Intratraqueal inoculação de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis

Resumo

Este protocolo descreve inoculações intratraqueal de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis. Este procedimento imita pulmonar exposição dos seres humanos a este potencial agente de ameaça biológica e pode ser usado para testar a vacina e a eficácia terapêutica contra tularemia pulmonar.

Resumo

Infecção pulmonar com a bactéria Francisella tularensis pode levar à doença grave e potencialmente fatal, tularemia, em seres humanos. Devido à atual falta de uma vacina de tularemia aprovado para os seres humanos, pesquisa está focada no desenvolvimento de vacinas utilizando modelos animais apropriados. O rato Fischer 344 tem emergido como um modelo que reflete a susceptibilidade humana à F. tularensis infecção e, portanto, é um modelo atraente para desenvolvimento de vacinas de tularemia. Intratraqueal de inoculação do rato Fischer 344 com F. tularensis imita exposição pulmonar em humanos. A entrega bem sucedida para a traqueia de rato é crítica para entrega pulmonar. Um laringoscópio com iluminação é usado corretamente entubar o tracheae de ratos anestesiados; o correto posicionamento dentro da traqueia é determinado por um dispositivo simples para detectar a respiração. Após a intubação, a cultura de F. tularensis é entregue em uma dose medida via seringa. Esta técnica padroniza entrega pulmonar de F. tularensis dentro da traqueia de rato para avaliar a eficácia da vacina.

Introdução

F. tularensis (Ft) faz com que a doença humana, tularemia. Quando as bactérias são adquiridas através da rota pulmonar, isto leva a tularemia pneumônica, que tem alta taxa de morbidade e mortalidade¹. F. tularensis é considerada um agente de ameaça biológica devido ao perigo associado com formas de aerossol e não há atualmente nenhuma vacina aprovada para uso humano nos EUA Um esforço intenso está em andamento desenvolver vacinas e medidas terapêuticas contra tularemia pneumônica, para proteger a população humana contra o uso ilícito desta ameaça biológica bacteriana.

Muita da pesquisa de tularemia centrou-se no modelo do rato, devido a extrema sensibilidade de ratos para F. tularensis infecção e a prevalência dos reagentes. No entanto, os ratos têm provado para ser um modelo difícil para desenvolvimento de vacinas, devido à dificuldade de demonstrar a eficácia da vacina neste modelo². Recentemente, o rato Fischer 344 foi desenvolvido como um modelo para tularemia vacina desenvolvimento³. A sensibilidade do rato Fischer 344 para várias subespécies de F. tularensis imita a sensibilidade humana⁴, e ratos podem ser protegidos contra F. tularensis desafio pulmonar por vacinação com uma cepa de vacina viva conhecida para proteger os seres humanos^5,6,7. Porque o rato Fischer 344 modelos algumas características de F. tularensis infecção dos seres humanos, pode ser um modelo extremamente útil para o desenvolvimento de uma vacina que protege contra pulmonar F. tularensis exposição.

Precisa de uma vacina eficaz para proteger os seres humanos contra a exposição pulmonar a F. tularensis. A mais provável exposição pulmonar como arma F. tularensis seria aerossol bactéria inalada para os pulmões,⁸. No entanto, geração de aerossol de F. tularensis é perigoso e complicado e requer equipamento especializado e contenção. Uma rota alternativa de exposição pulmonar em ratos que é talvez mais adaptável para vários laboratórios falta equipamento especializado é via intratraqueal inoculação⁶. Esta técnica utiliza um laringoscópio para a colocação de um cateter dentro da traqueia de um rato anestesiado. Colocação dentro da traqueia, ao invés do esôfago, é verificada por um dispositivo simples que visualiza o fluxo de ar dos pulmões. F. tularensis é posteriormente entregue aos pulmões através do cateter pela administração com uma seringa, seguida pela introdução de ar dentro do cateter para assegurar a entrega pulmonar das bactérias. Em contraste, Jemski⁵ anteriormente relatados que F. tularensis inoculada em ratos Fischer 344 através da rota intranasal não poderiam ser cultivadas dos pulmões até pós-inoculação de 3 dias, indicando a inoculação intranasal em ratos que Não resultado na entrega direta de bactérias para os pulmões.

Agente selecione formas de F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) requerem procedimentos de contenção de biossegurança nível 3 (BSL3), que impediriam a videografia. No entanto, F. novicida (Fn) está isenta do status de agente selecione devido a sua avirulence em seres humanos saudáveis e pode ser utilizado com segurança em condições de biossegurança nível 2 (BSL2)^9,10. Além disso, a Fn serve como base para as vacinas vivas atenuadas que pode proteger contra a exposição pulmonar de F. tularensis quando entregues via intratraqueal inoculação^11,12,13. A técnica apresentada aqui permite o estudo de infecções que ocorrem através da rota pulmonar utilizando ratos como um modelo para os seres humanos. Esta técnica pode ser realizada sem a necessidade de equipamento especializado de geração de aerossol. FN foi usado para as técnicas filmadas aqui.

