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Artigo de método

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

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DOI:

10.3791/56213

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31 de janeiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Resumo

Danos ao DNA induz respostas específicas de sinalização e reparação na célula, que é crítico para a proteção da integridade do genoma. Microirradiation do laser tornou-se uma valiosa ferramenta experimental para investigar o DNA danos resposta (DDR) na vivo. Permite análise de célula única de alta resolução em tempo real da dinâmica macromolecular em resposta ao dano induzida por laser, confinado a uma região de submicrometer no núcleo celular. No entanto, várias condições do laser têm sido utilizadas sem apreciação das diferenças nos tipos de danos induzidos. Como resultado, a natureza do dano é muitas vezes não bem caracterizado ou controlada, causando inconsistências aparentes nos perfis de recrutamento ou modificação. Temos demonstrado que as condições de irradiação diferentes (ou seja, diferentes comprimentos de onda bem como diferentes poderes de entrada (radiâncias) do laser femtosecond (fs) infravermelho próximo (NIR)) induziram assemblies distintos DDR e reparação de proteína. Isto reflete o tipo de dano do ADN produzido. Este protocolo descreve como titulação da potência do laser permite a indução de diferentes quantidades e complexidades de dano do ADN, que pode ser facilmente controlado por detecção de danos de base e reticulação, diferencial poli (ADP-ribose) (PAR), sinalização, e reparação de percurso específico fator módulos (assemblies) em locais de dano. Uma vez que as condições de danos são determinadas, é possível investigar os efeitos de dano diferente complexidade e sinalização diferencial danos, bem como depleção do feitor montante em qualquer fator de interesse.

Introdução

Na Vivo Sinalização de dano do ADN não é bem compreendido.
In vivo, o DNA é complexed com histonas e outros fatores para fibras de cromatina de forma. Regulamento da estrutura da cromatina é de suma importância para o metabolismo do DNA. Por exemplo, a variante de histona H2AX é fosforilada por ataxia-telangiectasia mutado (ATM) e outras cinases seguintes da dobro-Costa quebra indução (DSB) e é importante para a amplificação de sinal DSB danos, bem como fornecendo um site encaixe para outro fatores. Propagação de escolha de caminho de sinalização e reparação de danos aparecem criticamente ser influenciada pela estrutura da cromatina local em danos locais1. Um número de cromatina remodelação fatores acompanhantes de histona e histona modificando as enzimas na verdade são recrutados para danificar sites e são importante para o reparo de DNA eficiente, destacando a importância do Regulamento de cromatina no DDR e reparar2 , 3 , 4. Além disso, site de danos de cluster ou reposicionamento foi observada em levedura e drosófila5,6,7,8, uma reminiscência do relocalization dos loci de gene na compartimento de fracoes associado gene Regulamento9,10. Estudos recentes no rato e células humanas também revelaram a mobilização dos sites DSB, que influências reparar fidelidade e caminho escolha11,12. Isto levanta a possibilidade que DDR/reparação pode também ser intimamente ligada à arquitetura nuclear, organização de ordem superior da cromatina e cromossomo dinâmica no núcleo celular. Assim, é fundamental para desenvolver métodos de alta resolução para estudar DDR e processos no contexto do ambiente endógeno nuclear em uma célula viva de reparação a fim de compreender as consequências de curto e longo prazo de dano do ADN.

