Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Resumo

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Resumo

Insuficiência vascular e alterações na perfusão retiniana normal estão entre os fatores principais para a patogênese de várias doenças oculares visão em risco, tais como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e, possivelmente, glaucoma. Portanto, preparações microvasculares da retina são ferramentas cruciais para estudos fisiológicos e farmacológicos delinear os mecanismos fisiopatológicos subjacentes e a concepção terapias para as doenças. Apesar da ampla utilização de modelos de rato em pesquisa oftálmica, estudos sobre a reatividade vascular da retina são escassos nesta espécie. Das principais razões para esta discrepância é os desafiante procedimentos de isolamento devido ao tamanho pequeno destes vasos sanguíneos da retina, que é ~ ≤ 30 µm de diâmetro luminal. Para contornar o problema de isolamento direto destes microvessels da retina para estudos funcionais, estabelecemos uma técnica de isolamento e preparação que permite ex vivo estudos de vasoactivity da retina do rato sob condições fisiológicas perto . Embora as preparações experimentais presentes irão se referir especificamente as arteríolas retina do rato, esta metodologia prontamente pode ser empregada para microvessels de ratos.

Introdução

Distúrbios na perfusão da retina têm sido implicados na patogênese de várias doenças oculares, como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e glaucoma^1,2,3. Assim, estudos que visam medir a reatividade vascular na retina são importantes para compreender a fisiopatologia dessas doenças, e desenvolver novo tratamento se aproxima.

Devido à possibilidade de manipulação genética no genoma murino, o mouse tornou-se um modelo animal utilizado para estudos do sistema cardiovascular⁴. No entanto, por causa do pequeno tamanho dos vasos sanguíneos da retina (≤ 30 µm), medição de reatividade vascular na retina do rato é um desafio. Por exemplo, stereomicroscopic técnicas para a medição na vivo são limitadas em sua resolução óptica e, portanto, só permitem exatamente detectar alterações no fluxo de diâmetro ou sangue no sangue pequeno de menos de 30 µm de diâmetro ≤ quando equipado com dispositivos adicionais de sofisticados, tais como um microscópio confocal usando corantes fluorescentes ou a óptica adaptativa digitalização luz oftalmoscópio^5,6. Além disso, a interpretação das medições na vivo vista identificar locais sinalização mecanismos nos vasos da retina podem ser confundidos por anestésicos, altera na pressão arterial sistêmica e a influência dos vasos sanguíneos de retrobulbar.

Portanto, nós desenvolvemos um método para medir respostas de rato dos vasos sanguíneos da retina com alta resolução óptica ex vivo. A técnica apresentada neste documento permite visualização das arteríolas retina através de transmitidas microscopia de luz. Esse método, que também pode ser usado em ratos, fornece acesso às vantagens do gene segmentação tecnologia na investigação vascular ocular.

Protocolo

Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Animal conta Comissão de Renânia-Palatinado, Alemanha. Cuidados com animais em conformidade com as orientações institucionais e a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa. Animais foram tratados de acordo com a directiva da União Europeia 2010/63/UE para experiências em animais. Masculinos camundongos C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Porto da barra, ME, EUA), com 3-4 meses de idade foram utilizados para os experimentos. Os animais estavam alojados em condições normais (temperatura de 23 ± 2 ° C, umidade gama 55 ± 10% e 12 h ciclos de claro/escuro) e tinham acesso ao mouse padrão chow e água ad libitum.

1. isolamento da Retina do rato

1. Coloque os instrumentos de dissecção na mesa de preparação e verificar se todos os instrumentos são completos para permitir uma rápida preparação.
2. Sacrifica o mouse por inalação de CO₂ .
3. Decapitar o mouse com uma tesoura de aço, corte sagitally o crânio em duas metades, usando o mesmo par de tesouras e retire a pele e o cérebro usando tesouras de olho (Figura 1).
4. Corte o osso do crânio para deixar somente o osso orbital usando tesouras de olho.
5. Transferi a órbita em um prato de dissecação com gelada tampão Krebs-Henseleit.
6. Mantenha o prato de dissecação no gelo ou altere o buffer de cada 10 min.
7. Corte o osso orbital usando tesouras de olho e remova cuidadosamente o globo de olho, juntamente com o tecido orbital usando pinças de precisão 4 tipo e estudante Vannas para primavera (Figura 2).
8. Remova cuidadosamente a glândula Harderian, tecido conjuntivo e os músculos extraoculares usando pinças de precisão 5 tipo e Vannas para Capsulotomia, tomando cuidado para não danificar o principal ramo da artéria oftálmica.
9. Ligate orbitais ramos da artéria oftálmica e, eventualmente, a extremidade proximal do principal ramo da artéria oftálmica usando suturas de Nylon 10-0 (Figura 3).
10. Transferi o globo de olho em uma placa de Petri contendo etanol a 70% para 10 s usando tipo 4 pinças de precisão. Coloque o prato de dissecação do globo do olho e substituir o buffer com solução de Krebs fresca. A córnea aparecerá esbranquiçada após exposição ao etanol.
11. Perfurar a córnea periférica com uma agulha de 30 calibre e dissecar a córnea usando Vannas para Capsulotomia. Cortar o tecido da íris suavemente, coloque uma ponta afiada das Vannas para Capsulotomia entre a coroide e retina e cortou a coroide e a esclera. Deixe algum tecido scleral em torno do nervo óptico (Figura 4).

