Artigo de método

Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 de novembro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Neste artigo

Resumo

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I κB quinase 1/α (IKK1/α CHUK) é uma Ser/Thr proteína quinase que está envolvida em uma miríade de atividades celulares, principalmente através da ativação de fatores de transcrição NF-κB. Aqui, descrevemos as principais etapas necessárias para a produção e a determinação de estrutura de cristal desta proteína.

Resumo

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Uma classe de estímulos extracelulares requer ativação de IKK1/α para induzir a geração de uma subunidade de NF-κB, p52, através do processamento de seu precursor p100. P52 funciona como um homodímero ou heterodímero com outra subunidade de NF-κB, RelB. Esses dímeros regulam, por sua vez, a expressão de centenas de genes envolvidos na inflamação, sobrevivência da pilha e ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente associado com IKK2/β e NEMO como um complexo ternário. No entanto, uma pequena piscina de também é observada como um complex(es) de baixo peso molecular. Desconhece-se a actividade de transformação de p100 é desencadeada por ativação de IKK1/α dentro a maior ou a menor piscina complexa. Atividade constitutiva de IKK1/α foi detectada em vários tipos de câncer e doenças inflamatórias. Para entender o mecanismo de ativação de IKK1/α e permitir a sua utilização como um alvo de drogas, manifestámos IKK1/α recombinante em sistemas de host diferentes, tais como Escherichia coli, inseto e células de mamíferos. Conseguimos expressar IKK1/α solúvel em baculovirus infectados células de inseto, obtenção de quantidades de mg de proteína altamente pura, cristaliza na presença de inibidores e determinar sua estrutura de cristal de raio-x. Aqui, descrevemos as etapas detalhadas para produzir a proteína recombinante, sua cristalização e sua determinação de estrutura de cristal de raio-x.

Introdução

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Atividades transcriptional da família NF-κB de factores de transcrição dimérica são necessárias para diversas funções celulares, variando de inflamação e imunidade a sobrevivência e a morte. Estas actividades são rigorosamente controladas em células e uma perda de regulamento conduz a diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes e câncer1,2,3. Na ausência de um estímulo, as atividades do NF-κB são mantidas inibidas pelo i-κB (inibidor da - κB) proteínas4. A fosforilação de resíduos específicos de EMISSAO SERIE sobre proteínas i κB marca-los para ubiquitination e degradação proteasomal subsequentes ou processamento seletivo5. As duas cinases Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β e IKK1/α, atuam como centrais reguladores das actividades do NF-κB realizando esses eventos de fosforilação6,7.

Interações entre um ligante e um receptor transduces um sinal através de uma série de mediadores, levando à ativação de fatores de NF-κB. O processo de sinalização do NF-κB pode ser classificado em duas vias distintas – canônica e não-canônicos (alternativo)8. A atividade de IKK2/β regula principalmente o NF-κB sinalização do percurso canônico que é essencial para inflamatória e inata respostas imunes9. Uma característica distinta deste percurso é uma ativação rápida e de curta duração de IKK2/β10 dentro de um complexo de IKK até então bioquimicamente descaracterizada — presume-se que seja composto de IKK1 e IKK2, bem como um componente regulamentar, NEMO (NF-κB modulador essencial )11,12,13. Entre as duas subunidades IKK catalíticas do complexo IKK, IKK2 é principalmente responsável14 para a fosforilação de resíduos específicos de protótipos IκBs (α - β e γ-) vinculado a NF-κB e também uma proteína i κB atípica, NF-κB1/p105, que é um precursor do NF-κB p50 subunidade5. Fosforilação induzido ubiquitination e degradação proteasomal de i κB (ou processamento de p105) leva à liberação e ativação de um conjunto específico de NF-κB dímeros15. Aberrante atividade do NF-κB devido a função mis regulamentada de IKK2 tem sido observada em muitos cânceres, bem como em doenças auto-imunes2,3,16.

