Artigo de método

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

DOI:

10.3791/56063

⸱

9 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

Neste artigo

Resumo

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Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa para estudar comportamentos celulares em tempo real. Aqui, descrevemos um protocolo para Time-Lapse vídeo-microscopia das células do córtex cerebral primário que permite uma análise detalhada das fases promulgada durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais primárias diferenciada de neurônios e glia.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, as células progenitoras são submetidos a várias rodadas de simétricas e assimétricas de divisões celulares para gerar novos progenitores ou neurônios postmitotic. Mais tarde, alguns progenitores alternar para um destino gliogenic, adicionando às populações astrocyte e oligodendrocyte. Usando o Time-Lapse vídeo-microscopia de culturas de células do córtex cerebral primário, é possível estudar os mecanismos celulares e moleculares, controlando o modo de divisão celular e parâmetros do ciclo celular de células progenitoras. Da mesma forma, o destino das células postmitotic pode ser examinado usando proteínas fluorescentes repórter célula específica ou pós-imagem imunocitoquímica. Mais importante ainda, todas estas características podem ser analisadas a nível de célula única, permitindo a identificação dos progenitores comprometidos com a geração de tipos de células específicas. Manipulação da expressão genética também pode ser executada usando a transfeccao mediada por viral, permitindo o estudo dos fenômenos não-celular-autónomos e célula autónomos. Finalmente, o uso de proteínas fluorescentes fusão permite o estudo da distribuição simétrica e assimétrica de proteínas selecionadas durante a divisão e a correlação com o destino de células-filhas. Aqui, descrevemos o método vídeo-microscopia de lapso de tempo para células murino córtex cerebral primário por até vários dias de imagem e analisar o modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular e destino das células recém-gerado. Também descrevemos um método simples para transfect células progenitoras, que podem ser aplicadas a manipular os genes de interesse ou simplesmente rotular células com proteínas de repórter.

Introdução

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Células-tronco neurais (NSC) gerar neurônios e células de macroglial durante o desenvolvimento do córtex cerebral. No início-corticogenesis, NSCs passam por várias rodadas simétrica da divisão de pilha e expandir o pool de progenitor. Em seguida, NSCs dividir assimetricamente para gerar neurônios diretamente ou indiretamente através de de intermediários1. Somente no mid - ao tarde-corticogenesis, progenitores alternar para gerar astrócitos e oligodendrócitos2,3,4. No entanto, os completos mecanismos que controlam a proliferação celular e diferenciação, bem como a contribuição dos progenitores destino restrito à geração de tipos exclusivos de neurônios ou células de macroglial permanecem uma questão de debate intenso4,5,6. O potencial de NSCs corticais individuais para gerar neurônios, astrócitos e oligodendrócitos tem sido extensivamente estudados em vitro e em vivo usando uma miríade de técnicas tais como: viver de imagem em culturas de célula única7,8,9,10,11,12,13; ao vivo de imagens em alta densidade culturas culturas3,14,15; viver de imagem em fatia culturas16,17,18; clonal análise usando viral mediada por vector genético rotulagem em culturas de alta densidade14,15,19,20,21; análise clonal em vivo usando retrovírus22,23,24,25,26,,27,28,29,30,31,32,33; e análise clonal em vivo usando animais transgénicos34.

