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Artigo de método

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

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DOI:

10.3791/56169

⸱

9 de abril de 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Neste artigo

Resumo

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Resumo

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7, que é um patógeno de origem alimentar que causesdiarrhea, (HS), a colite hemorrágica e Síndrome hemolítico-urêmica (HUS), colonizar para o trato intestinal de seres humanos. Para estudar o mecanismo detalhado da colonização de EHEC in vivo, é essencial ter modelos animais para monitorar e quantificar a colonização de EHEC. Demonstramos aqui um modelo de colonização de rato-EHEC, transformando o plasmídeo expressando bioluminescente de EHEC para monitorar e quantificar a colonização de EHEC em hospedeiros vivos. Animais inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC mostram sinais bioluminescentes intensos em camundongos por detecção com um não-invasivo na vivo sistema de imagem. Após 1 a 2 dias pós infecção, sinais bioluminescentes poderiam ainda ser detectados em animais infectados, o que sugere que o EHEC colonizar em hospedeiros pelo menos 2 dias. Também demonstramos que estes EHEC bioluminescentes localizar de intestino de rato, especificamente no ceco e cólon, de imagens ex vivo . Este modelo de colonização de rato-EHEC pode servir como uma ferramenta para fazer avançar o conhecimento atual do mecanismo de colonização EHEC.

Introdução

EHEC O157: H7 é um patógeno que causa diarreia1, HS2, HUS3e insuficiência renal aguda mesmo4 através de água ou alimentos contaminados. EHEC é um enterobacterium patogênico e coloniza para o trato gastrointestinal dos seres humanos1. Quando EHEC primeiro aderir ao epitélio intestinal do hospedeiro, eles injetam os fatores de colonização em células hospedeiras através do sistema de secreção de III do tipo (T3SS) que funciona como uma seringa molecular induzindo um anexar e apagar (A/E) lesão posteriormente para impor adesão (colonização)5. Estes genes envolvidos na formação da lesão de A/E são codificados pelo locus do enterócito (LEE) de apagamento de ilha de patogenicidade5.

Bioluminescência é uma reação química produzindo a luz, na qual luciferase catalisa sua Luciferina de substrato para gerar luz visível6. Este processo enzimático, muitas vezes, requer a presença de oxigênio ou trifosfato de adenosina (ATP)6. Bioluminescência (BLI) de imagem permite que os pesquisadores a visualização e a quantização das interações patógeno-hospedeiro em animais vivos7. BLI pode caracterizar o ciclo de infecção bacteriana em animais vivos, seguindo as bactérias bioluminescentes que migrar para e invadir tecidos diferentes7; Isto revela uma dinâmica progressão da infecção. Além disso, a carga bacteriana nos animais está relacionada com o sinal bioluminescentes8; assim, é um conveniente indicador para estimar as condições patológicas de animais experimentais em uma maneira simples e direta.

O plasmídeo utilizado aqui contidos o operon do luciferase, luxCDABE, que é a partir da bactéria Photorhabdus luminescens que codifica seu próprio substrato de luciferase7,9. Transformando este plasmídeo luciferase-expressando em bactérias, os processos de colonização e infecção podem ser monitorados, observando estas bactérias bioluminescentes em animais vivos. Em geral, BLI e rotulado de bioluminescência bactérias permitem aos investigadores monitorar os números bacterianos e localização, viabilidade bacteriana com antibióticos/terapia tratamento e expressão de gene bacteriano em infecção/colonização6, 7. numerosas bactérias patogênicas têm sido relatadas que expressam o operon luxCDABE para examinar a sua expressão de ciclo e/ou gene infecção na infecção. Estas bactérias, incluindo uropathogenic e. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogênica Escherichia coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, foram documentados.

Vários modelos experimentais foram desenvolvidos para facilitar o estudo da EHEC colonização in vitro e in vivo21,22,23. No entanto, há uma falta de modelos animais apropriados para estudar o EHEC colonização na vivoe, portanto, uma escassez resultante de detalhes. Para facilitar o estudo da EHEC colonização mecanismo na vivo, que é valioso para construir modelos animais para observar e quantificar a colonização de EHEC em animais vivos em um método não-invasivo.