Em contraste com IKK2/β, a atividade de IKK1/α regula NF-κB sinalização da via não-canônicos, que é essencial para o desenvolvimento e a imunidade. IKK1 fosforila resíduos específicos da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, que leva ao seu processamento e geração de p52. A formação de p52:RelB transcricionalmente ativo heterodímero inicia uma resposta lenta e sustentada para sinais do desenvolvimento7,17,18,19,20. Curiosamente, a geração da central NF-κB fator p52 este percurso é criticamente dependente de outro fator,21,NF-κB induzindo quinase (NIK)22, mas não no IKK2 ou NEMO. Nas células de descanso, o nível de NIK permanece baixo devido a sua constante degradação proteossomo dependente23,24,25. Após estimulação das células por ligantes 'não-canônicos' e em certas células malignas, NIK torna-se estabilizada para recrutar e ativar IKK1 / α. atividades da quinase de NIK e IKK1 são essenciais para o processamento eficiente de p100 em p527. IKK1 e NIK fosforilar três serinas (Ser866, 870 e 872) da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, levando para seu processamento e geração de p52. Aberrante ativação da via não-canônicos tem sido implicada em muitas Neoplasias, incluindo mieloma múltiplo de27,26,28.

Vários inibidores altamente eficientes e específicos para IKK2/β são conhecidos, embora nenhum até agora têm acabou por ser uma droga eficaz. Em contraste, os inibidores específicos/α-IKK1 são escassos. Isto pode se originar em parte de nossa falta de informações estruturais e bioquímicas na IKK1/α, que limita a nossa compreensão da base mecanicista da ativação do NF-κB pelo IKK1 em células e desenho racional de droga. As estruturas de raio-x de IKK2/β nos forneceram insights sobre o mecanismo de ativação de IKK2/β29; no entanto, essas estruturas não poderiam revelar como diferentes estímulos montante desencadear a ativação de IKK1/α ou β/IKK2 para regular a conjuntos distintos de NF-κB atividades 30,31. Para entender a base mecanicista subjacente a distinta função sinalização de IKK1/α e estabelecer uma plataforma para o projeto racional da droga, focamos na determinação da estrutura de IKK1/α.

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Protocolo

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1. preparação do vírus recombinante apropriado para a expressão de grande escala de IKK1/α

