Method Article

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A codificação da informação biológica que é acessível para as futuras gerações geralmente é conseguida através de alterações na sequência do DNA. Vida longa herança codificada em proteína conformação (ao invés de sequência) tem sido vista como mudança de paradigma mas raro. Os melhores exemplos caracterizados de tais elementos epigenéticos são príons, que possuem um comportamento de auto-montagem que pode conduzir a manifestação hereditária de novos fenótipos. Muitos príons arquetípicos exibir um marcante viés de sequência N/Q-rico e montam em uma dobra de amiloide. Estas características incomuns informaram a maioria dos esforços de rastreio para identificar novas proteínas príon. No entanto, pelo menos três priões conhecidos (incluindo o fundador prião, PrPSc) não abriga estas características bioquímicas. Portanto, desenvolvemos um método alternativo para sondar o âmbito da herança à base de proteínas com base em uma propriedade de ação das massas: o transiente superexpressão de proteínas príon aumenta a frequência em que eles adquirem uma conformação de automodelagem. Este documento descreve um método para analisar a capacidade da levedura ORFeome eliciar herança à base de proteínas. Usando essa estratégia, encontramos anteriormente que > 1% de proteínas de levedura poderia abastecer o surgimento de traços biológicos que eram long-lived, estável e levantou-se mais frequentemente do que a mutação genética. Esta abordagem pode ser empregada em alto throughput em toda ORFeomes ou como um paradigma de rastreio direcionados para redes genéticas específicas ou estímulos ambientais. Assim como o avançada genéticas telas definem inúmeras vias de sinalização e de desenvolvimento, essas técnicas fornecem uma metodologia para investigar a influência da herança à base de proteínas em processos biológicos.

Introduction

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Sistemas biológicos frequentemente experimentam flutuações transientes em abundância de proteína. Se estes têm um impacto duradouro na formação do fenótipo de um organismo ou das futuras gerações permanece obscuro. As instâncias mais conhecidas desta biologia envolvem uma rara classe de proteínas, príons, que dirige o surgimento de traços hereditários sem modificação do genoma. Em vez disso, essas partículas de fectious teinaceous e em protransmitem fenótipos através de alterações auto-perpetuar a proteína conformação1,2. Este tipo de herança foi descoberto a causa dos padrões de herança incomum de uma doença neurodegenerativa devastadora. No entanto, estudos em organismos variando de fungos para mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 desde então têm revelado que elementos de prião podem conferir valor adaptativo. Não obstante, os príons têm sido vistos como um fascinante mas rara esquisitice biológica.

Esta sabedoria prevalecente é realizada em parte porque a caracterização de herança baseada em proteína longa foi restringida por um pequeno conjunto de exemplos. Esforços recentes de rastreio sistemático tem alargado esta imagem significativamente identificando vários novo bona fide priões11 e quase duas dúzias de proteína domínios12 com a capacidade de conversão conformacional de príon-como combustível. No entanto, porque essas abordagens têm geralmente focada em preconceitos de sequência de aminoácido forte, os príons que foram descobertos compartilham as propriedades bioquímicas dos fundadores fermento priões [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Estes incluem: 1) modulares domínios que são ricas em tempo poliméricos trechos da asparagina (N) e glutamina (Q), 2) montagem em um amiloide [PRIÃO+] conformação17,18,19e 3) completa dependência de disaggregase Hsp104 função de propagação fiel de mãe para filha13,20,21. De fato, muitos bona fide príons, incluindo [GAR+], [Het-s] e mesmo o original do prião (PrPSc), iria ser desperdiçada sob tais critérios rigorosos. Talvez mais importante, eles seria incapazes de capturar qualquer romance, mecanismos de herança baseada em proteína22. Assim, a verdadeira amplitude biológica de tais fenômenos pode ser muito mais comum na natureza do que anteriormente se supunha.

