Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Xiangduo Kong; Gladys M.S. Cruz; Bárbara A. Silva; Nicole M. Wakida; Nima Khatibzadeh; Michael W. Berns; Kyoko Yokomori

doi:10.3791/56213

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Artigo de método

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

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DOI:

10.3791/56213

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31 de janeiro de 2018

Xiangduo Kong^*¹ , Gladys M.S. Cruz^*² , Bárbara A. Silva² , Nicole M. Wakida² , Nima Khatibzadeh² , Michael W. Berns²^,³^,⁴ , Kyoko Yokomori¹

¹Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, ²Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, ³Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Resumo

Danos ao DNA induz respostas específicas de sinalização e reparação na célula, que é crítico para a proteção da integridade do genoma. Microirradiation do laser tornou-se uma valiosa ferramenta experimental para investigar o DNA danos resposta (DDR) na vivo. Permite análise de célula única de alta resolução em tempo real da dinâmica macromolecular em resposta ao dano induzida por laser, confinado a uma região de submicrometer no núcleo celular. No entanto, várias condições do laser têm sido utilizadas sem apreciação das diferenças nos tipos de danos induzidos. Como resultado, a natureza do dano é muitas vezes não bem caracterizado ou controlada, causando inconsistências aparentes nos perfis de recrutamento ou modificação. Temos demonstrado que as condições de irradiação diferentes (ou seja, diferentes comprimentos de onda bem como diferentes poderes de entrada (radiâncias) do laser femtosecond (fs) infravermelho próximo (NIR)) induziram assemblies distintos DDR e reparação de proteína. Isto reflete o tipo de dano do ADN produzido. Este protocolo descreve como titulação da potência do laser permite a indução de diferentes quantidades e complexidades de dano do ADN, que pode ser facilmente controlado por detecção de danos de base e reticulação, diferencial poli (ADP-ribose) (PAR), sinalização, e reparação de percurso específico fator módulos (assemblies) em locais de dano. Uma vez que as condições de danos são determinadas, é possível investigar os efeitos de dano diferente complexidade e sinalização diferencial danos, bem como depleção do feitor montante em qualquer fator de interesse.

Introdução

Na Vivo Sinalização de dano do ADN não é bem compreendido.
In vivo, o DNA é complexed com histonas e outros fatores para fibras de cromatina de forma. Regulamento da estrutura da cromatina é de suma importância para o metabolismo do DNA. Por exemplo, a variante de histona H2AX é fosforilada por ataxia-telangiectasia mutado (ATM) e outras cinases seguintes da dobro-Costa quebra indução (DSB) e é importante para a amplificação de sinal DSB danos, bem como fornecendo um site encaixe para outro fatores. Propagação de escolha de caminho de sinalização e reparação de danos aparecem criticamente ser influenciada pela estrutura da cromati....