Este manuscrito descreve um modelo de colonização de rato-EHEC que usa um sistema expressando bioluminescente para monitorar a colonização de EHEC ao longo do tempo em hospedeiros vivos. Ratos intragastrically são inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC e o sinal bioluminescente é detectado em ratos com um não-invasivo na vivo de imagem de sistema13. Camundongos infectados com bioluminescência-rotulado EHEC mostrou sinais bioluminescentes significativos em seu intestino, depois de 2 dias pós infecção, que sugeriu que essas bactérias colonizaram no intestino hospedeiro após 2 dias pós infecção. Dados de imagem ex vivo mostram que esta colonização é especificamente no ceco e cólon de ratos. Usando este modelo de rato-EHEC, a colonização de EHEC bioluminescente pode ser detectada no hospedeiro vivo por um na vivo de imagem de sistema, para estudar os mecanismos detalhados da colonização de bactérias entéricas, que pode promover uma compreensão mais em EHEC-induzido por alterações fisiológicas e patológicas.

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Protocolo

Cuidado: EHEC O157: H7 é um nível de biossegurança 2 (BSL-2) patógeno de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) instrução de biossegurança (https://www.cdc.gov/). Portanto, todos os procedimentos experimentais envolvendo EHEC devem ser executados em uma facilidade BSL-2. Use luvas e jalecos de laboratório durante a realização do experimento. Trabalho em uma gabinete de biossegurança certificada (BSC). Desinfete a bancada experimental, antes e após o procedimento experimental com etanol a 70%. Todos os instrumentos ou equipamentos que EHEC contato (ou potencialmente contato) deve ser desinfectado com etanol 70% ou água sanitária. Resíduos contaminados (ou potencialmente contaminados) devem ser selado e esterilizado com cuidado. Use uma máscara, óculos de proteção, luvas duplo ou um macacão, se necessário. Os ratos fêmeas C57BL/6 de 6 semanas de idade foram comprados e mantidos pela Universidade de laboratório Animal centro de Nacional Cheng Kung (NCKU). As experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado de Animal institucional e Comitê de uso de NCKU (número de aprovação 104-039).

1. geração de bactéria EHEC Bioluciferase-etiquetado

  1. Mix 50 ng o Ácido desoxirribonucleico (DNA), 1 μL de cada 10 μm para a frente e reverter as primeiras demão, desoxinucleótidos de 2,5 mM 2 μL (dNTPs), 2 μL de 10x buffer, 0,2 µ l de DNA polimerase e água de bidestilada estéril (ddH2O) para um volume final de 20 μL para amplificar o antigaveta canamicina, de gene nptII 24. O modelo de DNA é de pBSL18024, que é comprado de projeto nacional de BioResource (NBRP). As condições PCR são listadas na tabela 1 e a sequência de cartilha está disponível na tabela 2.
  2. Ligam os produtos PCR para um vetor de clonagem comercial seguindo o kit protocolo (consulte Tabela de materiais).
  3. Excisar o fragmento do gene nptII do vetor clonagem por NsiI e SmaI e clonar em pBBR1MCS4, que é digerido pela ScaI e NsiI pAKlux29 -criar o plasmídeo canamicina resistente, pWF27813.
  4. Excisar o operon luxCDABE , do luciferase expressando de shRNA9, pAKlux2, pela SpeI-HF e ScaI e clone SpeI-HF e SmaI digerido pWF278 para gerar canamicina resistente e luciferase expressando de shRNA, pWF27913.
    Nota: Para as extrações do plasmídeo e purificações o fragmento extirpado, use a extração comercial do plasmídeo e o kit de extração do gel, respectivamente. Para a digestão enzimática, misturar 100 ng DNA, 1 μL de buffer x 10, 1 μL de cada enzima de restrição selecionada e ddH estéril2O para um volume total de 10 μL e incubar a 37 ° C para 2,5-3 h.
  5. Transforme o plasmídeo pWF279 em células competentes de Escherichia coli O157: H7 EDL933 por eletroporação com 2.500 V para ms 4.
  6. Incube as células de bactérias transformadas em 1 mL de meio de Luria-Bertani (LB) a 37 ° C por 1h.
  7. As bactérias em uma placa de ágar LB suplementado com 50 µ g/mL de canamicina a 37 ° C por 16-18 h da placa.
  8. Verificar o sinal bioluminescente da placa por um na vivo de imagem máquina no dia seguinte. Escolher uma única colônia da placa e a cultura em 3 mL LB suplementado com 50 canamicina µ g/mL a 37 ° C por 16-18 h.
  9. Prepare o suporte de ações bacteriana diluindo 100% glicerol em ddH estéril2O tornar a solução de glicerol de 30%.
  10. Congelar a canamicina resistente bactéria de e. coli O157: H7 EDL933 abrigando o plasmídeo luciferase como um estoque bacteriano em uma tampa de rosca cryovial como uma proporção de 1:1 de solução de glicerol cultura e 30% bactérias a-80 ° C. A concentração final de glicerol é 15%.

