Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Resumo

A codificação da informação biológica que é acessível para as futuras gerações geralmente é conseguida através de alterações na sequência do DNA. Vida longa herança codificada em proteína conformação (ao invés de sequência) tem sido vista como mudança de paradigma mas raro. Os melhores exemplos caracterizados de tais elementos epigenéticos são príons, que possuem um comportamento de auto-montagem que pode conduzir a manifestação hereditária de novos fenótipos. Muitos príons arquetípicos exibir um marcante viés de sequência N/Q-rico e montam em uma dobra de amiloide. Estas características incomuns informaram a maioria dos esforços de rastreio para identificar novas proteínas príon. No entanto, pelo menos três priões conhecidos (incluindo o fundador prião, PrP^Sc) não abriga estas características bioquímicas. Portanto, desenvolvemos um método alternativo para sondar o âmbito da herança à base de proteínas com base em uma propriedade de ação das massas: o transiente superexpressão de proteínas príon aumenta a frequência em que eles adquirem uma conformação de automodelagem. Este documento descreve um método para analisar a capacidade da levedura ORFeome eliciar herança à base de proteínas. Usando essa estratégia, encontramos anteriormente que > 1% de proteínas de levedura poderia abastecer o surgimento de traços biológicos que eram long-lived, estável e levantou-se mais frequentemente do que a mutação genética. Esta abordagem pode ser empregada em alto throughput em toda ORFeomes ou como um paradigma de rastreio direcionados para redes genéticas específicas ou estímulos ambientais. Assim como o avançada genéticas telas definem inúmeras vias de sinalização e de desenvolvimento, essas técnicas fornecem uma metodologia para investigar a influência da herança à base de proteínas em processos biológicos.

Introdução

Sistemas biológicos frequentemente experimentam flutuações transientes em abundância de proteína. Se estes têm um impacto duradouro na formação do fenótipo de um organismo ou das futuras gerações permanece obscuro. As instâncias mais conhecidas desta biologia envolvem uma rara classe de proteínas, príons, que dirige o surgimento de traços hereditários sem modificação do genoma. Em vez disso, essas partículas de fectious teinaceous e em protransmitem fenótipos através de alterações auto-perpetuar a proteína conformação^1,2. Este tipo de herança foi descoberto a causa dos padrões de herança incomum ....

Protocolo

1. Superexpressão inicial

1. Transforme as células de levedura (neste caso, BY4741 MAT a haploides) previamente cultivadas em líquido YPD (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona e 20 g de glicose por 1 L) com as construções candidatas desejadas da biblioteca FLEXGene ORFeome (ORFs de levedura sob o controle de um promotor induzível por galactose na estrutura do plasmídeo centromérico marcado com URA3, pBY011²⁹).
2. Use palitos de dente autoclavados para escolher quatro colônias separadas dessas transformações para servir como réplicas biológicas. Cultive-os por 48-72 h em 150 μL de SRaffinose-UR....

Resultados

Sabe-se que a superexpressão de proteínas altera drasticamente os fenótipos celulares²⁷. De fato, com uma abordagem inicial de triagem, centenas de novos fenótipos foram recuperados de forma reprodutível pela superexpressão de clones do ORFeoma da levedura, utilizando apenas dez agentes estressores. No entanto, os ensaios descritos acima permitem avaliar se as células mantêm quaisquer fenótipos estáveis de longo prazo após essa superexpressão. Uma proteína capaz de.......

Discussão

Os primeiros príons de levedura foram identificados por seus fenótipos incomuns e complexos padrões de herança. As características dos priões foram então usadas para construir algoritmos e ferramentas computacionais para triagem de proteínas príon adicionais. O método descrito aqui, em contraste, é experimental e baseia-se na transitória superexpressão para criar uma duradoura mudança-a estável estado-codificado na conformação da proteína. No entanto, se a eficiência de "semeadura" montagem do prião pela superexpressão p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de guanidina	Sigma	Cat#G3272-25G	Cloreto de
manganês	Sigma	Cat#M8054-100G
Brometo de etídio	Sigma	E1510	Ácido químico
5-fluoroorótico	Sigma	Cat#F5013-50MG	Químico
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3Δ 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	Cepa de levedura
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	Levedura cepa
Hsp70 (K69M)	Jarosz et al., 2014b	/A	Plasmídeo
FLEXGene biblioteca	Hu et al., 2007	N/A	Plasmídeo biblioteca
Dextrose (glicose)	Fisher Scientific	D16-3	Componente de mídia
Rafinose	Sigma	R0250-25G	Componente de mídia
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500	Componente de mídia
CSM	Sunrise Science	1001-100	Componente de mídia
CSM-URA	Sunrise Science	1004-100	Componente de mídia
CSM-LYS	Sunrise Science	1032-100	Componente de mídia
CSM-MET	Sunrise Science	1019-100	Componente de mídia
CSM-LYS-MET	Sunrise Science	1035-100 Extrato de	de componente de mídia
	Fisher Scientific	BP1422-2	Componente de mídia
peptona	Research Products International	P20240-5000	Componente de mídia
bacto-peptona	BD	211677	Componente de mídia
glicerol	EMD Millipore	GX0185-2	Componente de mídia
base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos	BD	291920	Ágar componente de mídia
	IBI Scientific	IB49172	Componente de mídia
Sulfato de adenina	Sigma	A3159-25G	Componente de mídia
Acetato de potássio	Sigma	P1190-500G	Componente de mídia
Uracil	Sigma	U0750-100G	Componente de mídia
Histidina	Sigma	H8000-100G	Componente de mídia
Leucina	Sigma	L8000-25G	Componente de mídia
Lisina	Sigma	L5501-25G	Componente de mídia
RNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0601	Enzima
biotinilada DNase	Thermo Fisher Scientific	AM1906	Enzima
zimolase 100T (enzima lítica de levedura)	Sunrise Science	N0766555	Enzyme
Microplate reader	BioTek	Synergy H1	Equipment
Microplate stacker	BioTek		BioStack3
Equipment Plate enchimento	BiotTek	EL406
Equipamento Robô de manuseio de líquidos	Beckman Coulter	Biomek FX	Equipment

químico químico N levedura