Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Summary

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Abstract

Células exibem morfologias diferentes e complexas relações anatômicas. Como as células interagem com seus vizinhos? Que as interações diferem entre tipos de células, ou mesmo dentro de um determinado tipo? Quais os tipos de regras espaciais que eles seguem? As respostas a essas perguntas fundamentais na vivo foram dificultadas até agora por falta de ferramentas para a rotulagem de célula única de alta resolução. Aqui, um protocolo detalhado para atingir células única com uma técnica de FlpOut MultiColor (MCFO) é fornecido. Esse método se baseia em três diferentemente marcados repórteres (HA, bandeira e V5) sob controle UAS que são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de um calor induzida por choque Flp recombinase, que aleatoriamente elimina as fitas FRT-FRT-paragem em células individuais: expressão ocorre apenas em células que expressam também um driver GAL4. Isto leva a uma matriz de cores diferentes células de um tipo de célula dado que permite a visualização da morfologia das células individuais em alta resolução. Como exemplo, a técnica MCFO pode ser combinada com drivers de GAL4 gliais específicos para visualizar as morfologias dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto drosófila .

Introduction

Glia, a população de células não-neuronais do sistema nervoso (NS), foram por muito tempo acreditou que fornecem uma estrutura estática de neurônios e, portanto, não foram estudados em detalhe. No entanto, em humanos, glia constituem a grande maioria das células no NS (~ 90%) e caem em várias categorias diferentes, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e células de Schwann. Em Drosophila, glia constituem cerca de 10% das células da NS. Curiosamente, suas morfologias e funções são muito semelhantes aos encontrados em vertebrados^1,2. Suas morfologias incluem a barreira hemato - encefálica (BBB) formando epitélios, ensheathing e células astrocyte.

O sistema nervoso central de Drosophila (CNS) é composto das seguintes estruturas principais: regiões do córtex que contêm os corpos celulares neuronais; neuropils que abrigar conexões sinápticas; intervalos de axônio de pequenos e grandes que se conectar a diferentes neuropiles; nervos periféricos que conectam os músculos e órgãos sensoriais com o CNS (Figura 1). Glia encontram-se associados com todas estas estruturas anatômicas: glia Cortex (CG) nas regiões corticais, como astrocyte glia (AIG) e ensheathing glia (EG) nas regiões neuropile, ensheathing glia também estão associados com intervalos de axônio central e periférico nervos (EGN) e finalmente, duas folha-como glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), que juntos formam uma camada contígua que cobre o NS inteiro (Figura 2).

Estudos anteriores mostraram que glia desempenham papéis importantes no desenvolvimento do NS; monitorar os números de celular neuronal por reagir a circula sistemicamente insulin-como peptides, fornecem suporte trófico para os neurônios, tais como o transporte do lactato astrocyte-neurônio e eliminar os neurônios morrendo por fagocitose^{3,4 , 5 , 6}. no NS maduro, glia manter o BBB, ocupam os neurotransmissores e manter a homeostase iónica, atuam como as principais células do sistema imunológico da ns, desde que os macrófagos não podem violar o BBB e modulam a atividade sináptica, bem como comportamento animal^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Se os diferentes subtipos gliais executam funções especializadas permanece uma importante questão em aberto. No entanto, uma análise sistemática de todo o genoma da glia, especialmente no adulto, é dificultada pela falta de ferramentas genéticas adequadas para sua manipulação. Aqui, um método que permite a caracterização eficiente e fácil de formas de célula para estudar interações célula-célula complexo é apresentado. Esta técnica foi aplicada para caracterizar a morfologia dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto Drosophila , mas, dependendo do driver específico GAL4 usado, isso poderia ser adaptado para estudar neurônios^12,13 , qualquer tipo de entrelaçamento de células e em princípio qualquer tecido em qualquer fase do desenvolvimento.

Protocol

1. moscas preparando-se para experiências MultiColor FlpOut (MCFO)

Nota: técnica de The MCFO refere-se a uma versão modificada da excisão de gaveta mediada por Flp parada chamado (FlpOut). Transgénicas MCFO moscas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-recombinase Flp e repórteres diferentes sob UAS controlam. Cada repórter consiste de um backbone comum de um myristoylated (myr) super pasta verde proteína fluorescente (sfGFP), no quais 10 cópias de uma marca de epítopo (EG., HA, bandeira ou V5) foram inseridos. As proteínas não-fluorescente resultantes são nomeadas " monstro de espaguete GFPs " (smGFPs) ¹⁴ e podem ser detectados usando anticorpos específicos contra as tags epítopo diferente.

