Artigo de método

Triagem de Nanopartículas Bioativas em Células Imunes Fagocíticas para Inibidores da Sinalização de Receptores Toll-like

DOI:

10.3791/56075

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26 de julho de 2017

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1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

Neste artigo

Resumo

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A sinalização do receptor Toll-like (TLR) desempenha um papel importante na fisiopatologia de muitas doenças inflamatórias humanas, e a regulação das respostas de TLR por nanopartículas bioativas é antecipada para ser benéfica em muitas condições inflamatórias. As células repórter baseadas em células THP-1 fornecem uma plataforma de triagem versátil e robusta para identificar novos inibidores da sinalização TLR.

Resumo

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A regulação farmacológica das respostas do receptor Toll-like (TLR) é de grande promessa no tratamento de muitas doenças inflamatórias. No entanto, tem havido compostos limitados disponíveis até agora para atenuar a sinalização de TLR e não houve nenhum inibidor de TLR clinicamente aprovado (exceto o medicamento antipalúdico hidroxicloroquina) em uso clínico. À luz dos avanços rápidos na nanotecnologia, a manipulação da capacidade de resposta imune usando nano-dispositivos pode fornecer uma nova estratégia para tratar essas doenças. Aqui, apresentamos um método de rastreio de alto rendimento para identificar rapidamente novas nanopartículas bioativas que inibem a sinalização TLR em células imunes fagocíticas. Esta plataforma de triagem é construída em células repórter baseadas em células THP-1 com ensaios colorimétricos e de luciferase. As células repórter são manipuladas a partir da linha celular monocítica THP-1 humana por integração estável de duas construções repórter induzíveis. Um deles expressa um gene secretado de fosfatase alcalina embrionária (SEAP)Sob o controle de um promotor induzível pelos fatores de transcrição NF-κB e AP-1 e o outro expressa um gene repórter de luciferase segregado sob o controle de promotores induzíveis por fatores reguladores de interferão (IRFs). Na estimulação de TLR, as células repórter ativam Fatores de transcrição e subseqüentemente produz SEAP e / ou luciferase, que podem ser detectados usando seus reagentes de substrato correspondentes. Usando uma biblioteca de nanopartículas de nanopartículas peptídicas-ouro (GNP) estabelecidas em nossos estudos anteriores como exemplo, identificamos um híbrido peptídico-GNP que poderia efetivamente inibir os dois braços da cascata de sinalização TLR4 desencadeada pelo seu ligando protótipo, lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados foram validados por técnicas bioquímicas padrão, incluindo imunotransferência. Uma análise posterior estabeleceu que esse híbrido principal tinha um amplo espectro inibitório, atuando em múltiplas vias TLR, incluindo TLR2, 3, 4 e 5. Esta abordagem experimental permite uma avaliação rápida deA nanopartícula (ou outros compostos terapêuticos) pode modular a sinalização TLR específica em células imunes fagocíticas.

Introdução

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Os receptores Toll-like (TLRs) são um dos elementos-chave no sistema imune inato que contribuem para a primeira linha de defesa contra infecções. Os TLRs são responsáveis ​​por detectar invasores patógenos, reconhecendo um repertório de padrões moleculares associados a patógenos (ou PAMPs) e a montagem de reações de defesa através de uma cascata de transdução de sinal 1 , 2 . Existem 10 TLR humanos identificados; Exceto TLR10 para o qual o (s) ligando (s) permanecem obscuros, cada TLR pode reconhecer um grupo distinto e conservado de PAMPs. Por exemplo, TLR2 e TLR4, localizados principalmente na superfície ce....