  1. Preparação de vírus P1 32
    1. Dia 1: Células placa Sf9 (~ 6 X 105) (passagem número inferior a 10) em 2 mL de meio de inseto celular Sf900 III em cada bem de uma placa de 6 e incubar a 27 ° C. Passagem de células quando eles alcançam uma densidade de 2 a 3 X 106 células por mL em suspensão diluindo em mídia fresca em uma densidade de ~ 6 X 105.
    2. Dia 2: Dilua 8 µ l de reagente de Transfeccao de Sf9 em 100 µ l de Sf900 III ou de Grace meio de inseto sem antibióticos e soro. Vórtice brevemente.
    3. Diluir 1 µ g de bacmid recombinante kit-purificado (detalhes são fornecidos em 'Representante resultados')32 em outro 100 µ l de meio mesmo, em um tubo separado.
    4. Combinar o DNA diluído e reagente de transfeccao (μL de volume total ~ 210-220) e incubar a temperatura ambiente por 15-30 min.
    5. Retire o meio do poço. Adicione 1 mL de meio fresco sem antibióticos e soro.
    6. Adicione a mistura de reagente de Transfeccao de DNA diluída gota a gota para as células. Ajuste o tamanho da gota, tal que ele não desalojar as células aderentes.
    7. Depois de ~ 6 h, adicionar 1,5 mL de meio fresco em cima ou remover o meio e adicionar 2,5 mL de meio fresco. Meio fresco morno a 25-27 ° C antes de adição.
    8. Incube as celulas a 27 ° C. Verifique os poços periodicamente cada ~ 12h para sinais de infecção viral. Realizar todos os Sf9 manutenção e expressão a 27 ° C.
    9. Dia 5: Retire o meio contendo a infecção de post de 60-72 h de células. Centrifugue por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Salvar o sobrenadante; Este é o estoque de P1-vírus. Congelar pequenas alíquotas a-80 ° C.
  2. Selecionando o melhor expressando P1 clone de vírus.
    1. Células da placa da mesma forma como descrito no passo 1.1.
    2. Próximo post dia ou h ~ 6 chapeamento, adicionar 20 µ l e 50 µ l de diferentes estoques de clone de vírus de P1 para as células em diferentes poços.
    3. Desalojar as células aderentes pipetando suave e recolher a infecção de post de 60-72 h de células infectadas por centrifugação por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Salve o sobrenadante. Este é o estoque de vírus de P2. Loja pequenas alíquotas do estoque a-80 ° C.
    4. Adicione 100 µ l de tampão de x Laemmli SDS 2 para o centrifugado colhidos. Aqueça no > 95 ° C por 10 min. centrifugador (normalmente > 10.000 x g) por 5 min.
    5. Execute 10-15 µ l de cada amostra em SDS-PAGE de 8-10% em 120-160 V até a frente de corante atinge o fundo do gel.
    6. Electro-transferência (20 V, 30-45 min) de protocolo de transferência de proteínas resolvidas por padrão semi seco em uma membrana de nitrocelulose/PVDF.
    7. Borre com anticorpo anti-IKK1 (diluição ~ 1:2, 000, deve ser otimizado) ou anticorpo anti-PentaHis (diluição ~ 1:3, 000, deve ser otimizado) para a expressão.
    8. Escolha o melhor clone de vírus P1, comparando a expressão da IKK1 recombinante.
  3. Preparação da escala grande estoque de vírus P3.
    1. Células da placa da mesma forma como descrito na etapa 1.1 em uma placa de 15 cm, contendo 25-30 mL de meio de Sf900 III.
    2. ~ 6 h post chapeamento, adicione 150-300 µ l do estoque de vírus melhor expressando P1 para as células.
    3. Após 72 h pós infecção, Aspire o meio cuidadosamente da placa em um tubo apropriado (estéril) e centrifugar o tubo a 500-1000 X g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o centrifugado (se um é formado) e salvar o sobrenadante. Este é o estoque de vírus P3.
  4. Determinar o título de vírus ideal para expressão de proteínas de grande escala
    1. Células de placa em 2 mL do meio de Sf900 III, conforme descrito no ponto 1.1, em uma placa de 6.
    2. Adicione 20, 30, 40 e 50 µ l de P3 ~ 6 h post chapeamento de poços de estoque de vírus em separado. Inclua um controle não infectado.
    3. Colheita de células de cada infecção de post bem h 48-60.
    4. Adicione 100 µ l de tampão de SDS de Laemmli X 2. Aqueça no > 95 ° C por 10 min. centrifugar (tipicamente 14.000 x g) por 5 min.
    5. Resolva a 10-15 µ l de cada amostra em um gel de SDS-PAGE 8-10%.
    6. Transferi proteína resolvida para uma membrana de nitrocelulose/PVDF, como mencionado em 1.2.6.
    7. Borre com anticorpo anti-IKK1 (diluição ~ 1: 2000, deve ser otimizado) ou anticorpo anti-PentaHis (diluição ~ 1:3000, deve ser otimizado).
    8. Use o vírus com o melhor expressar o título para expressões de grande escala.

2. grande escala expressão de 6 x, sua tag humana IKK129,33

  1. Proceder a expressão de grande escala em uma cultura de suspensão. Dividir células em 1 L de meio Sf900 III em um frasco de Erlenmeyer 2 L com tampa exalada. A densidade celular deve ser ~ 5 x 105 células/mL.
  2. Cultivar estas células em suspensão ~ 100 RPM a 27 ° C em um shaker ~ 2 dias até atingir uma densidade de 1-2 x 106/mL. Densidade de célula não deve exceder 2 x 106/mL.
  3. Adicione a quantidade desejada de vírus P3, avaliada em 1,4.
  4. Cresce a cultura infectada por h 48-60 ~ 100 RPM a 27 ° C em uma coqueteleira.
  5. Colheita de células por centrifugação a < 1.500 x g a 4 ° C.
  6. Salve o centrifugado e descartar o meio.
  7. Prossiga para a purificação da proteína diretamente. Flash congelar o centrifugado em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C para uso futuro.