Protocolo

este trabalho foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde. Animais protocolos envolvendo roedores foram aprovados pela Universidade do Texas em San Antonio institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC) sob o protocolo MU009(RA).

1. preparar o cateter, indicador de traqueia e inóculo de F. tularensis

1. Preparar o cateter (20 x 2 polegadas)
   1. corta a 20 x 2 na agulha e moer a ponta da agulha para um blunt e suave terminar com um ferramenta rotativa.
      Nota: O comprimento da agulha cega deve permitir que a ponta de metal rescindir cerca de 3 mm na manga cateter quando assentado sobre a agulha cega. A agulha cega dá a rigidez estrutural do cateter para permitir a colocação do cateter na traqueia, e a ausência da ponta da agulha cega salientes da manga do cateter evita prejuízo para a traqueia.
   2. Limpar as agulhas embotadas e cateteres usando 70% de etanol e esterilizar sob luz UV de 15 min.
2. Indicador de traqueia preparar
   1. Aparar uma ponta da pipeta 1.000 µ l para permitir que a ponta sentar-se em uma abertura do cateter e formar uma vedação estanque ao ar.
   2. Remover um filtro de um 200 µ l aerosol barreira pipeta ponta e lugar dentro a ponta da pipeta previamente aparado µ 1.000 l.
   3. Garantir o filtro pode mover-se livremente dentro a ponta da pipeta 1.000 µ l quando a ponta está apontada para baixo ponta.
3. Inóculo de F. tularensis
   1. Grow F. tularensis tensão durante a noite em placa de ágar apropriado em 37 ° C. Scrape aproximadamente 100 µ l do gramado bacteriano da placa de ágar com um estéril Inocular loop e usar para inocular um frasco de Erlenmeyer contendo 250 mL do meio de cultura líquido apropriado de 500 mL (para Fn: caldo tryptic soja (TSB) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) e incube a tremer durante a noite a 37 ° C.
      Nota: F. novicida usada no vídeo foi cultivado em um prato de tryptic soy agar (TSA) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado.
   2. Centrifugar a cultura líquida cresceu durante a noite a 4.221 x g em temperatura ambiente por 10 min e retire o sobrenadante sem perturbar o sedimento bactérias.
      Atenção: Por favor, siga a instituição ' recomendações de biossegurança s para descartar o sobrenadante.
   3. Suavemente Ressuspender o pellet bacteriano com 25 mL de meio líquido adequado (Fn: TSB suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) contendo 10% de glicerol, usando uma pipeta de 25 mL.
   4. Usando uma pipeta de 1 mL, alíquota a ressuspensa cultura bacteriana em 500 alíquotas µ l em frascos, congelar em um banho de gelo seco (etanol) e armazene a -80 ° C.
   5. Para determinar o título dos frascos de cultura congelada, retire dois frascos congelados armazenados a-80 ° C, descongelar no gelo e realizar diluições em série em tampão fosfato salino (PBS) seguido de chapeamento no meio de cultura apropriado (Fn: TSA contendo 0,1% L-cisteína cloridrato de). As placas são incubada 24-48 h a 37 ° C, e unidades formadora de Colônia (UFC) são enumeradas para calcular o número de células bacterianas dentro os frascos de cultura congelada (média de dois frascos).
   6. Preparar o inóculo bacteriano, descongelar um frasco congelado no gelo e em seguida diluir a cultura com PBS para a concentração final de 10 ⁷ UFC/100 µ l. O inóculo deve ser em uma concentração que produzirá a desejada CFU em 100 µ l (a concentração final de glicerol dentro o inóculo não pode ser superior a 3%, para evitar asfixia do rato). Frascos de cultura congelado armazenados a-80 ° C podem ser usados por até seis meses após o preparo.

2. Rato de anestesia

1. conectar-se a câmara de anestesia para o vaporizador de isoflurano corretamente o funcionamento de uma máquina de anestesia.
2. Conectar o tubo sobre a câmara de anestesia para o sistema de gás gás.
3. Abrir o fluxo de oxigênio sobre a máquina de anestesia para 4 L/min.
4. Definir o vaporizador de isoflurano para 5%.
5. Colocar o rato na câmara de anestesia.
   Nota: Normalmente utilizamos ratos entre 8-10 semanas de idade (130-180 g); ratos mais jovens são difíceis inocular através desta técnica devido ao pequeno tamanho da cavidade da boca.
6. Quando a indução da anestesia tem tomado lugar, manter o rato no 5% de isoflurano, 2 L/min de oxigênio para o efeito. Isso leva cerca de 3-10 min.
7. Determinar a profundidade da anestesia, a qualidade e a taxa de respiração e batimento cardíaco e a reação à estimulação reflexa, como o teste do beliscão do dedo do pé. Profundidade ideal da anestesia é indicada pela contagem de 1-1,5 s entre cada respiração.