Para investigar esta questão, utilizou-se uma estratégia de alta produtividade, proteoma-largo. Uma marca registrada de todos os príons, incluindo PrPSc, [GAR+], e [Het-s], é que a superexpressão transitória das proteínas causais fortemente aumenta a taxa de prião aquisição15,23,24,25,26. Tiramos vantagem desse recurso que sistematicamente perguntar, em toda a levedura ORFeome, se Estados estáveis à base de proteínas, epigenéticos podem ser iniciados, transitoriamente, induzindo a superexpressão de proteínas individuais. É sabido que superexpressão da proteína pode alterar fenótipos27. No entanto, proteínas príon são incomuns porque sua superprodução temporária produz uma mudança no fenótipo é hereditária para muitas centenas de gerações após a superexpressão inicial. Anteriormente, tiramos proveito desse recurso, bem como os padrões de herança incomum de elementos genéticos à base de proteínas, identificar dezenas de proteínas que são capazes de hereditariedade religação fenotípicas paisagens sem alterar o genoma de28. Embora algumas identificadas proteínas anteriormente eram conhecidos como priões, a maioria eram não, ressaltando o poder desta abordagem para descobrir novas formas de herança à base de proteínas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Superexpressão inicial

  1. Transforme as células de levedura (neste caso, BY4741 MAT a haploides) previamente cultivadas em líquido YPD (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona e 20 g de glicose por 1 L) com as construções candidatas desejadas da biblioteca FLEXGene ORFeome (ORFs de levedura sob o controle de um promotor induzível por galactose na estrutura do plasmídeo centromérico marcado com URA3, pBY01129).
  2. Use palitos de dente autoclavados para escolher quatro colônias separadas dessas transformações para servir como réplicas biológicas. Cultive-os por 48-72 h em 150 μL de SRaffinose-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e 20 g de rafinose por 1 L) em placas de 96 poços. Inocular colônias da primeira ORF no poço A1 de todas as placas, colônias da segunda ORF em A2 de todas as placas, etc.
    NOTA: Todas as etapas de crescimento são conduzidas a 30 ° C e em níveis atmosféricos de CO2 (407,05 ppm), salvo indicação em contrário.
  3. Confirme se as culturas estão saturadas (células visíveis a olho nu no fundo de cada poço) e use um robô de manuseio de líquidos para inocular uma matriz 1:4 de 1 μL de cada poço de placa de 96 poços em 4 poços separados de uma placa de 384 poços preenchida com 45 μL de SGal-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e 20 g de galactose por 1 L) por poço.
    NOTA: Isso cria uma placa composta na qual 4 réplicas biológicas de cada ORF são dispostas em um padrão quadrado.
  4. Ao mesmo tempo, prepare placas separadas de 384 poços contendo 45 μL de SGal-URA com os estressores de interesse (por exemplo, cloreto de manganês a 20 mM) por poço. Inocular esta placa da mesma forma que no passo 1.3.
    NOTA: Para obter a maior faixa dinâmica para detecção fenotípica, recomenda-se uma série de diluições de 2 vezes em torno da concentração LD50 de um determinado estressor. Isso pode ser feito de antemão para determinar a concentração ideal na qual observar o crescimento aumentado e reduzido.
  5. Como controle paralelo final, inocular uma terceira placa de 384 poços da mesma maneira, com o mesmo estressor incluído no meio que não induzirá a expressão do plasmídeo. Certifique-se de que a placa contenha 45 μL de SD-URA (0.74 g de CSM-URA, 6.7 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e 20 g de glicose por 1 L) por poço e seja inoculada conforme as etapas 1.3 e 1.4.
  6. Coloque imediatamente as placas com células em um empilhador de microplacas e defina o protocolo para um loop contínuo de 72 horas, medindo o OD600 com um leitor de microplacas equipado com empilhadeiras à temperatura ambiente e CO2 atmosférico (407,05 ppm).