3. purificação de sua-IKK133

  1. No dia 1, Ressuspender as células em 40 mL de tampão de lise (pH de Tris 25mm 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazol 10 mM, 10% de glicerol, 5mm β-Mercaptoetanol e coquetel de inibidor de protease).
    Nota: O wet centrifugado massa não foi determinada. Normalmente, ~ 2 L da cultura era utilizada para esta etapa.
  2. Lisar as células pelo sonication em ciclos de 60-70%, 5-10 pulsos de duração 30 de s em um intervalo de > 1 min, mantendo a suspensão de eritrócitos refrigerados no gelo.
    Nota: Esta etapa exige otimização com cada modelo de sonicador. Não deixe que a amostra aquecer acima de 10 ° C.
  3. Clarificar o lisado por centrifugação a ≥ 28.000 x g durante 45 min a 4 ° C.
  4. Equilibrar a 4 mL de resina de Agarose Ni-NTA com Lise e misturar o esclareceu lisado (sobrenadante) seguindo o protocolo do fabricante.
  5. Permitir que a proteína ligar a resina incubando por 2h em um misturador rotativo em uma sala de 4 ° C.
  6. Lave a resina com o tampão de Lise contendo imidazole 30mm. Verifica a concentração de proteína na fração de lavar periodicamente usando o ensaio de Bradford. Lave até esta concentração de proteína na fração de lavagem atinge 0,1 mg/mL. Normalmente o volume de cama > 20 de tampão de lavagem é necessário para chegar a este ponto.
  7. Elute com sua tag IKK1/α proteína sob fluxo de gravidade, utilizando 20 mL de tampão de eluição (o tampão de Lise contendo imidazole 250 mM). Coleta de frações de 1-1,5 mL.
  8. Verificar a pureza da proteína eluted em um gel de SDS PAGE 8 ou 10% carregando 5-10 µ l da amostra de todas as frações misturadas com Laemmli buffer.
  9. Fracções de pico (concentração ≥ 2mg/mL) do pool e medir a concentração da proteína usando o ensaio de Bradford.
  10. Digerir com TEV (01:30-50 (TEV protease: IKK1)) protease durante a noite (≥12 h) a 4 ° C.
    Nota: Otimizar a quantidade de protease PEV necessário para completar a digestão (≥ 95%) do 6 X, sua marca apriorísticas. Protease TEV foi purificado em casa.
  11. Na manhã do dia 2, incubar a proteína com 1 mM de ATP na presença de 20 mM MgCl2, β-glicerofosfato de 20 mM, 10 mM NaF e ortovanadato de sódio 1mm por 1h a 27 ° C.
  12. Filtre a solução da proteína através de um filtro de 0,45 ou 0,22 μm.
  13. Carrega 6 mL da amostra para uma coluna de tamanho-exclusão preparativa da ~ 120 mL ligada a um sistema automatizado de cromatografia líquida. Equilibrar a coluna com tampão A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerol), antes da aplicação da amostra de proteína.
    Nota: Uma coluna menor poderia ser usada dependendo do rendimento de proteína após a etapa de purificação de afinidade Ni-NTA. Ajustar/calcular o volume de carga para ser 5% do volume de coluna).
  14. Executar a cromatografia de exclusão de tamanho em uma taxa de fluxo de 1 mL/min e monitorar a eluição em 254 e 280 nm. Colete frações de tamanho de 2 mL.
  15. Verificar a pureza das frações pico (tipicamente em torno de ~ 60-70 mL) em um gel de SDS-PAGE 8-10%.
  16. Piscina as frações puras (pureza ≥ 95% com uma concentração de ≥0.5 mg/mL) e concentrar-se em um kDa 10 ou o peso molecular de 30 kDa concentrador de proteína centrífugas de corte seguindo as instruções do fabricante.
  17. Periodicamente Verifique a concentração da proteína do concentrado pelo método de Bradford e concentrar a amostra até 8-12 mg/mL.
  18. Dispense 25 alíquotas μL e congelamento flash em nitrogênio líquido. Armazene esses flash amostras congeladas no freezer-80 ° C.