2. preparação de bactéria EHEC bioluminescentes para inoculação Oral

Nota: O fluxograma cronograma dos procedimentos experimentais para a preparação de EHEC e gavagem oral rato é apresentado na Figura 1 para auxiliar na preparação experimental.

  1. Raia e. coli O157: H7 EDL933 as bactérias abrigando plasmídeo luciferase em uma placa de ágar LB com 50 canamicina µ g/mL de estoque-80 ° C. Crescem as bactérias para 16-18 h a 37 ° C.
  2. Escolha uma única colônia da placa durante a noite e cultura no meio de 3 mL LB com 50 canamicina µ g/mL para 16-18 h em uma incubadora de 37 ° C a 220 rpm.
  3. Subcultura as bactérias (diluição de 1: 100) em canamicina (50 µ g/mL) contendo caldo LB para 2,5-3 h em uma incubadora de 37 ° C a 200 rpm. (Por exemplo, adicione 2 mL a noite cultivadas bactérias para 200 mL LB suplementado com canamicina (50 µ g/mL)).
  4. Incubar as bactérias para 2,5-3 h e medir o valor de densidade óptica em 600 nm (OD600) até o valor é entre 0,9 a 1. O número de células bacterianas é em uma densidade de cerca de 108 colônia formando unidades (CFU) / mL.
  5. Centrifugar as bactérias re-cultivadas em 8.000 x g durante 30 minutos, 4 ° C.
  6. Desprezar o sobrenadante sem agitar o sedimento de bactérias e lave a pelota com 100 mL 0,9% solução salina normal estéril por agitação suave.
  7. Repita os passos de 2.5 e 2.6 uma vez.
  8. Após a lavagem, centrifugar a cultura bacteriana a 8.000 x g por 30 min, 4 ° C e descartar o sobrenadante suavemente.
  9. Condensado a pelota em 100 vezes com solução salina normal estéril 0,9%. Por exemplo, se são centrifugadas bactérias de 200 mL, adicione salina 2 mL para suspender o sedimento.
  10. Confirme as bactérias CFU (deve ser aproximadamente 109 UFC/100 μL após a condensação em solução salina normal) com chapeamento concentradas bactérias através de um de 10 vezes de diluição serial25.

3. Mouse gavagem Oral de EHEC

  1. Trate de camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 semanas com água de estreptomicina (5 g/L) por 24 h.
  2. Após 24h, mude para regular água potável para outro 24h antes de gavage. Após o tratamento com água normal para 24h, os ratos estão prontos para gavagem oral de EHEC.
  3. Encha a seringa com bactérias EHEC 100 μL, puxando o êmbolo para trás. Não garantir nenhuma bolha de ar na seringa. Remova as bolhas, encaixe a seringa com os dedos.
  4. Levante o animal delicadamente e coloque-o no topo da gaiola com cuidado.
  5. Segure o mouse pela cauda cuidadosamente, e o animal vai agarrar o topo da gaiola e tentar te afastar de mim.
  6. Contenha suavemente o mouse segurando a pele solta do pescoço e costas o animal com o polegar e o indicador para evitar que a cabeça do rato se mova.
  7. Segure o mouse na posição vertical para inserir a agulha de gavagem e garantir que a cabeça de rato é imobilizado e vertical.
  8. Insira a agulha de gavagem para a boca do rato após o céu da boca e mover para baixo no esôfago e em direção ao estômago.
  9. Quando a agulha inserida é metade ou o comprimento de dois terços no mouse, injete 100 bactéria EHEC μL, que contêm aproximadamente 109 células CFU.