    Nota: A frequência da medição do crescimento dependerá do número de placas (determinado em última instância pelo número de genes e condições que o investigador deseja sondar) usadas na corrida. Quanto mais placas forem usadas, mais tempo levará para o leitor de placas completar um loop e, portanto, maior será o tempo entre as medições (o tempo de medição por placa é de ~ 45 s, dependendo da instrumentação empregada).
  7. Após as medições de crescimento, use o mesmo robô de manuseio de líquidos para transferir 1 μL por poço das culturas induzidas por SGal-URA (ou seja, aquelas que sofreram superexpressão de proteínas) para novas placas de 384 poços contendo 45 μL de SD-URA por poço (meio que não permite a expressão de proteínas do plasmídeo).
    1. Paralelamente, realizar inoculações análogas de um segundo conjunto de placas de 384 poços contendo 45 μL de SD-URA por poço das culturas que foram cultivadas em SD-URA na presença dos estressores (ou seja, aqueles da etapa 1.5).
    2. Cultive as placas por 48 h a 30 ° C até a saturação em uma câmara umidificada (ou seja, uma caixa de plástico lacrada com uma toalha de papel úmida dentro).
  8. Pegue as placas da etapa anterior e reininocule 1 μL por poço em placas de 384 poços contendo 45 μL de SD-URA. Em seguida, execute uma reinoculação separada de 1 μL por poço da mesma placa de origem em uma placa separada de 384 poços contendo 45 μL de SD-URA com o estressor.
    NOTA: Isso determinará se os fenótipos de sensibilidade / resistência a um estressor persistem após o término da superexpressão da proteína.
  9. Coloque imediatamente as placas com células em um empilhador de microplacas e defina o protocolo para um loop contínuo de 48 horas medindo o OD600 com um leitor de microplacas à temperatura ambiente e COatmosférico 2 (407.05 ppm).
  10. Exporte o tempo versus medições OD600 como uma tabela XY usando o software leitor de placas. Agrupe as colunas do OD600 para cada réplica biológica e calcule a média. Crie um gráfico XY de tempo versus OD600 para gerar curvas de crescimento.
    1. Compare as taxas de crescimento de culturas que foram submetidas a uma superexpressão passada (ou seja, aquelas originalmente induzidas em meio contendo galactose antes da reinoculação em SD-URA) versus culturas que não foram submetidas (ou seja, aquelas propagadas em glicose), conforme descrito anteriormente30.
  11. Para culturas que mostram diferenças significativas de crescimento em resposta a um determinado estressor, dependendo da superexpressão de proteínas ancestrais, pegue 1 μL de cada réplica biológica, dilua-o em 10 mL de água e, em seguida, coloque 50 μL em placas contendo 5-FOA (0,74 g de CSM-URA, 1 g de 5-FOA, 50 mg de uracila, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose e 20 g de ágar por litro). Crescer a 30 °C durante 3 dias.
    1. Se isso resultar em muitas ou poucas colônias por placa, ajuste o fator de diluição de acordo.
      Nota: O 5-FOA é convertido em um intermediário tóxico pela via de biossíntese do uracila. Isso causará uma perda do plasmídeo de expressão marcado com URA3 transformado na primeira etapa.
  12. Escolha 8-32 colônias simples com palitos de dente autoclavados e fixe-os em placas de 96 poços contendo 150 μL de SD-CSM. Cresça até a saturação por 48-72 h em uma câmara umidificada a 30 ° C. Use essas culturas para inocular dois novos conjuntos de placas de 96 poços contendo 150 μL de SD-CSM, com e sem os estressores da etapa 1.11.
  13. Coloque as placas em um empilhador de microplacas e defina o protocolo para medir o OD600 em um loop contínuo de 48 horas.
  14. Analise os dados como na etapa 1.10 e confirme se as diferenças significativas de crescimento observadas na etapa 1.10 são mantidas após a perda de plasmídeo.
    NOTA: Essas células abrigam estados fenotípicos estáveis que podem ser indicativos de herança baseada em proteínas.
  15. Teste as células que mantiveram os fenótipos induzidos para características clássicas de herança baseada em proteínas (veja abaixo).