1. Cruz voa com o hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) e a gaveta MCFO para as glia GAL4 motorista linhas apropriadas (veja a tabela de materiais) .
   1. Como o hsp já está ativo a 25 ° C e poucas células podem sofrer recombinação, levando a uma rotulagem inespecíficos, configurar cruzes a 18 ° C para evitar a leakiness do sistema. Espere cerca de 20 dias a 18 ° C para obter a geração F1. Após o calor choque (consulte a etapa 2), manter as moscas a 25 ° C ( Figura 3).

2. Choque de calor

Nota: dependendo do local de inserção, a eficiência de hsp-Flp pode diferir; portanto, o tempo de choque do calor ideal tem que ser otimizado. Para este protocolo, foi usado um estoque de mosca MCFO no qual o hsp-Flp foi inserido no cromossomo X (veja a Tabela de materiais).

1. Transferência a descendência da Cruz na etapa 1.1 (moscas de geração F1, 3-4 dias de idade) em novos frascos contendo alimento e calor chocá-los a 37 ° C em banho-maria.
   Nota: O jovens moscas (1-2 dias de idade) são muito sensíveis ao choque térmico. Espere 1 ou 2 dias antes de realizar o choque térmico a fim de reduzir a mortalidade causada pelo tratamento. Uso alguns da geração F1 voa como um controle, sem choque térmico.
2. Durante o choque de calor, manter moscas em frascos normais com alimentos para diminuir a taxa de mortalidade induzida por estresse. Coloque as fêmeas e os machos em frascos separados.
3. Certifique-se de mergulhar o frasco inteiro na água, certifique-se de um choque de calor homogêneo. Use um choque de 5-8 min como ponto de partida adequado para a rotulagem esparsas de células da glia com muitas linhas de motorista GAL4; a duração do choque deve ser otimizada para cada motorista e experiência (tempos de choque de calor mais curtos ou mais longos podem ser necessários).
4. Após o choque de calor, colocar os frascos horizontalmente no banco por alguns minutos para permitir que as moscas para se recuperar do choque e calor.
   Nota: Não é necessário mudar os frascos.
5. Manter as moscas a 25 ° C e dissecar (consulte a etapa 3 e 4)-2 ou mais dias após o choque do calor para expressão ideal repórter.

3. Preparação de dissecação e soluções

1. o dia da dissecação, preparar solução fresca de fixador em 200 tubos PCR µ l misturando 180 µ l de meio de cultura celular S2 com 20 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) para obter uma solução PFA de 2%. Manter a solução fixador no gelo antes e durante a dissecção.
   Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
   Nota: Misturar 160 µ l de meio de cultura celular S2 com 40 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) em um tubo de 200 µ l do PCR para preparar uma solução PFA 4% em vez de uma solução de 2%.
2. Usar um tubo de PCR por genótipo com um máximo de 8-10 cérebros pelo tubo para obter melhores resultados de coloração.
3. Prepara o cérebro adulto solução de lavagem: albumina de soro bovino 0,5%, 0,5% Triton X-100 em PBS.
   Nota: Dependendo da mancha, uma solução que contém 1% Triton X-100 pode ser necessários. Uma maior concentração de Triton X-100 aumenta a penetração do anticorpo nos tecidos e é necessário para as regiões de mancha que jazem profundamente dentro do tecido (por exemplo, regiões de sináptica no cérebro adulto Drosophila).
4. Preparar a solução de bloqueio: soro de cabra normal de 3%, 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em PBS.
5. o cérebro de um adulto lavar a solução e a solução de bloqueio pode ser armazenado a 4 ° C por algumas semanas.
6. Colocar a placa de vidro de poços de depressão profunda no gelo e encha cada um bem com as seguintes soluções: uma com etanol a 70%, um com PBS e outra com meio de cultura celular S2.