4. tela para condição de cristalização de IKK1

  1. Calcule o montante total de proteína necessária para a tela para cristais, seguindo os métodos descritos abaixo (em volume).
  2. Tente diferentes inibidores (inibidores da quinase genérico: AMPPNP e Staurosporine; IKK-specific inibidores: MLN120B, composto A e XII IKK-inibidor) para realizar a triagem de cristalização. Fazer as soluções destes compostos seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que a concentração máxima do composto na sua solução não exceda 20 μM.
  3. Preparar o complexo de IKK:inhibitor para a tela de cristalização por mistura 100 μM de IKK1 com inibidor de 200 μM e incubar a 18-20 ° C por 30-40 min. centrifugar esta mistura no > 15.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Salve o sobrenadante para tela de cristalização.
  4. Use as telas de cristalização comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de materiais).
  5. Pipete 80-100 μL de cada reagente de cristalização (soluções de reservatório), usando uma pipeta multicanal ou um robô, no reservatório de uma placa de 96 poços. O prato está pronto para configurar gotas. Certifique-se de que a placa acomoda cristalização de 2 a 3 gotas para que inibidores de 2 a 3 podem ser exibidos em um único prato.
  6. Usando um robô de cristalização, dispensar e misturar 0,2 – 0.25 μL de complexo de IKK1:inhibitor com o mesmo volume de solução do reservatório.
    Nota: Triagem pode ser realizada manualmente usando volumes maiores de gota (0,5-1,0 μL de complexo de IKK1:inhibitor com o mesmo volume de solução do reservatório). No entanto, a utilização de um robô ajudaria salvar reagentes valiosos.
  7. Sele as placas imediatamente depois de definir as gotas com filmes opticamente claras para evitar a evaporação. Selar corretamente usando o aplicador apropriado. Fazer placas de réplica para cada conjunto de inibidor. Incube uma placa a 18 ° C e o outro no quarto frio (temperatura de ~ 4 – 6 ° C). Certifique-se que as incubadoras não são afetadas pela vibração.
  8. Use um estereomicroscópio com um polarizador para verificar a aparência de cristais em cada gota todos os dias durante os primeiros sete dias e então em intervalos mais longos. Sistematicamente, observe e marcar estas observações.
    Nota: Use um estereomicroscópio com um polarizador, para que os defeitos de crescimento de cristais podem ser avaliados visualmente. Aqui, cristais apareceram em uma condição onde a solução do reservatório contido 3% w/v dextrano sulfato sódio sal Mr 5.000, 0,1 M pH BICINE 8.5, 15% w/v polietilenoglicol 20.000. Cristais de IKK1 cresceu apenas na presença de IKK-inibidor XII.

5. cristal crescimento otimização29,33

  1. Preparação das soluções estoque.
    1. Prepare soluções de 30% p/v de sulfato de dextrano de diferente peso molecular (AVG. MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) em desionizada H2solução O. filtro usando 0,22 μm de filtros.
    2. Prepare acções de 1 M ou 0,5 M de buffers diferentes na faixa de pH de 6,5 a 9. Filtre soluções usando 0,22 μm de filtros.
    3. Prepare-se 25% ou 50% (p/v) PEG soluções de peso molecular diferente (AVG. MW:1000, 1.500 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, Da 20.000). Filtre soluções usando 0,22 μm de filtros.
    4. Execute uma tela de grade variando sistematicamente tipo de buffer, pH, concentração e tipo de PEG e sulfato de dextrano.
  2. Otimize a triagem tanto a 18 ° C e no quarto frio (temperatura de ~ 4-6 ° C).
  3. Misture uma quantidade igual da IKK1:Inhibitor complexo com solução bem e incubar durante a solução bem em um ambiente fechado. Esta etapa pode ser executada manualmente ou usando um robô aplicadora.
    Nota: Aqui, os cristais maiores e bem definidos (como avaliado pela cor uniforme sob o polarizador que indicou crescimento uniforme) foram obtidos as seguintes condições: 100mm BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% de sulfato de dextrano (média 15 MW kDa), 8,5-10% PEG-20 kDa no quarto frio.