2. Testes para herança semelhante a príons

  1. "Cura" mediada por chaperonas
    1. Teste a dependência do acompanhante Hsp104.
      1. Escolha uma colônia de uma cepa de levedura que abriga um estado fenotípico estável, listre para colônias únicas em uma placa YPD (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glicose e 20 g de ágar por 1 L) contendo 3 mM de GdnHCl e cresça a 30 ° C por 3 dias. Paralelamente, risque uma colônia de uma cepa ingênua para colônias únicas em YPD + 3 mM GdnHCl como controle da mesma maneira.
      2. Repita mais 2 vezes em placas YPD novas contendo 3 mM de GdnHCl.
      3. Como a exposição ao GdnHCl pode aumentar a frequência com que surgem células pequenas, escolha várias colônias que sofreram 3 passagens no GdnHCl e verifique se há respiração mitocondrial funcional examinando sua capacidade de crescer em colônias visíveis em placas YP-Glycerol (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 mL de glicerol e 20 g de ágar por 1 L) após 7 dias.
      4. Escolha várias colônias das placas de YP-glicerol e teste a manutenção de estados fenotípicos estáveis usando o crescimento na presença do estressor em comparação com controles não "curados" e ingênuos (ou seja, células isogênicas que não abrigam o estado fenotípico, como BY4741 MATa haplóides) de maneira semelhante à descrita na etapa 1.13.
    2. Teste a dependência do acompanhante Hsp70.
      1. "Curar" através de um plasmídeo.
        1. Transforme células virgens e células que abrigam estados fenotípicos estáveis com plasmídeos marcados com URA3 expressando um alelo negativo dominante de Hsp70 (K69M)25,31 de um forte promotor constitutivo (GPD).
        2. Escolha transformantes únicos para cada um, listre para colônias únicas em uma placa SD-URA (0,74 g de CSM-URA, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose e 20 g de ágar por 1 L) e cresça por 3 dias a 30 ° C e COatmosférico 2.
        3. Repita esta passagem mais 2 vezes em placas SD-URA.
        4. Escolha várias colônias e listre para colônias únicas em placas 5-FOA para eliminar o plasmídeo.
        5. Escolher várias colónias individuais para cada isolado e testar a retenção (ou perda) dos estados fenotípicos estáveis de forma semelhante à descrita no passo 1.13.
      2. "Curar" via cruzamento genético.
        1. Cruze BY4741 MATcom cepas haplóides que abrigam estados fenotípicos estáveis e cepas virgens do tipo de acasalamento oposto (neste caso, BY4742 MATα) que abrigam deleções genéticas em dois dos quatro parálogos de levedura Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
          NOTA: Esta cepa é deficiente na função de chaperona Hsp70.
        2. Selecione para o crescimento de diplóides por estrias em colônias únicas em SD-LYS-MET (0,74 g de CSM-LYS-MET, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose e 20 g de ágar por 1 L) meio de dupla dropout.
        3. Escolha colônias diplóides únicas e cultive por 24 h a 30 ° C em 8 mL de meio pré-esporulação (0,8% de extrato de levedura, 0,3% de peptona, 10% de dextrose e 100 mg / L de sulfato de adenina).
        4. Gire as culturas por 3 min a 3.000 xg, aspire o meio de pré-esporulação (pré-SPO) e lave os pellets uma vez com água estéril.
        5. Ressuspenda os grânulos em 2 mL de meio de esporulação (1% de acetato de potássio, 0,1% de extrato de levedura, 0,05% de glicose e 0,01% de mistura de adição de aminoácidos (2 g de histidina, 10 g de leucina, 2 g de lisina e 2 g de uracila)). Crescer a 25°C durante 5 dias.
        6. Mover as culturas para 30 °C e incubar durante mais 48 h.
        7. Avalie a eficiência da esporulação procurando a presença de tétrades usando um microscópio óptico32.
        8. Tome 40 μL de cultura, gire por 1 min a 3.000 xg em um tubo de 1,5 mL e ressuspenda em um volume igual de mistura de enzimas zimolyase (1 M sorbitol, 0,1 M EDTA e 10 mg / mL de zimoliase 100T)
        9. Incubar a 25 °C durante 5 min.
        10. Aplique 10 μL de cultura digerida em uma placa de ágar YPD muito seca e nivelada e deixe a cultura se espalhar lentamente pela placa em linha reta.
