Method Article

Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

DOI:

10.3791/56122

July 19th, 2017

In This Article

Summary

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Este protocolo fornece instruções para amostras de vírus de coloração negativa que podem ser facilmente usadas em laboratórios BSL-2, -3 ou -4. Inclui o uso de uma cápsula de processamento inovadora, que protege a grade de microscopia eletrônica de transmissão e fornece ao usuário um tratamento mais fácil nos ambientes mais turbulentos dentro da biocontainment.

Abstract

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A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é usada para observar a ultraestrutura de vírus e outros agentes patogênicos microbianos com resolução nanométrica. A maioria dos materiais biológicos não contém elementos densos capazes de espalhar elétrons para criar uma imagem; Portanto, uma mancha negativa, que coloca sais densos de metais pesados ​​em torno da amostra, é necessária. Para visualizar vírus em suspensão sob o TEM, eles devem ser aplicados em grades pequenas revestidas com uma superfície transparente apenas nanômetros de espessura. Devido ao seu pequeno tamanho e fragilidade, essas redes são difíceis de manusear e movimentadas facilmente pelas correntes de ar. A superfície fina é facilmente danificada, deixando a amostra difícil ou impossível de imagem. Os vírus infecciosos devem ser tratados em um gabinete de biossegurança (BSC) e alguns exigem um ambiente de laboratório de biocontainment. A coloração de vírus em níveis de biossegurança (BSL) -3 e -4 é especialmente desafiadora porque esses ambientes são mais turbulentos e técnicos são necessários tUsar equipamento de proteção pessoal (PPE), que diminui a destreza.

Neste estudo, avaliamos um novo dispositivo para auxiliar nos vírus de coloração negativos no biocontainment. O dispositivo é uma cápsula que funciona como uma ponta especializada de pipeta. Uma vez que as grelhas são carregadas na cápsula, o usuário simplesmente aspira reagentes na cápsula para entregar o vírus e manchas na grade encapsulada, eliminando assim o uso do usuário de grades. Embora esta técnica tenha sido projetada especificamente para uso em BSL-3 ou -4 biocontainment, ela pode facilitar a preparação da amostra em qualquer ambiente de laboratório, permitindo uma coloração negativa fácil de vírus. Este mesmo método também pode ser aplicado para preparar espécimes TEM corados negativamente de nanopartículas, macromoléculas e espécimes semelhantes.

Introduction

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A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é uma ferramenta eficaz para visualizar a morfologia e a ultraestrutura de espécimes biológicos que são muito pequenos para serem vistos com um microscópio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . Os TEMs disparam elétrons através de um espécimen muito fino produzindo uma imagem de maior resolução, pois os elétrons têm um comprimento de onda muito menor do que a luz. As regiões da amostra que dobram ou bloqueiam elétrons aparecem escuras, enquanto as regiões que são elétron lucent aparecem brancas.

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Protocol

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1. Preparação da experiência em um ambiente BSL-2 antes de trabalhar com as amostras de vírus

  1. Prepare ou compre Formvar e placas de cobre TEM revestidas de carbono, geralmente 200-400 mesh.
  2. Insira as grades TEM revestidas em cápsulas.
    1. Use uma lente ampliada para tornar este processo fácil de executar. Uma ou duas grades podem ser inseridas em cada cápsula. As cápsulas pré-carregadas podem ser compradas para eliminar este passo, se desejado.
  3. Transfira as cápsulas com grades revestidas de TEM inseridas, juntamente com outros suprimentos e reagentes, para o armazenamento biocontenho onde os vírus serão m....

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Results

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O método da cápsula produz uma coloração negativa de boa qualidade para imagens TEM:

Primeiro, avaliamos a qualidade das imagens geradas usando tanto o método manual da gota e os métodos da cápsula para coloração negativa do ebolavírus do Zaire. Os ebolavírus são membros da família Filoviridae , juntamente com o vírus Marburg. O ebolavírus é tipicamente de 80 a 100 nm de diâmetro e pode ter mais de 1000 nm de comprimento.......

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Discussion

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A coloração negativa é uma técnica TEM valiosa para avaliação e dimensionamento de vírus, complexos de proteínas e nanopartículas. A preparação de gotículas destes espécimes por movimentação manual de grades de reagente a manchas negativas tem sido o protocolo clássico há mais de meio século. É um processo simples, mas requer experiência adquirida através do treinamento para conclusão bem-sucedida. A excelente coloração negativa ainda é considerada um conjunto de habilidades state-of-the-art e altamente desejado em muit.......

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Disclosures

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As opiniões, interpretações, conclusões e recomendações contidas no artigo são as dos autores e não são necessariamente aprovadas pelo Exército dos EUA ou pelo Departamento de Defesa.

Acknowledgements

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Gostaríamos de agradecer e agradecer ao Dr. John Carra e Rowena Schokman pelo fornecimento de Nano-VLP Ebola purificados, Dr. Rajini Mudhasani por fornecer o vírus Chikungunya e Dr. Charles (Jason) Shoemaker por fornecer VLP de Leucemia Murina que expressa glicoproteínas de Ebolavirus. Também gostaríamos de agradecer MAJ Carl Soffler por facilitar o Programa de Estágio de Verão (SIP) e o Programa de Aprendizagem de Ciência e Engenharia (SEAP) e a Dra. Catherine Wilhelmsen para o treinamento em segurança de laboratório.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Grades TEM revestidas de Formvar/carbonoSPI3420C-MB200 mesh Pk/100
mPrep/g cápsulasEMS85010-01caixa
mPrep/f acopladoresEMS85010-11padrão 16/Pk
glutaraldehdydeEMS16320solução a 50%, grau EM
Tetróxido de ÓsmioEMS19190solução
Acetato de uranilaEMS22400em pó
Ácido fosfotúngstico de potássioEMS19500papel
de filtroWhatman1450-090tamanho 50
Tranmission Microscópio EletrônicoJEOLJEM-1011TEM
aquosa a 4% em pó

References

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  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H.....

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Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

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