6. crescimento de cristais em grandes números

  1. Preparar as seguintes soluções estoque e filtrá-los através de filtro de 0,22 μm.
    1. Prepare-se 0,5 M BisTris pH 7.0 e o BisTris propano pH 7.0 e 7.5.
    2. Prepare-se 30% (p/v) de sulfato de dextrano (MW médios ~ 15 kDa). Loja a 4 ° C.
    3. Preparar 50% PEG (MW médios ~ 12 kDa).
  2. Uso 24 bem penduradas placas de gota.
  3. Aplique graxa vedante levantados anéis de cada poço.
  4. Preparar a solução bem como segue (concentração final): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5% sulfato de dextrano ~ 15 kDa, 8.5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Prepare-se 1 mL da solução bem em tubos de 1,5 mL.
    Nota: Observou-se uma variação menor na condição de cristalização dependendo do lote de proteína, e/ou sulfato de dextrano, assim, um julgamento de uma faixa estreita é recomendado. Tanto BisTris como BisTris buffers de propano de faixa de pH mesmo rendem monocristais.
  5. Manter as soluções bem e placas untadas no quarto frio pelo menos 1 h.
  6. Prepare IKK1:Inhibitor complexo conforme descrito no ponto 4.3. Transferi as soluções bem de tubos de 1,5 mL aos poços da placa 24 bem individuais.
  7. Limpa siliconizado (comercial ou in-house (siliconização/silanização)) usando toalhetes fiapos de lamínulas de vidro e aplique jactos de ar de alta pressão identificado usando o espanador de aerossol comercialmente disponível.
  8. Coloque 1-1,5 μL de solução bem sobre uma lamínula limpa. Pipetar um volume igual de IKK1:inhibitor complexas, misture suavemente pipetando para cima e para baixo 3 - 4 vezes. Vire o deslizamento da tampa de vidro e coloque sobre o respectivo bem com fórceps e selar o poço pressionando na graxa.
  9. Depois de configurar todas as gotas de uma placa de 24, incube a placa na sala fria no escuro. Verifica ocasionalmente as gotas sob um microscópio para o aparecimento e crescimento de cristais.
    Nota: Ele não foi testado se incubar as placas de cristal sob a luz mudaria o resultado. É fundamental, no entanto, que as placas são incubadas em um ambiente com mínimo/nenhuma vibração.

7. crio proteção de cristais

  1. Preparação das soluções de criogenia.
    1. Preparar A Cryo (~ 2% de sulfato de dextrano, ~ 10% PEG 12000, 60mm BisTris propano (do mesmo pH como a solução bem pretendido), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2,5% glicerol).
    2. Preparar a Cryo B (~0.3% sulfato de dextrano, ~ 10% PEG 12000, 60mm BisTris propano (do mesmo pH como a solução bem pretendido), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 ou 25% glicerol ou 20 ou 25% glicol de etileno).
      Nota: Teste cryo-protetores diferentes além de glicerol e etilenoglicol (por exemplo, PEG-200, PEG 400, 550 de MME PEG PEG 1000).
  2. Suavemente retire a lamela de vidro que contém o cristal e coloque-a sobre uma superfície sólida com a gota de cristal voltado para cima. Delicadamente, adicionar 10 μL de solução de Cryo A em cima da gota e misture suavemente pipetando para que o cristal não é tocado.
    Nota: Esta limpa a superfície do cristal de detritos e ajudar a equilibrar o cristal com o buffer de cryo inicial. Evite os esforços mecânicos e térmicos para o cristal. Execute todas as etapas subsequentes ao microscópio para evitar qualquer dano para o cristal.
  3. Lentamente, remova o cristal líquido e manter sobre 5-8 μL da solução. Evite a desidratação do cristal. Tome cuidado para evitar o estresse mecânico e desidratação do cristal em todas as etapas subsequentes.
  4. Delicadamente adicione 2.5 – 4 μL da solução para a queda de Cryo B, misture suavemente pipetando. Cubra com um pequeno prato de Petri para evitar o fluxo de ar direto sobre o cristal. Espere 5 min. sempre tenha cuidado que o cristal não sofre mudanças rápidas da pressão osmótica ou desidratação.
  5. Repita a etapa 7.4 quatro vezes para aclimatar lentamente o cristal para a solução de criogenia.
  6. Manter 10 – 20 μL da solução cryo nesta fase (i.e., permitir que o cristal ser banhado em cerca de 20 – 25% solução contendo cryo-protetor). Mergulhe por diferentes períodos de tempo (5 min a 1 h) em crio-solução final.
  7. Congela vários cristais nos pontos de tempo diferentes.
  8. Escolha cuidadosamente um único cristal suspensa em um apropriado cryo-loop montado sobre uma base apropriada e mergulho-freeze em líquido N2. Execute esta etapa sem problemas e rapidamente para evitar a formação de gelo no cristal.
    Nota: Escolha o cristal usando um diâmetro de laço um pouco maior que o maior eixo do cristal, de modo que pode ser montado no goniômetro robótico usado em Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory.
  9. Guarde o cristal contendo cryo-loops em discos imergidos em líquido N2. Guarde estes discos em líquido N2 frasco de Dewar até que estejam prontos para a expedição por difração de raios x no Síncrotron. Proceda à recolha de dados de difração de raios-x e processamento (seções 8 e 9).
    Nota: Dados de difração de cristais de IKK1 de fontes de raios-x em casa não eram de resolução alta o suficiente para ensaios de determinação de estrutura, embora ele indicou a qualidade dos cristais para ser exibido no Síncrotron. Todos os dados de difração foram coletados em diferentes de luz síncroton (principalmente 19ID) da fonte de fótons de avanço, Argonne National Laboratory, EUA.