        11. Deixe as placas secarem por pelo menos 30 min em uma capela de fluxo laminar.
        12. Usando um microscópio de dissecação, separe os esporos em tétrades e coloque-os na placa.
        13. Permita que os esporos haplóides individuais cresçam em colônias e teste sua capacidade de crescer em placas SD-HIS-LEU (0,67 g de CSM-HIS-LEU, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose e 20 g de ágar por 1L), indicando que eles abrigam ambas as deleções genéticas (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Teste cada um para a manutenção do estado fenotípico no fundo deficiente em Hsp70 de maneira semelhante à descrita na etapa 1.13.
          NOTA: O cruzamento desses esporos de volta para uma cepa de tipo selvagem com função Hsp70 restaurada não deve restaurar o fenótipo de príon.
  2. Teste de herança não mendeliana.
    1. Cruze BY4741 MATuma cepa haploide que abriga estados fenotípicos estáveis e controles ingênuos isogênicos com uma cepa ingênua isogênica do tipo de acasalamento oposto (neste caso, BY4742 MATα).
    2. Selecione para o crescimento de diplóides listrando para colônias únicas em meio de dupla gota SD-LYS-MET.
    3. Escolha colônias diplóides únicas e cresça por 24 h a 30 ° C em 8 mL de meio de pré-esporulação.
    4. Repita as etapas 2.2.2.3-2.2.2.12, conforme descrito acima.
    5. Permita que os esporos haplóides individuais cresçam em colônias e teste cada um para manutenção do estado fenotípico por meio da meiose usando o ensaio de crescimento, como na etapa 1.13.
      Nota: Outra característica definidora dos príons é que eles podem ser eliminados hereditariamente através da remoção da proteína casual original. Assim, o cruzamento análogo de uma cepa de príon com uma cepa que abriga uma deleção genética da proteína induzida original revogará os fenótipos de príons nos esporos que herdam a deleção. Observe também que é possível que o príon seja mantido em um estado "críptico" em tal mutante se o gene deletado for necessário para manifestar o fenótipo do príon, mas não para propagar o príon em si. Para distinguir entre essas duas possibilidades, cruze os esporos de volta para uma cepa ingênua de tipo selvagem e teste se o fenótipo do príon ressurge em um fundo genético diplóide, onde a função do gene foi restaurada.
  3. Citodução.
    1. Gere a cepa inicial do receptor BY4742.
      1. Por meio da transformação, introduza um alelo KAR defeituoso (kar1-15) que impede a fusão nuclear durante o acasalamento23.
      2. Torne esta cepa "pequena" (ou seja, incompetente para a respiração mitocondrial) inoculando uma única colônia em caldo YPD com 0,25% de brometo de etídio.
      3. Cultive a cultura a 30 ° C até o final da fase exponencial / estacionária (OD600 ~ 1).
      4. Dilua 1:1.000 em YPD fresco com 0,25% de brometo de etídio e repita duas vezes.
      5. Quando a cultura atingir a fase exponencial tardia / estacionária inicial (OD600 0,8-1,2), coloque em colônias únicas diluindo 1:10.000 em água estéril e plaqueando 50 μL em uma placa YPD. Depois de crescer por 3 dias a 30 ° C, escolha várias colônias e teste cada uma quanto à incompetência respiratória, examinando sua capacidade de crescer em colônias visíveis em placas de YP-glicerol após 7 dias.
    2. Realize a citoducção inicial em BY4742.
      1. Misture células da cepa doadora BY4741 que abriga um estado fenotípico estável com células da cepa receptora BY4742 kar1-15 virgens na superfície de uma placa de ágar YPD.
      2. Crescer por 24 h a 30 °C e COatmosférico 2 (407,05 ppm) e transferir para meio de dropout de metionina contendo glicerol (SGly-MET: 0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 20 mL de glicerol e 20 g de ágar por 1 L).
        NOTA: Isso seleciona ambos os marcadores nucleares BY4742, além de permitir a restauração das mitocôndrias funcionais por meio da troca citoplasmática.
      3. Após 3-5 dias, escolha várias colônias únicas e realize outra rodada de seleção em SD-MET (0,74 g de CSM-MET, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose e 20 g de ágar por 1 L).
      4. Paralelamente, confirme que as colônias não são diplóides passando em meio SD-LYS-MET.