3. Intratraqueal inoculação

1. remover o rato da câmara de anestesia e coloque o rato dorsalmente no stand roedores intubação. Anexar os dentes da frente do rato para o titular para manter o rato no local.
   Nota: Se o rato começa a despertar durante o procedimento, o cateter pode ser removido e o rato voltou para a câmara de anestesia para atingir um plano mais profundo da anestesia.
2. Usar a mão dominante para mover a língua para o mesmo lado que a mão de apoio com ponto largo Pinca polegar.
3. Uso apoiar a mão e segura a língua com o laringoscópio contra o rato ' s abaixar a mandíbula e visualizar a traqueia e o esôfago do animal. A traqueia vai abrir e fechar como o rato respira.
4. Inserir o cateter contendo uma 20 embotados-agulha, preparado na etapa 1.1, na traqueia. Pode haver resistência ligeira, e inserção na traqueia pode ser " acidentado " devido o cateter esfregando as cartilagens traqueais. Devido à umidade ou respiração superficial, a traqueia pode ser coberta pela epiglote que impede a visualização da traqueia. Suavemente, tocando a borda da cartilagem epiglote fará com que a aba de cartilagem abrir e descobrir a traqueia.
5. Remover a embotados-agulha do cateter, garantindo o cateter permanece na traqueia.
6. Permitir que alguns segundos passar para o rato para poderes respirar em torno do cateter inserido na traqueia.
7. Assente firmemente o indicador de traqueia ao cateter de abertura. Movimento da barreira aerossol indicará o cateter é inserido corretamente na traqueia.
8. Garantir que o rato está deitada no stand intubação tal que o peito do animal está enfrentando perpendicular ao plano do estande da intubação.
9. Remover o indicador de traqueia e entregar 100 µ l (10 ⁷ UFC) do inóculo contendo F. tularensis usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, de estar firmemente a ponta contra a abertura do cateter.
10. Anexar uma seringa de tuberculina ponta de deslizamento 1 mL cheia de ar e entregar 300 µ l de ar para assegurar o inóculo chega aos pulmões do rato.
11. Remover o cateter da traqueia e remover o rato da plataforma cirúrgica.
12. Permitir o rato despertar e voltar para a gaiola. Certifique-se de que a respiração voltou ao normal.
13. Determinar o UFC na F. tularensis inóculo conforme descrito na etapa 1.3.5 para confirmar o CFU entregues na traqueia.
14. Repita os passos 3.1-3,9 em animais não vacinados (ingênua) com 100 µ l PBS, no lugar de inóculo.

Resultados

A resposta humoral a inoculação intratraqueal de F. tularensis em ratos pode ser determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) contra bactérias inactivados UV, conforme descrito anteriormente,¹¹. Total imunoglobulina G (IgG) resposta de Fischer 344 ratos bactérias inactivados celular foi avaliada post-intratraqueal inoculação com uma cepa atenuada de Fn (10⁷ de inóculo CFU) no dia 14 e dia 28 (Figura 1). Simulação-...

Discussão

O rato Fischer 344 está se tornando um importante modelo para tularemia vacina desenvolvimento³. Exposição a F. tularensis através da rota pulmonar é fundamental para demonstrar a eficácia contra formas como arma de F. tularensis, porque estas são entregues como aerossóis. Intratraqueal de inoculação do rato facilita a exposição dos pulmões rato a F. tularensis sem a necessidade de aerossol grande, caro e complicado, gerando o equipamento. Todos os experimentos utilizand...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tamanho da lâmina de fibra óptica GreenLine 0	Carefusion	5-5231-00	Macintosh Perfil americano
Alça de laringoscópio do sistema GreenLight	Carefusion	4559GSP
Exel International Safelet I.V. Cateter	EXEL INTERNATIONAL	26743
Seringas Estéreis de Ponta Deslizante 1mL	BD	309659
Pinça de Polegar de Curativo de Ponta Larga	Thermo Scientific	76-302
200 μ Ponta de barreira L	GeneseeScientific	24-142
1.000 μ Ponta de pipeta em L	Olympus Plastics	24-173
Dremel 3000-2/28 Kit de ferramentas rotativas	Dremel	3000228
Suporte para intubação de roedores	Braintree Scientific	RIS 200
Isoflurano	Butler Schein	NDC 11695-6776-2
Máquina de anestesia para roedores	Surgivet	VTC302 Classic T3
Câmara de anestesia para roedores	Braintree Scientific	AB 1