O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.
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Artigo de método
Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ao longo dos anos, o ensaio de um híbrido de levedura provou ser uma técnica importante para a identificação e validação de interações físicas entre proteínas, como fatores de transcrição (TFs) e seu alvo de DNA. O método apresentado aqui utiliza o conceito subjacente do Y1H, mas é modificado para estudar e validar os complexos de proteínas que se ligam ao DNA alvo. Assim, é referido como o ensaio de um híbrido (Y1.5H) de levedura modificado. Este ensaio é rentável e pode ser facilmente realizado em uma configuração regular de laboratório. Embora utilizando um sistema heterólogo, o método descrito pode ser uma ferramenta valiosa para testar e validar a ligação do complexo de proteína heteromérica ao (s) alvo (s) de DNA da genômica funcional em qualquer sistema de estudo, especialmente a genômica vegetal.
Introdução
Em geral, para entender as interações proteína-DNA, o teste Y1H é o sistema preferido usado com sucesso em uma configuração laboratorial 1 . O ensaio básico de Y1H envolve dois componentes: a) uma construção repórter com ADN de interesse clonado com sucesso a montante de um gene que codifica uma proteína repórter; E b) uma construção de expressão que irá gerar uma proteína de fusão entre o TF de interesse e um domínio de ativação da transcrição de fermento (AD). O DNA de interesse é comumente referido como "isca", enquanto a proteína de fusão é conhecida como "presa". Nos últimos anos, várias versões do ensaio Y1H foram desenvolvidas par....
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Protocolo
1. Preparação do plasmídeo Construir e Reportagem
- Amplificação por PCR as regiões promotoras / "fragmentos" (de preferência ~ 250 - 500 pb) do ADN alvo a serem analisados para clonagem adicional no vector de entrada usando E. coli (TOP10).
- Após confirmação de seqüenciamento, subclone o clone positivo em um vetor de expressão pGLacZi compatível 7 conforme descrito anteriormente 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transformar a estirpe de levedura para a integração do promotor (YM4271) por....
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Resultados
O procedimento geral de montagem de placas para a co-transformação de regiões de DNA nas células de levedura com proteína de interesse ( Figura 2 ). A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões / fragmentos de DNA testados. Após o dia 5 do protocolo, uma placa bem cultivada e positiva deve ser visível como na Figura 3 . Em nosso estudo, a região promotora de 2600 pb.......
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Discussão
O procedimento padrão Y1H existente é adequado para identificar uma única presa de proteína que se liga à sua isca de DNA. Com várias modificações técnicas, o sistema existente foi aproveitado para definir redes reguladoras de transcrição. No entanto, os TFs são conhecidos por funcionar como uma parte dos complexos envolvendo duas ou mais TFs ou proteínas, com apenas alguns dos TF capazes de se ligar ao DNA. As proteínas ou TFs que possuem apenas os domínios de ligação à proteína e a falta de capacidade para se ligar ao.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos SS Wang, M. Amar e A. Galla pela leitura crítica do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob números de prêmios RO1GM067837 e RO1GM056006 (para a SAK). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as visões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Kit de sistema híbrido Pro-Quest Two |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Kit de sistema híbrido Pro-Quest Two; este vecor é modificado. É pDEST32 menos ligação ao DNA Domínio |
| pENTR/D-TOPO Kit de clonagem | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Cepa | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER Sistema híbrido |
| único pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Kit de dois sistemas híbridos |
| GATEWAY LR Clonase II mistura enzimática | Invitrogen | 11791020 | |
| mídia YPDA Clontech | 630410 | ||
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD mídia mínima | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Suplemento | Clontech | 630416 | |
| Triptofano Do Suplemento | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 poços de fundo redondo Placa | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 bloco | |
| de poço de 96 profundidades | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Folha Selável | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoetanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrífuga | Centrífuga Eppendorf | 5810R | |
| Dispositivo | Molecular | Espectrofotômetro | |
| de Microplacas SPECTRAMAX PLUSIncubadora | Thermo Fisher | Modelo nº 5250- 37 graus, 6250-30 graus | |
| Incubadora Shaker | New Brunswick | ||
| Banho-maria | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Frasco | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
Referências
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012). <....
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Reimpressões e permissões