    3. Realize citoduções reversas.
      1. Misture as novas cepas de doadores (desta vez, os citodutantes BY4742 kar1-15 bem-sucedidos) com pequenas células BY4741 virgens (geradas como acima) em ágar YPD.
      2. Repita as citações, conforme descrito anteriormente (etapas 2.3.2.1-2.3.2.4), exceto selecionando marcadores nucleares do receptor BY4741 em meio glicerol sem lisina (SGly-LYS: 0,74 g de CSM-LYS, 6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mL de glicerol e 20 g de ágar por 1 L).
      3. Escolher vários citodutantes e testar a manutenção de estados fenotípicos estáveis utilizando o ensaio de crescimento, como anteriormente no passo 1.13.
  4. Transformação de proteínas.
    1. Preparar o lisado.
      1. Cultive 50 mL de células que abrigam estados fenotípicos estáveis em YPD por 18 h a 30 ° C.
      2. Pellet as culturas a 3.000 x g por 4 min e depois lave duas vezes: uma vez em H2O autoclavado e depois em sorbitol 1 M.
      3. Ressuspenda as células em 200 mL de tampão SCE (1 M de sorbitol, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT, 100 mM de citrato de sódio e 1 comprimido de inibidor de protease mini-livre de EDTA por 50 mL, pH 5,8) com 50 U/mL de enzima lítica de levedura 100T.
      4. Incubar a mistura a 35 °C durante 30 min.
      5. Sonicar as células a 20 kHz e 20% de intensidade por 10 s no gelo com um desmembranador sônico.
      6. Remover os restos celulares por centrifugação a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
      7. Mover os sobrenadantes para um tubo limpo e adicionar RNase I e DNase biotinilada a um excesso de 3 vezes (conforme determinado por unidades de actividade) e incubar a 37 °C durante 1 h.
      8. Remova o DNase I adicionando excesso de esferas de estreptavidina-agarose, incubando por 5 min e peletizando por centrifugação a 10.000 x g por 1,5 min.
      9. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
    2. Prepare o esferoplasto receptor.
      1. Cultive 5 mL de células receptoras virgens na fase YPD a exponencial média (OD600 variando de 0,5-1).
      2. Colher por centrifugação (3.000 x g por 4 min) e lavar 4 vezes: duas vezes em H2O e duas vezes em sorbitol 1 M.
      3. Ressuspenda as células em sorbitol 1 M contendo 200 U / mL de enzima lítica de levedura e incube por 15 min a 35 ° C para digerir as paredes celulares.
      4. Colha os esferoplastos resultantes com centrifugação suave a 600 x g por 5 min e lave com 1 mL de sorbitol 1 M e depois novamente com 1 mL de tampão STC (1 M sorbitol, 10 mM Tris pH 7,5 e 10 mM CaCl2).
      5. Ressuspenda os esferoplastos lavados em 50 μL de tampão STC.
        NOTA: Use uma tesoura para cortar os últimos ~0.7 cm de uma ponta de pipeta; Isso criará uma boca mais larga e evitará a lise dos esferoplastos.
    3. Transforme as células virgens com proteína.
      1. Transforme 50 μL de alíquotas de esferoplastos com 50 μL de lisado de doador, 20 μL de DNA de esperma de salmão (2 mg / mL) e 5 μL de um plasmídeo de seleção marcado com URA3 (por exemplo, pAG426-GFP) 28, 33.
      2. Incubar a mistura a 25 °C durante 30 min.
      3. Centrifugue por 5 min a 600 x g para coletar os esferoplastos e ressuspenda em 150 μL de tampão SOS (1 M de sorbitol, 7 mM de CaCl2, 0,25% de extrato de levedura e 0,5% de peptona).
      4. Recupere por 30 min a 30 °C.
      5. Coloque toda a cultura em placas SD-URA.
      6. Cubra rapidamente a cultura plaqueada com SD-URA quente (~45 °C) contendo 0,8% de ágar.
        Nota: Isso evitará que os esferoplastos estourem
      7. Incubar as placas de transformação durante 2-3 dias a 30 °C.
      8. Usando um palito de dente, escolha as células em crescimento com sucesso da placa sobreposta e volte a listar colônias únicas nas placas SD-URA.
      9. Escolha dezenas de colônias para cada uma e risque em placas 5-FOA para eliminar o plasmídeo transportador marcado com URA3.
      10. Escolha as colônias que crescem nas placas de 5-FOA e teste a transferência de estados fenotípicos estáveis usando o ensaio de crescimento, como antes (etapa 1.13).