4. visualização

  1. Após a intubação oral, detecta os sinais bioluminescentes em 1 a 2 dias.
  2. Antes de examinar os sinais bioluminescentes de animais, anestesia, colocando-os em uma câmara de isoflurano em 2,5% 1,5 L/min de oxigênio.
  3. Espere por 2-5 min até que todos os ratos se tornar inconsciente e parada em movimento. Animais estão prontos para a deteção em vivo de bioluminescência.
  4. Detectar e imagem bioluminescentes sinais dos animais por um na vivo sistema de imagem. Por favor, veja a seção 5 "Aquisição de dados" para operação de software. Durante o processo de geração de imagens, todos os animais estão sob um fornecimento contínuo de isoflurano em 2,5% 1,5 L/min de oxigênio.
    1. Clique em arquivo > ao vivo e manualmente o foco do mouse.
    2. Selecione a intensidade de laser e tempo de exposição.
    3. Clique em adquirir > capturar.
  5. Para a imagem latente ex vivo , eutanásia os ratos por deslocamento cervical e retire o intestino inteiro de ratos infectados. Coloque os intestinos em uma placa de Petri-9cm e imagem pelo na vivo sistema de imagem. A configuração é o mesmo que na vivo imagens exceto o campo de visão é definida como A/B. Por favor consulte a seção 5 "Aquisição de dados" para obter detalhes.
    Nota: Método por deslocamento cervical: conter os ratos no topo da gaiola agarrando a cauda com uma mão, para que os animais agarrar a gaiola. Coloca uma caneta ou o polegar e o primeiro dedo da outra mão contra o pescoço na base do crânio. Rapidamente empurre para a frente com a mão ou objeto, enquanto a cabeça de restrição e puxar para trás com a mão segurando a cauda.
    Olhe com cuidado para confirmar respiratória e sem pulsação.

5. aquisição de dados

Nota: O software utilizado para aquisição de dados é listado na Tabela de materiais.

  1. Para aquisição de imagem, abra o painel de controle de aquisição do software (Figura 2).
  2. Selecione "Luminescentes", "fotografia" e "Sobreposição".
  3. Definir o tempo de exposição, como "Auto". Definir Binning como "Meio".
  4. Luminescentes e 8 estabelecem ƒ/parar como 1 para fotografia. Ƒ/parar controles a quantidade de luz recebida pelo detector CCD.
  5. Defina o campo de visão, com base no campo de imagens que são de interesse para adquirir. Opção "D" pode caber cinco ratos de 6 semanas de idade e imagem-los todos em um tempo. "C" pode imagem três ratos de 6 semanas de idade em um campo.
  6. Uma vez que os ratos/amostras estão prontas para tratamento de imagens, clique em "Adquirir" para aquisição de imagens.
  7. Abra os dados de imagem que foi adquiridos.
  8. Abra o painel de paleta de ferramentas (Figura 3).
  9. Selecione Ferramentas ROI. Recomendamos o círculo (o um mais à esquerda) para variar a área bioluminescente em imagens (Figura 4).
  10. Clique em "Medida ROIs" (ícone de lápis) para medir a intensidade de superfície bioluminescente (Figura 3). O painel de medições de ROI e os valores de quantificação aparecem (Figura 5).
  11. Use a medida de configurar no canto esquerdo do painel de medições de ROI para selecionar as valores/informações necessárias (Figura 6), caso contrário clique em "Exportar" para exportar esta tabela de dados e salvar como arquivo. csv (Figura 5).
  12. Use os valores da coluna "Fluxo Total (p/s)" como a quantificação de intensidade bioluminescentes no arquivo. csv.