Cada uma dessas técnicas apresenta prós e contras. Por exemplo, na vivo rastreamento de linhagem é suscetível a divisão e amontoando erros3, levando a conclusões contraditórias sobre o potencial dos progenitores corticais individuais. Além disso, tanto estudos in vitro e em vivo baseiam sobre a rotulagem de células progenitoras nos pontos de tempo iniciais e posterior análise das linhagens de células pode ser influenciada pela ocorrência de morte celular durante a progressão de linhagem35sem ser detectado. Portanto, um sistema adequado para analisar o potencial de NSCs único deve permitir a identificação de todas as células geradas, bem como a caracterização adequada dos destinos de célula dentro da linhagem. Combinação de cultura de células primárias e de imagem ao vivo fornece essa configuração. Usando cultura de célula única e Time-Lapse vídeo microscopia, templo et al . demonstraram o interruptor na linhagem de progenitores individuais córtex cerebral da neurogênese gliogenesis11. Mais tarde, eles usaram o mesmo sistema para mostrar que diferentes tipos de neurônios são gerados a partir de um único progenitor cortical12. No entanto, este sistema apresenta uma ressalva importante: apenas 1% dos progenitores corticais isoladas no início corticogenesis gerar clones de 4 ou mais descendência9. Após a adição de FGF2, a frequência das células gerando 4 ou mais células aumenta para 8-10%9. No entanto, esse número é muito pequeno, Considerando que praticamente todos os progenitores corticais são proliferativas nesta fase. Além disso, os efeitos potenciais de FGF2 na especificação de destino não podem ser descartados36. Para contornar essas limitações, nós usamos a culturas de células de alta densidade que suportam a proliferação de ambos ventricular (Pax6-expressando) e progenitores cortical subventricular (Tbr2-expressando)15. Além disso, a observação em tempo real destas culturas demonstrou que várias características de progressão de linhagem NSC são reproduzidas sob estas condições, tais como modo de divisão celular, alongamento do ciclo celular, potencial de células únicas para gerar neurônios e glia, entre outros,3,15. Mais recentemente, também usamos este sistema para mostrar que a sinalização de CREB afeta a sobrevivência da pilha de neurônios imaturos córtex cerebral em ratos37. Assim, acreditamos que esse lapso de tempo vídeo-microscopia de córtex cerebral murino primário cultivados em alta densidade é uma ferramenta poderosa e acessível para estudar os mecanismos celulares e moleculares da progressão do ciclo celular, o modo de divisão celular, a sobrevivência da célula e a célula destino especificação. Este último pode ser realizado usando animais transgénicos, permitindo a identificação de destinos de célula específica em tempo real38,39,40 ou o uso de pós de imagem imunocitoquímica3,38,41,,42.

Aqui, nós fornecemos um protocolo passo a passo para preparar a cultura de células do córtex cerebral primário apoiando a proliferação de NSCs e a geração subsequente de neurônios e células macroglial. Também discutimos o uso do transfection retroviral mediada para manipular a expressão gênica de células individuais, que podem ser identificadas e controladas a nível de célula única usando microscopia vídeo lapso de tempo. Este protocolo pode ser usado para estudar as células do córtex cerebral primário isoladas desde o início até o fim do corticogenesis em roedores, mas alguns ajustes podem ser necessários de acordo com a etapa14. NSCs isoladas de outras fontes também podem ser estudadas usando microscopia de vídeo Time-Lapse de culturas 2D, mas o sistema de cultivo adequado deve ser determinado comparando célula comportamentos in vitro e in vivo38,43.

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Protocolo

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Todos os experimentos envolvendo animais vivos descritos neste protocolo são conduzidos de acordo com as leis nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade local (CEUA/UFRN), sob a licença 009/2014. O protocolo a seguir é realizado em um ambiente estéril. Espera-se familiaridade com a cultura de células básica.

1. Microdissecção do telencéfalo dorsolateral

  1. Prepare o meio de dissecção (100 mL): 98,5 mL de solução salina balanceada de Hank (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL).
  2. Filtre e esterilize o meio de dissecação.
  3. Remover embriões embrionários do dia 14 (E14) de um camundongo C57/Bl6 (Mus musculus) prenhe sob anestesia com isoflurano.
    NOTA: Considere E0 como o dia da detecção do plugue vaginal. A dissecção deve ser concluída o mais tardar 1 h após a remoção do camundongo prenhe. Este protocolo também se aplica aos embriões E11-E17.
  4. Remova os embriões por histerectomia em condições estéreis.
  5. Transferir os embriões para uma placa de Petri com meio de dissecção a frio (4 °C).
  6. Remova os cérebros do crânio cortando ao longo da fissura longitudinal. O número de embriões geralmente varia de cinco a dez. Cada cérebro E14 produz aproximadamente 2 x 106 células, incluindo progenitores e neurônios pós-mitóticos (proporção de 1:1)
    NOTA: Use o estereomicroscópio para as etapas a seguir.
  7. Remova as meninges usando uma pinça de dissecção. Divida o telencéfalo ao meio para separar os hemisférios. Para isolar o telencéfalo dorsolateral, corte ao longo da curva dorsomedial e do limite palial-subpalial usando uma pinça de dissecção. Transfira o telencéfalo dorsolateral para um tubo de 2 mL com meio de dissecção a frio (4 °C) até que todos os cérebros estejam dissecados.