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Results

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Sabe-se que a superexpressão de proteínas altera drasticamente os fenótipos celulares27. De fato, com uma abordagem de triagem inicial, centenas de novos fenótipos foram recuperados de forma reprodutível da superexpressão de clones da levedura ORFeome usando apenas dez estressores. No entanto, os ensaios descritos acima permitem avaliar se as células retêm fenótipos estáveis a longo prazo após essa superexpressão. Uma proteína capaz de codificar tal estado é Psp1. ...

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Discussion

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Os primeiros príons de levedura foram identificados por seus fenótipos incomuns e complexos padrões de herança. As características dos priões foram então usadas para construir algoritmos e ferramentas computacionais para triagem de proteínas príon adicionais. O método descrito aqui, em contraste, é experimental e baseia-se na transitória superexpressão para criar uma duradoura mudança-a estável estado-codificado na conformação da proteína. No entanto, se a eficiência de "semeadura" montagem do prião pela superexpressão p...

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Sohini Chakrabortee, de Sandra Jones, de David Garcia, de Bhupinder Bhullar, de Amelia Chang, de Richard She e de Susan Lindquist por sua assistência no desenvolvimento de ensaios utilizados no presente livro, bem como os revisores para seus comentários pensativos.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloridrato de guanidinaSigmaCat#G3272-25GCloreto de
manganêsSigmaCat#M8054-100G
Brometo de etídioSigmaE1510Ácido químico
5-fluorooróticoSigmaCat#F5013-50MGQuímico
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/ACepa de levedura
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/ALevedura cepa
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014b/APlasmídeo
FLEXGene bibliotecaHu et al., 2007N/APlasmídeo biblioteca
Dextrose (glicose)Fisher ScientificD16-3Componente de mídia
RafinoseSigmaR0250-25GComponente de mídia
GalactoseFisher ScientificBP656-500Componente de mídia
CSMSunrise Science1001-100Componente de mídia
CSM-URASunrise Science1004-100Componente de mídia
CSM-LYSSunrise Science1032-100Componente de mídia
CSM-METSunrise Science1019-100Componente de mídia
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100 Extrato dede componente de mídia
Fisher ScientificBP1422-2Componente de mídia
peptonaResearch Products InternationalP20240-5000Componente de mídia
bacto-peptonaBD211677Componente de mídia
glicerolEMD MilliporeGX0185-2Componente de mídia
base de nitrogênio de levedura sem aminoácidosBD291920Ágar componente de mídia
IBI ScientificIB49172Componente de mídia
Sulfato de adeninaSigmaA3159-25GComponente de mídia
Acetato de potássioSigmaP1190-500GComponente de mídia
UracilSigmaU0750-100GComponente de mídia
HistidinaSigmaH8000-100GComponente de mídia
LeucinaSigmaL8000-25GComponente de mídia
LisinaSigmaL5501-25GComponente de mídia
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzima
biotinilada DNaseThermo Fisher ScientificAM1906Enzima
zimolase 100T (enzima lítica de levedura)Sunrise ScienceN0766555Enzyme
Microplate readerBioTekSynergy H1Equipment
Microplate stackerBioTekBioStack3
Equipment Plate enchimentoBiotTekEL406
Equipamento Robô de manuseio de líquidosBeckman CoulterBiomek FXEquipment
químico químico N levedura

References

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Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

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