4. Adulto dissecação cerebral

1. posicionar um 3cm dissecando o prato no palco de um estereomicroscópio e preenchê-lo com meio de cultura celular S2 frio. Realizar todas as dissecções neste meio para garantir que o tecido permaneça saudável durante o processo de dissecação.
   Nota: Use um dissecação prato forrado com vários milímetros de silicone preto que fornece um contraste de bons antecedentes (nas imagens) e preservar a pinça durante a dissecção.
2. Anestesiar as moscas do genótipo desejado com CO ₂.
3. Com fórceps, pegue a voar pelas asas e lave-o em álcool etílico frio de 70% por 30 s, então com PBS frio para adicional de 30 s.
4. Transferir a mosca para a bem de depressão profunda que é preenchida com meio de cultura celular S2.
5. Repita o mesmo procedimento para todas as moscas com o mesmo genótipo e mantê-las em meio de cultura celular S2 frio até dissection, que vai preservar o tecido.
   Nota: Anestesiar apenas o número de moscas que pode ser dissecado em um período de cerca de 30 min. longos períodos de incubação em meio de cultura celular S2 pode danificar o tecido.
6. Pegar mosca com fórceps e, sob um estereomicroscópio, submergir a voar em meio de cultura celular S2.
7. Separar a cabeça do resto do corpo. Descartar o corpo e manter a cabeça submergida em meio de cultura celular de S2. É extremamente importante manter a cabeça com fórceps para toda a duração da dissecação. Se a cabeça começa a flutuar, será difícil para recuperá-lo sem danificar o tecido.
8. Começar a dissecação por arrancar um olho, enquanto segura a cabeça pelo menos um fórceps em todos os momentos. Certifique-se de que a ponta da pinça é logo abaixo da retina para evitar danificar o tecido por baixo. Puxe para fora o outro olho e começar a remover a cutícula, até o cérebro aparece.
9. Remover todo tecido traqueal e cutícula ao redor do cérebro até o tecido parece limpo. Certifique-se de remover todo o tecido traqueal em torno do cérebro para obter melhores resultados de coloração; os tecidos agora estão prontos para ser corrigido e manchada.
10. Manter o meio de cultura de células de todos os cérebros dissecados em S2 frio antes de transferi-los para a solução PFA fim de vez a etapa de fixação.

5. Cérebro adulto de coloração

< ol>

Transferir o cérebro isolado com uma pipeta de P10 para a solução PFA em temperatura ambiente (RT). Para evitar danos aos tecidos, nunca use fórceps para transferir o cérebro após a dissecação. Executar todas as etapas em 200 µ l cadeia da polimerase em um nutator.

Para todas as etapas, antes de eliminar a velha solução com uma pipeta P200, permitir que o cérebro resolver na parte inferior do tubo. Tente remover o sobrenadante sem aspiração do tecido. Proteger o tecido da exposição à luz.

Consertar o cérebro em 200 µ l de 2% PFA em meio de cultura celular S2 por 1h ou em 4% PFA durante 30 minutos. Manter os tempos de fixação idêntico entre as amostras a fim de aumentar a reprodutibilidade.

Depois de 3 (ou mais) lava de 15 minutos cada em 200 µ l de solução, de lavagem de cérebro adulto bloquear os tecidos com 200 µ l de solução de bloqueio por 30 minutos. Tempos de incubação mais em solução de bloqueio são possíveis.

Incubar o cérebro durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem em um volume total de 200 µ l.
Nota: Os tempos de incubação podem variar dependendo do tipo de anticorpo usado. Incubação do tempo pode ser necessária.

1. Para a rotulagem dos três marcadores MCFO, incubar o cérebro com anti-HA (1: 500), anti-FLAG (epítopo DYKDDDDK) (1: 100) e os anticorpos primários de anti-V5.
Anticorpos conjugados diretamente de
2. primária poderiam ser usados em vez da combinação normal primária + secundária (ex., anti-549 V5:DyLight (1: 200)). Neste caso, tratar os anticorpos conjugados diretamente como anticorpos secundários.
   Nota: Para cada genótipo, manter um pouco de cérebro como controles para verificar a especificidade da coloração. Pular a incubação do anticorpo primário e ir diretamente para a próxima etapa.

Lavar os tecidos 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de cérebro de um adulto (passo 3.3) de solução de lavagem e incube-os com fluoróforo-conjugados/primário diretamente conjugada com anticorpos secundários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem durante a noite em 4 ° C ou para 4h no RT, em um volume total de 200 µ l
Nota: exemplos de anticorpos apropriados: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-549 V5:DyLight (1: 200) e DyLight 647 (1: 100)-conjugados anticorpos.

Lavar o cérebro 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de solução, seguida por uma lavagem final em 200 µ l de PBS durante a noite a 4 ° C ou para 1-2 h em RT de lavagem de cérebro adulto; a etapa de lavagem final em PBS remove quaisquer vestígios de Triton X-100 e é necessária para óptimos resultados de coloração. Montar o cérebro no meio de montagem com um agente antidesvanece-se em lamelas de vidro.