8. coleta de dados x-ray

  1. Colete dados de difração de raios x para a trajetória de ID19 da fonte de síncrotron APS, usando a coleção de dados remoto software34.
    Nota: Mais de 100 cristais foram testados por suas propriedades de difração. Os cristais difractado rotineiramente para uma resolução de 7-11 Å, só raramente cristais que difratada para além de 5 Å foram observado e somente um grande cristal difractado além 4.5 Å. Desde que os cristais se deteriorado rapidamente durante a coleta de dados, conjuntos de dados em diferentes partes do mesmo cristal foram coletados. Isso foi possível, já que os cristais eram grandes (maior que 400 µm), e o diâmetro do feixe utilizado foi de 100 µm.

9. raio-x processamento de dados

  1. Mescle todos os conjuntos de dados coletados em diferentes partes do mesmo cristal34.
    Nota: fundiram-se partir do melhor cristal sete conjuntos de dados e os dados resultantes foram de 93% completa. Global eu / σ foi ~ 6,8) e Rmerge foi de 89% na caixa de resolução mais alta (5.4-4.5 Å).
  2. Processo de datasets com HKL200034 para obter o grupo espacial, dimensões da unidade celular, teor de solvente e plausível composição da unidade assimétrica.

10. estrutura solução

  1. Elaboração de modelos de pesquisa
    1. Com base em modelos estruturais disponíveis de hIKK2 (pdb id 4E3C e 4KIK35), gerar uma série de dímeros com diferentes orientações de KD o N-terminal (que processa uma abertura de 30 e 62 Å, entre P578 de dois KD no dímero). Nenhum destes modelos buscada uma solução de pesquisa molecular substituição após experiências repetidas.
    2. Gere um mapa de IKK1 a partir de dados single-particle cryo-EM33.
    3. Gerar um modelo de IKK1 humano da estrutura mais alta resolução de IKK2 (pdb 4KIK de identificação).
    4. Encaixe os domínios individuais do modelo IKK1 humano na cryo EM densidade mapa da IKK1 humana usando COOT36. Este girado a orientação KD cerca de 24 graus e modificado o abertura ao ~ 58 Å N-terminal.
    5. Aplica a orientação KD do modelo cryo-EM instalados (o monômero) para todos os dímeros gerados em 10.1.1.
  2. Substituição molecular
    1. Use dímeros de 10.1.1 e 10.1.5 como modelos de pesquisa em programas PHASER37, MOLREP38 e CNS39,40.
      Nota: Aqui, usando um dos dímeros de 10.1.5 (abertura de 52 Å) como um modelo de pesquisa, seis dímeros (dois hexâmeros) foram localizados na unidade assimétrica usando MOLREP. A 52 Å abertura no modelo de pesquisa é semelhante à abertura de Å 49-50 dos dímeros (todos os seis dímeros) na estrutura refinada.