2. Dissociação e Plaqueamento Celular

  1. Prepare o meio de proliferação (50 mL de DMEM + 10% FCS): 44 mL de meio de Eagle modificado com Dulbecco (DMEM), 5 mL de soro fetal de bezerro (FCS), 0,5 mL de glicose a 40%, 0,5 mL de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL e 10.000 μg/mL). Filtre-esterilize o meio de proliferação.
  2. Prepare o meio de diferenciação (50 mL de DMEM + 2% B27): 48 mL de DMEM, 1 mL de B27, 0,5 mL de glicose a 40%, 0,5 mL de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades / mL e 10.000 μg / mL). Filtre-esterilize o meio de diferenciação.
  3. Após a microdissecção do telencéfalo dorsolateral de camundongos E14, centrifugue o tubo com o tecido coletado e o meio de dissecção a frio (por 5 min a 4 ° C, 340 x g) para precipitar o tecido.
  4. Remova o sobrenadante com uma pipeta e adicione 1 mL de tripsina-EDTA pré-aquecido (37 ° C) (0,05%) para digestão química. Incubar durante 15 min a 37 °C. Adicionar 2 ml de meio de proliferação para parar a atividade da tripsina.
  5. Polir a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro sobre um queimador de gás ou bico de Bunsen por alguns segundos para diminuir ligeiramente a abertura. Lave a pipeta aspirando FCS para revestir a ponta. Evitando bolhas, dissocie mecanicamente as células com uma pipeta Pasteur polida a fogo e revestida com FCS.
  6. Centrifugue as células (durante 5 min a 4 °C, 340 x g). Remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicione 1 mL de meio de proliferação e ressuspenda as células usando uma pipeta. Repita esta etapa uma vez.
  7. Prepare uma diluição de 1:1 da suspensão celular usando uma solução de azul de tripano a 0,4%. As células não viáveis serão azuis. Conte o número de células viáveis (não coradas) usando uma câmara de Neubauer.
  8. Dilua as células em meio de proliferação para obter 106 células / mL. Adicionar 500 μL da suspensão celular a cada alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (aproximadamente 2,5 × 105 células/cm2). Incubar células a 37 °C e 5% de CO2,
    NOTA: Não use lamínulas de vidro, pois elas podem se mover durante o experimento e alterar o campo de observação. Como alternativa, use placas de cultura de tecidos com fundo de vidro.
    NOTA: Se você não estiver usando multidished tratado com cultura de células, é importante pré-tratar suas placas com Poli-D-lisina (50 μg/ml) 2 h a 37 °C. As placas tratadas com PDL podem ser armazenadas a 4 °C após lavagem com água destilada.

3. Transfecção mediada por retrovírus

NOTA: Este é um método simples para transfectar apenas células progenitoras. No entanto, outros vetores virais ou transfecção química/elétrica podem ser usados para inserir genes de interesse em células cultivadas.

  1. Para manipular a expressão gênica e rotular células com proteínas repórter fluorescentes, adicione retrovírus carregando plasmídeos com genes de interesse 2 h após o plaqueamento celular.
    NOTA: Os vetores retrovirais só se integram ao genoma das células em divisão. Portanto, é importante infectar as células quando a proliferação é alta.
    NOTA: Usamos um plasmídeo contendo a sequência de fusão Beta-actina/CMV (CAG) e um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) seguido pela sequência codificante para a proteína fluorescente verde (GFP), designada pCAG-IRES-GFP44. Genes de interesse podem ser clonados entre o promotor CAG e a sequência IRES37.
  2. Diluir o retrovírus em meio de diferenciação para obter o número desejado de partículas por ml. Adicione 500 μL de meio de diferenciação com retrovírus a cada poço.
    NOTA: A quantidade de retrovírus utilizados depende do seu título e deve ser calculada para obter 50 a 100 células infectadas por poço. Este título permite a identificação de clones isolados que expressam GFP, cuja relação pode ser confirmada pelo rastreamento de imagens de contraste de fase (ver seção 6). A titulação do retrovírus deve ser realizada usando a mesma população de células45.