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Protocolo

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1. Preparação de meios de cultura celular e reagentes

  1. Prepare o meio de cultura celular R10 completo adicionando os suplementos de 10% de soro bovino fetal (FBS), L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1 mM no meio RPMI-1640.
    1. Prepare o meio de cultura de seleção R10-Z adicionando os antibióticos Zeocin (200 μg / mL) a R10 para manter a expressão de SEAP sob o controle de NF-κ B / AP-1 ativação. Para selecionar células que expressam os genes repórter SEAP e luciferase, adicione Zeocin (100 μg / mL) e blasticidina (10 μg / mL) a R10 (como R10-ZB).
  2. Prepare a solução de substrato SEAP dissolvendo uma bolsa do....

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Resultados

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A abordagem experimental global está ilustrada na Figura 1 . As duas linhas de células repórter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, são utilizadas para visualizar rapidamente as respostas TLR, avaliando a ativação de NF-κB / AP-1 e IRFs, respectivamente. A ativação de NF-κB / AP-1 pode ser detectada pelo ensaio colorimétrico SEAP, enquanto que a ativação IRF é monitorada por luminescência de luciferase. As células monocíticas de THP-1 podem ser facilmente deriv.......

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Discussão

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Uma vez que os TLRs estão envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias, eles emergiram como alvos terapêuticos para a modulação de respostas imunes e condições inflamatórias. No entanto, o desenvolvimento clínico de terapêuticas para inibir as vias de sinalização TLR teve sucesso limitado até à data. O fármaco antipalúdico hidroxicloroquina que inibe TLR7 e TLR9 está em uso clínico 35 , 36 . Da mesma forma, apenas um número limitado de compostos evol.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de reconhecer o apoio do Programa para Professor de Nomeação Especial (Eastern Scholar) nas Instituições de Aprendizagem Superior de Shanghai (HY), o fundo de partida do Hospital das Primeiras Pessoas de Xangai (HY), o apoio da Grant Gaudeng Clinical Medicine Grant de Shanghai Jiaotong Faculdade de Medicina da Universidade (HY) e o financiamento da Fundação Crohn e Colite do Canadá (CCFC) (SET e HY).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
THP-1-XBlue repórter célulaInvivoGenthpx-spmantém a passagem de cultura de células abaixo de 20
THP-1-Dual repotercell invivoGenthpd-nfismantém a passagem de cultura de células abaixo de 20
RPMI-1640 (sem L-glutamina)GE Health CareSH30096.02Aqueça até 37 ° C antes do uso; adicionar suplementos para fazer um meio completo R10
Soro fetal bovino (qualificado)Thermo Fisher Scientific12484028Inativado por calor; 10% em RPMI-1640
L-glutaminaThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM no meio completo R10
Piruvato de sódioThermo Fisher Scientific11360-0701 mM no meio completo R10
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, 1X, sem cálcio, magnésioGE Health CareSH30028.02Uso para lavagem de células e preparação de reagentes
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1Substrato SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Substrato de luciferase
ZeocinInvivoGenant-zn-1Antibióticos de seleção para células
BlasticidinaInvivoGenanti-bl-1Antibióticos de seleção para células repórter
Dimetilsulfóxido (DMSO) para biologia molecularSigmal-AldrichD8418-100MLUso para preparação de reagentes
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para biologia molecularSigmal-AldrichP1585-1MGUso para diferenciação celular
Lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4 ligante
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1 ligante
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3 ligante
Flagelina de S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapuroInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligante
SpectraMax Plus 384 leitor de microplacasMolecular DevicesN/ALeia o ensaio colorimétrico
Leitor de microplacas multimodo Infinite M200 Pro com injectoresTecanN/ALer luminosidade
Centrífuga Microfuge 22RBeckman CoulterN/AMicro-centrifugador com temperatura controlada (até 18.000 g)
Centrífuga Allegra X-15R BeckmanCoulterN/ACentrifugador de uso geral com temperatura controlada (para uso em cultura de células)
Placa de ensaio Costar, branco de 96 poços com fundo plano transparente, cultura de tecido tratadaCorning Costar3903Usado para ensaio de luminescência
repórter

Referências

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  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E.

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