfeção mediada por retrovírus de algumas poucas células progenitoras facilita a identifica.......
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Discussão
Observação em tempo real das células do córtex cerebral primário permite a análise da proliferação celular, modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular, diferenciação celular e célula de sobrevivência3,14,15,37. Mais importante, permite o estudo das linhagens de célula única, para a identificação das fases intermédias promulgada durante a progressão de NSCs para neurônios
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina balanceada de Hank (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
| Glicose | Gibco | A2494001 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| tripsina-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300054 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 16005 | |
| Soro de cabra | Sigma-Aldrich | 69023 | |
| Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
| Isoflurano | Sigma | 792632 | |
| anti-MAP2, camundongo | Sigma | M4403 | |
| frango anti-GFP | Aves | 0511FP12 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Cabra anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Cabra anti-frango alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
| ImageJ | NIH | ||
| tTt | ETH Zurich | ||
| Microscópio observador de células | Zeiss | ||
| Pasteur pipeta | |||
| PBS | |||
| O software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | link para download |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 3....
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Reimpressões e permissões