11. estrutura refinamento

  1. Procedimento de refinamento de estrutura
    1. Fixe a orientação e a posição deste modelo inicial pelo refinamento de corpo rígido no CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Refine a estrutura ainda mais usando a minimização e recozimento simulado com uma função de destino de máxima verossimilhança e uma apartamento em massa-solvente correção usando o sistema de CNS39,40.
    3. Construa o modelo baseado na 2FO-FC e Fo-Fc mapas usando Xtalview41.
      Nota: Aplicam-se DEN-assistida refinamento42 e NCS frear durante os refinamentos para melhor precisão do modelo. Com efeito, refinamento DEN melhorou dramaticamente geometrias e R-fatores da estrutura e o fator R foi de 22,2% e livre R fator foi de 27,8% para o modelo final. A melhoria dramática da R livre deve ser devido ao modelo de alta precisão de IKK1 domínios que foram gerados a partir do modelo de IKK2 (4KIK).

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Resultados

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Clonagem e expressão de diferentes construções da IKK1/α
Comprimento total que ikk1/α humano foi clonado no pFastBacHTa de vetor de expressão baculovirus dentro de seus sítios de restrição EcoRI e NotI para obter um N-terminal hexa-histidina marcados IKK1. A tag pode ser removida por digestão de protease TEV. Desde que o comprimento total IKK1/α contém regiões flexíveis em ambas as extremidades, e regiões flexíveis geralmente tornam uma proteína difícil cristalizar, nó...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solução de produção, cristalização e estrutura de duas proteínas IKK relacionadas
Partimos para determinar a estrutura de cristal de raio-x de IKK1/α com a noção de que seria um exercício relativamente simples, dado a nossa experiência com a produção de proteína IKK2/β, cristalização e a determinação de estrutura. No entanto, nos surpreendemos altamente que essas duas proteínas relacionadas comportou-se muito diferentemente em relação a facilidade de cristalização. Apesar dos esforços de vários labora...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos os funcionários a 19ID de Luz Síncroton, 24ID e 13ID no Advanced Photon Source, Lemont, IL, pelo apoio durante a coleta de dados em vários cristais. Nós estamos gratos ao Dmitry Lyumkis, Instituto Salk para buscar-no mapa de cryo-EM baixa resolução em estágios iniciais EM mapa/modelo de edifício, que foi usado para construir o modelo de pesquisa de substituição molecular inicial do IKK1. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento de bolsas NIH AI064326, CA141722 e GM071862 para GG. SP é atualmente um Wellcome Trust DBT Índia intermediário companheiro.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin foi descontinuado, substituído por Cellfectin II
Sf900 III Meio de célula de insetoThermo Fisher Scientific12658-027
Células SF9Thermo Fisher Scientific12659017
anticorpo anti-IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Anteriormente vendido pela Imgenex
anticorpo anti-PentaHisQiagen34460
membrana PVDFMilliporeIPVH00010Nitrocelulose também pode ser usado
Ni-NTA agaroseQiagen30210
Bradford reagente de ensaioBioRad500001
Superdex 200 colunaGE Healthcare28989335
Amicon concentradorMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Composto ABayer
Calbiochem IKK-inhibitor XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumItem
AMPPNPSIGMAA2647
Sulfato de dextranoSIGMA51227, 42867, 31404,
sulfato de dextranoAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Alguns deles são novos Cat # no catálogo SIGMA. O que tínhamos era originalmente de Fluka que tinha Cat # diferente.
Telas de
Crystal Screen I e II (Crystal Screen HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion e PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 e PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 e SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Crystal montaHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
SíncrotronA Fonte Avançada de Fótons (APS) no Departamento de Energia dos EUA' s Linha deluz 19 doID A Fonte Avançada de Fótons (APS) no Departamento de Energia dos EUA ' O Laboratório Nacional Argonne fornece feixes de raios-X gerados por anéis de armazenamento ultrabrilhantes e de alta energia para pesquisa em quase todas as disciplinas científicas.
de presentecristalização Laboratório Nacional de Argonne

Referências

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