2. montagem da Retina na câmara de perfusão

Nota: A câmara de perfusão utilizada para experimentos de arteríola retinal é feito em casa. Consiste em um reservatório transparente com um tubo dentro e vazão (Figura 5). Uma extremidade de um tubo de silicone está colada ao fundo da câmara com adesivo de histoacryl e a outra extremidade anexado a uma torneira de três vias. Conecte uma seringa com solução tampão de Krebs fresco para a torneira de três vias e preencher o tubo com buffer.

1. Leve uma micropipeta de vidro com um porta-agulha e empurre-a para a extremidade do tubo na parte inferior da câmara de perfusão. Então quebre a ponta da micropipeta com tesouras tipo 4 para obter uma gorjeta de 100 µm de diâmetro.
2. Concentre-se na ponta da micropipeta a e eliminá-la através da seringa conectada ao tubo. Cuide-se que o capilar não é obstruído por detritos. Em caso de oclusão, removê-lo, lave o tubo e inserir mais uma micropipeta.
3. Encha a câmara de perfusão com frio tampão Krebs e colocar a câmara sob um microscópio estéreo.
4. Coloque uma plataforma de plástico transparente para a câmara de perfusão. Esta plataforma tem um recuo de 1,8 mm de largura para o nervo óptico e artéria oftálmica e é colocada em dois fios de aço de diâmetro de 1,6 mm. Em seguida, coloque um anel de aço inoxidável de diâmetro 2,8 mm e 4,0 mm diâmetro externo para a plataforma.
5. Transferi a retina com o nervo óptico e artéria oftálmica anexada da câmara de dissecação na câmara de perfusão com extremo cuidado, usando uma colher. Este passo é importante para evitar a potencial alongamento dos tecidos, como pode ser prejudicial para o experimento.
6. Cortar a parte suturada da extremidade proximal da artéria oftálmica, coloque duas alças pré-formadas de sutura de nylon 10-0 para a micropipeta e Canule a artéria oftálmica com a micropipeta. Amarrar a artéria para a micropipeta (Figura 6) e coloque a retina para a plataforma transparente usando pinças-multa-ponto.
7. Delicadamente te abrir a capsula de lente anterior com duas pinças de ponta fina, retire a lente e cortar a capsula de lente inteira usando micro-tesouras.
8. Posteriormente, fazer quatro incisões radiais na retina metade a distância entre a pars plana para o nervo óptico e coloque um anel de aço inoxidável na retina para corrigi-lo para o fundo. A retina está agora pronta para o experimento (Figura 7).

3. preparação de arteríolas da retina para o experimento

1. Coloque a câmara de perfusão sob um microscópio de luz. O objetivo é uma lente de objetiva de imersão de água X 100.
2. Conectar as duas tubulações para em - e out - flow para uma bomba pericíclica e circulam na câmara com tampão Krebs oxigenado com 95% O₂ e carbonatadas com 5% CO₂ a 37 ° C. Use uma taxa de fluxo entre 100 e 120 mL/min.
3. Conecte o tubo de silicone, que é conectado com a micropipeta, um reservatório do silicone mangueira através de uma torneira de três vias. Em seguida, encher o reservatório com tampão Krebs para uma altura correspondente a 50 mm Hg, mas não abra a torneira de três vias ainda.
4. Olhe através dos objectivos do microscópio e foco na superfície da retina. Busca de vasos sanguíneos ou células vermelhas do sangue. É possível que os vasos sanguíneos são completamente recolhidos, às vezes apenas que algumas células vermelhas do sangue são visíveis.
5. Quando um vaso sanguíneo encontra-se, concentre-se nele e abra a torneira de três vias. O diâmetro do vaso deve aumentar imediatamente e os glóbulos vermelhos também mover centrifugamente, se for uma arteríola, ou centripetamente em caso de uma Vénula. As arteríolas são menores em diâmetro, em comparação com vênulas da mesma ordem.
6. Uma vez que encontra-se um vaso sanguíneo com uma parede bem visível, pode ser empregado para experiências após um período de equilíbrio de 30 min (Figura 8). Durante o período de equilíbrio, as arteríolas desenvolvem apenas fraco tom intrínseco, resultando em menos de 10% de redução de diâmetro luminal.