Papel crítico de PAR polimerase (PARP) para medir a extensão e o tipo de dano e regulamenta o Assembly de proteína no local do dano
PARP1 é um sensor de ADN nick rapidamente ativado por dano do ADN que desempenha um papel crítico no reparo de ADN13. PARP1 foi pensado originalmente para funcionar em conjunto com o x-ray reparação Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar o reparo de excisão de base (BER), mas estudos recentes revelam seu papel em outras vias de reparo do DNA, incluindo ORL reparação14. Ativado PARP1 usos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como um substrato para ADP-ribosylate várias proteínas alvo, incluindo ele mesmo. Esta enzima e outros membros da família têm atraído muita atenção nos últimos anos como inibidores da PARP surgiram drogas terapêuticas tão promissoras para cancros. Embora inibidores da PARP inicialmente foram encontrados para ser eficaz no gene do cancro da mama (BRCA)-uma mutação de células de câncer de mama, existe agora uma pletora de evidências para seus efeitos em terapias de combinação e mono - juntamente com DNA prejudicial agentes/irradiação contra um amplo espectro de cancros com mutações, que não se limitando a BRCA15,16,17,18,19,20.

A nível molecular, ativação de PARP mostrou desempenham um papel crítico na organização da estrutura da cromatina local em sites de danos. Recrutamento de PAR-dependente de enzimas de modificação de cromatina facilita a reparação de ORL e ditames reparar escolhas de caminho, sugerindo o papel de andaimes importantes de modificação do PAR em locais de dano. 13,21,22,23,24,25,26,,27,28,29, 30,31 recentemente Demonstramos a exclusão da proteína p53-1 (53BP1) de dano sites por PAR 32, fornecendo uma explicação alternativa para dependentes de 53BP1 hyperactivation de endjoining não-homóloga ( NHEJ) por PARP inibidor e destacando a importância do PARP em ORL reparação via escolha33,34. PARP1 também diretamente PARylates e afeta a atividade da DNA vários reparos fatores14.

Usando o Laser Microirradiation como uma ferramenta para estudar a DDR/reparação na Vivo
Microirradiation do laser para produzir alterações sub mícron em cromossomos individuais foi primeiro descrita em 196935 e revisado em detalhes em 198136. Várias décadas mais tarde, microirradiation do laser foi mostrado para induzir dano de DNA em uma região submicrometer definido no núcleo celular e foi provado para ser uma técnica valiosa para o estudo de recrutamento ou modificações de vários fatores de lesões do ADN em vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite a detecção desses factores que não formam distintos focos induzida por irradiação (IRIF) em danos sites39,42. Também é possível examinar a spatiotemporal dinâmica de alterações estruturais da cromatina em sítios de dano e no resto do núcleo. Comparamos com cuidado os DDRs induzidas por sistemas diferentes de laser e poderes para avaliar a relação entre o tipo de dano do ADN e o microirradiation condições32,,43,44, de entrada 45. Os padrões de recrutamento aberrante de 53BP1 e oligospermia repetir fator obrigatório 2 (TRF2) foram observados nos estudos anteriores de dano do laser, que forneceram a base para a recorrente preocupação com a natureza "não-fisiológica" de dano induzido por laser46 ,,47,,48,49. Nós achamos que estas aparentes discrepâncias agora poderiam ser explicadas pelo diferencial PARP sinalizando que mede a quantidade e a complexidade do dano induzido32. Nós confirmamos que: 1) do laser-microirradiated células (mesmo após irradiação de entrada-potência alta) são presos em interfase, de uma forma de controle-dependente de ponto de verificação de danos e permanecem viáveis (pelo menos até 48 h)32,,50; e 2) reparação fator recrutamento/modificações fielmente recapitular aqueles observados com tratamento com agentes prejudiciais de DNA convencionais e indução de ORL por endonucleases32,39,42, 44,50,,51,52. Estes resultados suportam fortemente a relevância fisiológica de estudar a resposta celular induzida por danos de laser.