4. Videomicroscopia com lapso de tempo

NOTA: Esta etapa requer um microscópio de fluorescência invertida com câmara de incubação (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Após a infecção por retrovírus, coloque a placa de cultura de tecidos em uma incubadora conectada aos controladores de temperatura e CO2.
    NOTA: Pré-aquecer a câmara por 3 h antes de iniciar a imagem pode ajudar a minimizar o desvio e o desfoque durante a aquisição.
    NOTA: A câmara deve manter as células em condições constantes de 37 °C e 5% de CO2.
  2. Selecione uma posição no eixo XY para servir como ponto zero (XY = 0). Isso permitirá uma referência para encontrar as posições novamente no futuro, por exemplo, após imunocitoquímica pós-imagem (ver seção 5).
    NOTA: É aconselhável desenhar um sinal na placa que possa ser usado como referência para determinar o ponto zero.
  3. Selecione as posições a serem fotografadas com ampliação de 10X.
    NOTA: Selecione 10-15 posições por poço para aumentar a probabilidade de observar células transfectadas retroviralmente.
    NOTA: Objetivas de alta ampliação de longa distância (20X ou 40X) podem ser usadas para obter imagens de resolução mais alta. Dependendo da distância de trabalho das objetivas, podem ser necessárias placas com fundo de vidro.
  4. Adquira imagens de contraste de fase a cada 5 min e imagens de fluorescência a cada 3 h para diminuir a fototoxicidade. Verifique e ajuste o foco nas primeiras 3 h do experimento, pois ele pode mudar enquanto a temperatura se equilibra. Verifique e ajuste o foco diariamente.
    NOTA: Observamos que o foco se torna estável após as primeiras 24 h. No entanto, é aconselhável monitorar o foco. Como alternativa, use um sistema de foco automático baseado em software.
  5. Após 7 dias, interrompa a aquisição e prossiga para a imunocitoquímica pós-imagem (ver secção 5).
  6. Após a imunocitoquímica, recoloque a placa na incubadora do microscópio, encontre o ponto zero, reinicie XYZ = 0 e recarregue o experimento com as posições salvas. Adquira as imagens de fluorescência de cada posição usando filtros de fluorescência apropriados.

5. Imunocitoquímica pós-imagem

  1. Após 7 dias em cultura, fixar a cultura celular com fixador de Paraformaldeído (PFA) a 4% por 15 min em temperatura ambiente.
    CUIDADO: O PFA é tóxico e deve ser manuseado em uma capela de exaustão química.
  2. Enxágue com 0,5 mL de PBS 0,1 M por 5 min. Repita 3 vezes.
  3. Incubar em anticorpos primários durante a noite a 4 °C em 0,5% de triton e 10% de soro de cabra normal em PBS 0,1 M.
    NOTA: Use o anticorpo anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) para confirmar o fenótipo neuronal (IgG1 de camundongo, 1:1.000) e anti-GFP para marcar as células transduzidas (anticorpo de galinha, 1:500). Outros anticorpos podem ser usados para detectar células progenitoras ou gliais.
  4. Enxágue com 0,5 mL de PBS 0,1 M por 5 min. Repita 3 vezes.
  5. Diluir anticorpos secundários em 0,5% de tritão e 10% de soro de cabra normal em PBS 0,1 M e incubar por 2 h em temperatura ambiente. Diluição recomendada: 1:1.000.
  6. Enxágue com 0,5 mL de PBS 0,1 M por 5 min. Repita 3 vezes.
  7. Para coloração de núcleos, incube as células por 5 min com 0,1 μg / mL 4′6′-diamino-2-fenilindona (DAPI) em PBS 0,1 M.
  8. Enxágue com 0,5 mL de PBS 0,1 M por 5 min. Repita 3 vezes.
  9. Mantenha as células em PBS 0.1 M e proteja da luz (por exemplo, embrulhe a placa com papel alumínio).

6. Rastreamento de células

NOTA: Aqui, descrevemos brevemente as principais etapas para analisar os dados de videomicroscopia com lapso de tempo usando o software The Tracking Tool (tTt), que está disponível no link fornecido na Tabela de Materiais.

NOTA: Se a aquisição da imagem for realizada com outro software, importe os dados da imagem com o tTt Converter disponível no instalador tTt (link fornecido na Tabela de Materiais). Apenas os formatos de imagem png, tif ou jpg são aceitos. Siga as etapas mostradas em Figura 1 A - B após iniciar o conversor tTt.