6. Montagem de cérebros para a imagem latente

espaçador

1. Trim uma imagem para o tamanho adequado, com uma tesoura. Para a microscopia de alta resolução, sanduíche do espaçador de espécime e imagem latente entre as lamelas de vidro dois.
   Nota: Imagem latente de espaçadores é fina (0,12 mm de espessura) adesivos espaçadores que descascam e grudar lâminas lamelas ou microscópio, permitindo a montagem de espécimes sem compressão.
2. Usando fórceps, remova o revestimento adesivo de um piso e aplicar o espaçador, o lado adesivo para baixo, sobre a superfície de uma lamela de vidro (22 x 60 mm). Aplicar 10 µ l de meio de montagem a uma lamela de vidro novo.
3. Com um P10 pipeta, transferir o cérebro de tubo de 200 µ l para a lamela, junto à gota de meio de montagem. Juntamente com os tecidos, transferir alguns PBS para manter o cérebro em solução.
4. Com um P10 pipeta, mover o cérebro da PBS para a gota de meio de montagem a tentar limitar a quantidade de PBS. Transferi as amostras em meio de montagem a lamela com o espaçador de imagem. Use bastante meios de montagem para cobrir o espécime.
5. Remover o outro revestimento adesivo do lado superior do espaçador e adicionar uma lamela de vidro em cima dos espécimes. Com a ponta de uma pinça, aplique uma ligeira pressão sobre a área adesiva para selar. A imagem montados tecidos imediatamente ou armazenar os slides a-20 ° C para posterior análise.

7. Aquisição de imagem

1. adquirir pilhas de imagens confocal de fluorescência usando um microscópio confocal com um 40 X (at = 1.2, imersão de água) objectivo ou 63 X (nd = 1,4, imersão de óleo) objectivo (tamanho do pixel = 1.024 x 1.024 no plano XY; Distância entre duas seções confocal = 0,5 µm). Ajustar o ganho do detetor e deslocamento em cada canal de forma que nenhum pixels saturados e valores zero pixel estão presente nas imagens; Isto evita a perda de informações e garante o uso da gama dinâmica plena do detector.
   Nota: Desde que a imagem em 3D é demorada, as medições podem ser automatizadas pela verificação de amostras múltiplas em paralelo em diferentes locais. Para evitar a evaporação, com o objectivo de imersão de água, usar meio de imersão de óleo especial com índice de refração n = 1,33.
2. Processar as pilhas confocal para projeções de densidade máxima, alterações na matiz de canal e ajuste de brilho e contraste usando qualquer software de análise de imagem padrão (veja a Tabela de materiais).

Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a técnica MCFO no cérebro adulto drosófila . A Figura 3 mostra um esquema do método. Três diferentemente a membrana-tag repórteres (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-bandeira e myr-smGFP-V5) sob controle UAS são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de recombinase d...

Discussion

Este protocolo descreve um método fácil e eficiente para estudar a morfologia dos diferentes tipos de células dentro de um tecido de interesse em alta resolução. Com a técnica MCFO, vários repórteres com epítopo diferente tags são usados em combinação para a rotulagem estocástico multicolor (Figura 2). Semelhante a outros métodos, como Brainbow/Flybow^15,16,17, MCFO aumenta a diversidade de rótulo at...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Banho-maria	Grant	GD100
Tubos PCR	Sarstedt	72.737.002
Fórceps	Dumont	11251-20
Prato de dissecação 30 mm x 12 mmm	Microscopia eletrônica Ciências	70543-30	Prato de dissecção de vidro
Pyrex 3 Depressão Placa de ponto de vidro	Corning	7223-34	Placas de dissecação de vidro
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	feito em casa com carvão
ExpressFive S2 meio de cultura de células	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Microscopia Eletrônica Ciências	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Soro de cabra normal	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal soro de burro	Jackson Laboratories	017-000-121
Albumina de soro bovino	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Anticorpo primário, diluição 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Anticorpo primário, diluição 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugado anticorpo, diluição 1:200
anti-coelho AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Anticorpo secundário, diluição 1:250
anti-rato DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Anticorpo secundário, diluição 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Espaçador de Vedação Segura	Grace Biolabs	Entre em contato com a
de Vidro de cobertura do microscópio 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Vidro de cobertura do microscópio 22 x 22 mm	Roth	H874
Microscópio estereoscópico, Leica MZ6	Leica
Microscópio confocal de varredura a laser LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Óleo de imersão para microscopia de fluorescência, sem halogênio
Immersol	Zeiss	W 2010	Fluido de imersão para objetivas de imersão em água, sem halogênio
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	Repórter UAS (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Imagem J)			Software de análise de imagem
Multi Time	Macro Zeiss		Software para digitalização automatizada