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Resultados

Nós administramos bioluminescência-rotulado EHEC (~ 109 células bacterianas) para 6 semana de idade camundongos C57BL/6 fêmeas, por gavagem oral. Após a inoculação oral de EHEC aos ratos dentro de 1h, os animais foram examinados pelo sinal bioluminescente, na vivo sistema de imagem como mostrado na Figura 7. Os resultados mostraram um forte sinal bioluminescente em camundongos gavage com bioluminescência-rotulado EHEC. Examinamos os sinais...

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Discussão

Tem sido relatado que EHEC transformada com o plasmídeo luciferase tem sido utilizada para examinar sua localização em hosts ou expressão de gene em vivo8,11,12. O modelo murino demonstrado aqui também tem sido relatado para detectar o sincronismo de EHEC colonizado e localização no anfitrião murino8. Não obstante, nós fornecemos o protocolo de detalhe de como administrar a inoculação de EHEC aos...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos o Chi-Chung Chen do departamento de pesquisa médica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) pela ajuda no mouse, infecção e o apoio do centro de animais de laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung. Este trabalho é apoiado pelo Ministro da ciência e tecnologia (a maioria) concede (mais 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) para CC.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incubadora ShakerYIH DERLM-570Rincubação de bactérias 
Incubadora de agitação orbitalFIRSTEKS300incubação de bactérias 
fonte pBSL180do gene nptII
fonte pAKlux2do operon luxCDABE
T& Um Kit de ClonagemYeastern BiotechFYC001-20Puso para clonagem de TA 
Nsi INEBR0127Suso para clonagem de plasmídeos 
Sca INEBR0122Suso para clonagem de plasmídeos 
Spe I-HFNEBR0133Suso para clonagem de plasmídeos 
Sma I Uso do NEBR0141Spara clonagem de plasmídeos 
Uso de T4 ligaseNEBM0202Spara clonagem de plasmídeos 
Ex TaqTaKaRaRR001Auso para amplificação de PCR
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001Auso para amplificação de PCR
dNTP Mistura Uso de TaKaRaRR001Apara amplificação de PCR
Máquina de PCRaplicada Biosystem 2720 Termociclador  para amplificação de PCR
GlicerolSIGMAG5516-1Luso para solução de estocagem de bactérias
NaClSigma31434-5KG-Rquímico para fazer meio LB, 10 g / L
TriptonaCONDA pronadisaCat 1612.00químico para fazer meio LB, 10 g / L
Extrato de levedura em póAffymetrix23547-1 KGquímico para fazer meio LB, 5 g / L
ÁgarCONDA pronadisaCat 1802.00químico para fazer ágar
LB canamicina Antibióticos SigmaK4000-5G, uso para seleciton
estreptomicina Antibióticos SigmaS6501-100G, eliminam a microbiota em camundongos
Célula competente EDL933Método caseiroestá em documento suplementar 
EletroporadorMicroPulserpara eletroporação
Cuvetes de eletroporaçãoGene Pulser/MicroPulser1652086para eletroporação
Centrífuga de alta velocidadeBeckman CoulterAvanti, J-26S XPuse para centrifugar bactérias 
Rotor de Ângulo FixoBeckman CoulterJA25.5use para centrifugar bactérias 
Rotor de Ângulo FixoBeckman CoulterJLA10.5use para centrifugar bactérias 
garrafas de centrífugaBeckman CoulterREF357003uso para centrifugar bactérias 
garrafas de centrífugaThermo Fisher scientific3141-0500use para centrifugar bactérias 
Eppendorf Biofotômetro Plus eppendorfAG 22331 hamburgopara medir o valor OD600 de
bactérias C57BL/6 camundongos Centro de Animais de Laboratório da NCKU
jaleco, luvaspara proteção pessoal 
isoflurano Panion & BF Biotech Inc.G-8669para anestesia de camundongos, seringa de grau farmacêutico
de 1ml uso para gavagem oral de camundongos
alimentação reutilizável de 22 G com ponta de bolaφ 0,9 mm X L 50 mmuso para gavagem oral de camundongos
tesouras cirúrgicasuso para experimento com camundongos
Sistema de imagem Xenogen IVIS 200Perkin ElmerUso do espectro IVISpara captura de imagens bioluminescentes 
Software de imagem vivaPerkin Elmerversão 4.1uso para quantificar os dados da imagem
Agulha de

Referências

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