  1. Inicie o software tTt e escolha um nome de usuário. Clique no botão "adicionar usuário" e "continuar" (Figura 2A). Navegue e selecione o "TTTWorkFolder" (Figura 2B). Linhagens árvores, estatísticas e imagens exportadas serão salvas nesta pasta. Em seguida, selecione o experimento a ser analisado e carregue-o (Figura 2B).
  2. Se as imagens foram convertidas anteriormente pelo tTt Converter, clique em "LogFileConverter" (Figura 3A) e especifique o número de segundos entre dois pontos de tempo consecutivos na janela do LogFileConverter. Clique em "Converter arquivos de log para todo o experimento" (Figura 1C).
  3. Em uma lista de imagens, que aparecem na janela tTt, selecione as imagens desejadas que carregam manualmente ou usando a opção exibida no programa. Carregue as imagens (Figura 3).
  4. Selecione Arquivo > Abrir > Nova colônia. Clique em "Rastreamento", seguido de "Iniciar rastreamento" para iniciar o rastreamento na posição escolhida.
  5. Uma janela de filme aparecerá (Figura 4). Selecione a célula usando o círculo de rastreamento e pressione a tecla 0. O software irá para o próximo quadro. Continue posicionando o círculo de rastreamento ao redor da célula rastreada usando o mouse e clique em 0 em cada quadro para adicionar uma marca de rastreamento na célula.
  6. Use as teclas 1 e 3 para mover para o quadro anterior ou seguinte, respectivamente. Para excluir uma marca de trilha, basta clicar na posição correta para marcar e pressionar 0.
  7. Se a célula estiver dividida, selecione o botão "divisão" (retângulo vermelho em Figura 4). Continue rastreando uma célula-filha pressionando Shift+D. Para rastrear a segunda célula filha, selecione-a no editor de células e pressione F2.
  8. Se a célula morreu durante a microscopia de vídeo, selecione "apoptose" (retângulo azul em Figura 4).
    NOTA: Embora o software rotule o evento como "apoptose", outros mecanismos podem ser responsáveis pela morte celular.
  9. Se a célula sair do campo de observação ou se misturar com células vizinhas, impedindo o rastreamento, selecione "perdido" (retângulo verde em Figura 4).
  10. Para interromper o rastreamento e continuar mais tarde, clique em "interromper" (retângulo roxo em Figura 4).
    NOTA: Na janela do editor de células, uma árvore será gerada durante o rastreamento. Para salvar a árvore de linhagem, selecione Arquivo > Salvar > árvore atual (na janela Editor de células).
  11. Para começar a rastrear uma célula diferente, clique na célula usando o botão direito do mouse ou selecione a célula usando o botão esquerdo do mouse e clique em Rastreamento > Iniciar Rastreamento.
  12. Para exportar o filme com os dados de rastreamento, o software não deve estar no "modo de rastreamento". Para desativar o modo de rastreamento, execute a etapa 6.10. Na janela Filme, selecione Exportar > filme. Configure o formato, o intervalo de quadros, o número de quadros por segundo e a taxa de bits. Clique em "Iniciar exportação".

7. Quantificações

NOTA: Várias medições podem ser realizadas usando dados de microscopia de vídeo46. Aqui, descrevemos três possibilidades que são exemplificadas posteriormente na seção "resultados representativos".

  1. Quantifique a sobrevivência celular para cada linhagem celular dividindo o número de células vivas em diferentes pontos de tempo pelo número total de células geradas antes que esses pontos de tempo fossem alcançados dentro de clones individuais37.
  2. Quantifique a proporção de progenitor simétrico (SP, ambas as células-filhas continuam a proliferar), assimétrico (A, uma célula-filha continua a proliferar e a outra se torna pós-mitótica) ou terminal simétrico (ST, ambas as células-filhas tornam-se pós-mitóticas) < classe sup = "ref> 15, < classe sup = "reff" >38.
  3. Meça a duração do ciclo celular calculando o intervalo de tempo das células em proliferação entre sua geração e divisão15.

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Resultados

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As culturas primárias de células do córtex cerebral isoladas de embriões E14 contêm células progenitoras e neuronais. Durante o período de imagem, os progenitores passam por várias rodadas de divisão celular, aumentando o número de células (Figura 5 e Vídeo Figura 1).

A transfecção mediada por retrovirais de algumas células progenitoras facilita a identificação de clones celulares (...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Observação em tempo real das células do córtex cerebral primário permite a análise da proliferação celular, modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular, diferenciação celular e célula de sobrevivência3,14,15,37. Mais importante, permite o estudo das linhagens de célula única, para a identificação das fases intermédias promulgada durante a progressão de NSCs para neurônios

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina balanceada de Hank (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437028
GlicoseGibcoA2494001
B27Gibco17504044
tripsina-EDTA (0,05%)Gibco25300054
ParaformaldeídoSigma16005
Soro de cabraSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
IsofluranoSigma792632
anti-MAP2, camundongoSigmaM4403
frango anti-GFPAves0511FP12
DAPISigmaD9542
Cabra anti-mouse alexa 594InvitrogenA11005
Cabra anti-frango alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zurich
Microscópio observador de célulasZeiss
Pasteur pipeta
PBS
O softwarehttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmllink para download
Tracking Tool (tTt)

Referências

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