Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Resumo

Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.

Introdução

Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas¹. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido².

ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa^3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificu....

Protocolo

o uso dos animais descritos nas seções abaixo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da Universitat Autònoma de Barcelona e Animal e pelo departamento d ' Agricultura, Ramaderia, Pesca eu Alimentació da Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).

1. armazenamento e inativação de célula alimentador

Nota: fibroblastos humanos prepúcio (HFF-1) foram previamente congelados em 1 mL de solução de congelação composta de 90% soro Fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido ( DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até uso.

1. Descongelar um frasco criogênico do HFF-1 (1 mL) mergulhando o f....

Resultados

Na sequência deste protocolo, mais 95% da formação de consequência deve ser alcançado após a primeira semana da cultura (figura 1A). Estabelecimento de linhas de mESC após seis passagens é variável entre repetições experimentais, com uma média de 60-80% de sucesso. A adição de 2i não melhorar significativamente os resultados ao trabalhar com cepas de rato permissivas, tais como aqueles com antecedentes de 129S2, mas é necessário quando se trabalha com cepas n.......

Discussão

Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.

Para garantir a máxima eficiência, é importante c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL	BD
2-β-mercaptoetanol	Life Technologies	31350-010
Placa de 4 poços	Thermo Scientific Nunc	176740
Solução ácida de Tyrode	Caseiro		Ver receita em Nagy et al, 2003. Para armazenamento de curto prazo (até 1 mês), mantenha-o a 4 ° C. Alternativamente, para armazenamento de longo prazo, mantenha-o a -20 ° C. Se a eficiência da solução diminuir, ela deve ser acidificada pela adição de uma pequena gota de HCl 1M.
BSA	Sigma	A3311
IgG anti-rato de frango, sondas moleculares Alexa Fluor 488	- Invitrogen	A-21200	diluição 1:500. Anticorpo secundário para anticorpos de camundongo Oct4, Tuj1, αSMA e AFP.
CHIR990212	Axônio Medchem	1386	Reconstituir com 2,15 ml de DMSO por cada mg de pó, para obter uma solução-mãe de 1 mM. Alíquota no volume desejado e armazene a -20&C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	Inative-o antes de usar aquecendo por 30 minutos a 56ºC. Alíquota e armazene a -20º C
Agulha de lavagem	BD	304000	Corte a ponta da agulha e triture até obter uma ponta romba em uma pedra abrasiva
Gelatina de pele suína	Fluka	48724	Diluir a 0,2% em água destilada e autoclavar. Cada diluição pode ser usada por um mês.
IgG anti-coelho de cabra, sondas moleculares Alexa Fluor 594	- Invitrogen	A-11037	diluição 1:500. Anticorpo secundário para o anticorpo de coelho Sox2.
HBSS	BioWest	L0611
CZB  Tamponado com Hepes			Caseiro Ver composição em Chatot et al, 1989
Gonadotrofina coriônica humana	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	Diluir em NaCl 0,9% a 50 UI / ml. Alíquota em 1 ml e armazenar a -20º C por até dois meses. Depois de descongelado, não congele novamente.
Fibroblastos de prepúcio humano	ATCC	ATCCSCRC-1041	Para armazenamento a longo prazo, recomenda-se armazená-los em nitrogênio líquido.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Fotossensível. Recomenda-se alíquota em pequenos volumes, como 10 ml, e armazená-la a -20º C (verifique a data de validade). Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	Suplemento com 4 mg/ml BSA. Equilibre em 37º C e 5% de CO2 por dia antes do uso.
Fator Inibidor de Leucemia	Merk Millipore	ESG1106
Camundongos	Charles River/Harlan		Recomenda-se o uso de camundongos de uma cepa permissiva em termos de derivação mESC (como 129S2 ou C57BL). No entanto, as linhagens endogâmicas são menos eficientes na produção de embriões. Portanto, recomenda-se o uso de uma cepa híbrida, como 129S2 x C57BL ou B6CBAF1 para aproveitar o vigor híbrido.
Óleo mineral	Sigma	M8410	Embrião testado. Fotossensível.
Mitomicina C	Serva	2980501	Reconstituir o pó com água MilliQ a 0,5 mg/ml. Armazenar a 4º C protegido da luz. Atenção, é prejudicial e suspeito de causar câncer.
Anti-tubulina de camundongo β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	diluição 1:500
Camundongo monoclonal anti-&alfa;SMA	Sigma	A5228	Diluição 1:200
Camundongo monoclonal anti-AFP	R& D Systems	MAB1368	diluição 1:50
Mouse monoclonal anti Oct3/4	Santa cruz	Sc-5279	Diluição 1:50
Aminoácidos Não Essenciais	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axônio Medchem	1408	Reconstituir com 2,08 ml de DMSO por cada mg de pó, para obter uma solução-mãe de 1 mM. Alíquota no volume desejado e armazene a -20&C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.
Placa de Petri (35mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
placa de Petri (60mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
Soro de égua grávida gonadotrofina	Foligon	Foligon-1000 UI	Diluir em NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Alíquota em 1 ml e armazenar a -20º C por até dois meses. Depois de descongelado, não congele novamente.
Coelho policlonal anti-Sox2	Merck Millipore	AB5603	diluição 1:200
T75 falcão	Thermo Scientific	130190
Tripsina-EDTA 10x	BioWest	X0930	Diluir 1:10 em HBSS para obter uma solução 1x

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