4. realizando o experimento

1. Teste a viabilidade dos navios com o tromboxano mimética 9,11-dideoxy-9, 11α-methanoepoxy prostaglandina F_2α (U46619), adicionando-o para a solução de banho. Este agente contrai as arteríolas retina do rato por cerca de 50% do diâmetro de repouso em concentrações ≥ 10^-6 M.
2. Uma vez que o navio está confirmado viável, lave o agonista fora da banheira pela bomba de circulação e fornecer fresco tampão Krebs para o banho.

Resultados

U-46619 produziu respostas vasoconstritor dependente da concentração em arteríolas da retina de ratos do selvagem-tipo do fundo C57Bl/6J. Em uma concentração de 10^-6 M, diminuição do diâmetro luminal foi ≈50% do diâmetro de descanso. Figura 9A mostra uma curva concentração-resposta representativa de uma arteríola retinal. Em arteríolas preconstricted com U46619, cumulativa administração de acetilcolina evocados dependente da concentração aumenta no...

Discussão

A medição das respostas vasculares na retina do rato é um desafio devido ao pequeno tamanho de vasos da retina. Com a técnica apresentada, arteríolas retina são visualizadas por microscopia de luz transmitida. Isso é possível, porque a retina isolada é translúcida. A vantagem da técnica é a alta resolução óptica. A resolução espacial calculada é 11 px/µm. No entanto, a resolução real para este sistema óptico que utiliza a luz branca é entre 200 e 300 nm, que é explicado pelo limite de difração de Abbe. Desde o primeiro r...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tesoura de aço	Carl Roth GmbH	3576.1	1x 140 mm
Tesoura de olho	Geuder	G-19390	1x reta, 10,5 cm
Pinça de precisão, reta com pontas finas	Carl Roth GmbH	LH68.1	2x tipo 4
Pinça de precisão, reta com pontas extra finas	Carl Roth GmbH	LH53.1	2x tipo 5
Tesoura de capsulotomia Vannas	Geuder	19760	1x reta, 77 mm
Tesoura de mola Student Vannas	Ferramentas de ciência fina	91501-09	1x curvado,
Barraquer porta-agulha	Geuder	G-17500	1x curvado, agulha de 120 mm
	Becton, Dickinson and Company	305128	1x 30 G
capilares de vidro (para produção de micropipetas)	Drummond Scientific Company	9-000-1211	1x (1,2 x 0,8 mm; diâmetro externo/interno)
Sutura de nylon	Alcon	198001	1x 10-0
Placa de cultura de células Nunclon	Thermo Fisher Scientific	153066	1x 35 mm de diâmetro
Placa de cultura de células Nunclon	Thermo Fisher Scientific	172931	1x 100 mm de diâmetro
Discofix C	Braun	16500C	10 cm
Histoacryl adesivo	B. Braun Surgical, S.A.	1050052
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
Bomba pericíclica  (CICLO II)	Carl Roth GmbH	EP76.1	1x
Extrator de pipeta vertical Modelo 700C	David Kopf Instruments		1x
Microscópio (Vanox-T AH-2)	Olympus		1x
Objetiva de imersão em água LUMPlanFL, 1.0 NA	Olympus		1x
Câmera digital (TK-C1381)	JVC		1x
Câmara de perfusão	de fabricação		1x
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Drugs and Solutions
Etanol	Carl Roth GmbH	K928.4
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2)	Carl Roth GmbH	5239.1
Cloreto de cálcio (KCl)	Carl Roth GmbH	6781.1
Dihidrogenofosfato de cálcio (KH2PO4)	Carl Roth GmbH	3904.2
Sulfato de magnésio (MgSO4)	Carl Roth GmbH	261.2
Cloreto de sódio (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265.2
Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)	Carl Roth GmbH	0965.3
α-(D)-(+)- Glicose mono-hidratada	Carl Roth GmbH	6780.1
9,11-dideoxi-9&alfa;,11&alfa;-metanoepoxi prostaglandina F2&alfa; (U-46619)	Cayman Chemical	16450
Cloreto de acetilcolina	Sigma-Aldrich	A6625-25G

própria