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Protocolo

1. preparação da pilha básicos

Nota: Este passo é para a deteção de imunofluorescência padrão de recrutamento da proteína endógena ou modificação e para o uso de uma linha de celular estàvel expressar uma proteína recombinante fluorescente etiquetada. Por exemplo, células epiteliais de marsupial rim de Potorustridactylus (PtK2) expressando estàvel EGFP-53BP11220-1711 ou YFP-TRF2 foram usados na nossa anterior estudam (Figura 1)32. No primeiro caso, o foco, formando a região de 53BP1 (ácido aminado 1220-1711), que contém o domínio oligomerização, o domínio de Tudor e o motivo de recrutamento ubiquitylation-dependente (UDR), foi fundido ao GFP reforçada (EGFP-53BP11220-1711). Esta proteína de fusão recapitula o recrutamento local de dano do longa-metragem 53BP153,54,55. Em células HeLa, fluorescente etiquetadas subunidades de cohesin (por exemplo, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52e GFP-SA2 51) devem ser estàvel expressa para assegurar eficiente incorporação do complexo e para recapitular o S/G2 ciclo celular danos específicos da fase site recrutamento do endógena cohesin51.

  1. Propagar qualquer tipo de célula aderente para um prato de cultura de tecidos de 35mm com uma lamela em grade para permitir a identificação da célula individual. Ajuste o número de células iniciais para alcançar a confluência de 60% em 36-48 h com base na taxa de proliferação da linha celular particular. Por exemplo:
    1. Para PtK2 de células epiteliais renais marsupial (tipo selvagem ou aqueles estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP):4 células em 2 mL de placa 2.0 x 10 Advanced mínimo essencial médio (MEM) suplementado com 2 mM L-glutamina, 4% fetal bovino soro (FBS) e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL) e incubar a 37 ° C, com 7% de CO2.
    2. Para HeLa, células com estàvel expressando fluorescente etiquetado proteínas recombinantes GFP-SA2: semente 1.0 x 105 células em 2 mL médio (DMEM modificado águia de Dulbecco) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL, e incubar a 37 ° C com 5% de CO2. Outras células HeLa também podem ser utilizadas inclusive nas células não modificadas ou expressando GFP-hSMC1.
  2. Permitir que as células para aderir e proliferar para 36-48 h antes da indução de dano do ADN na confluência de 30-60% (para permitir a visualização do número grade). Prossiga para a secção 4.

2. transiente Transfection

Nota: Às vezes boas anticorpos não estão disponíveis para detectar as proteínas endógenas. Se linha celular estàvel expressam proteínas marcador não estiverem disponível, realize transfections transitórias para monitorar proteínas fluorescente etiquetadas para análise de células vivas.

  1. Para as células HeLa, no dia 1, sementes de 6-8 x 104 células em meios de cultura 0,5 mL em um poço de uma placa de 24 e incubar um 100% umidificado incubadora a 37 ° C e com 5% de CO2. Consulte a etapa 1.1 para condições de meios de cultura.
  2. Dia 2, uso um plasmídeo de expressão mamíferos codificação um DNA fluorescente etiquetado reparar fator (por exemplo, GFP-NTH1 ou GFP-OGG1 para dano base32,44,56, GFP-Ku para alta dose DSBs57, GFP-53BP1 32 DSBs relativamente simples, ou outras proteínas de interesse fundido a tag fluorescente) para executar a transfeccao de DNA mediada por lipossomas. Dilua 0,3 µ g plasmídeo em 25 µ l de soro livre de meios de cultura em um tubo de 1,5 mL.
  3. Em outro tubo de 1,5 mL, diluir 1 µ l com base em lipossomas DNA reagente de transfeccao em 25 µ l de soro livre de meios de cultura e misture delicadamente.
  4. Misture o agente diluído de DNA e transfecção suavemente e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT) para formar complexos lipídios-DNA.
  5. Enxágue as células com 0,5 mL de meio de cultura, uma vez, remova a mídia e adicionar 0,5 mL meio de cultura fresco para as células (etapa 1.1).
  6. Adicione os complexos lipídios-DNA para as células. Misture suavemente agite a placa algumas vezes. Colocar as células de volta na incubadora como no passo 2.1.
  7. Após 4-6 h, remova a mídia de cultura de células e adicionar 300 µ l 0,05% Trypsin-EDTA. Removê-lo, adicionar 200 µ l do Trypsin-EDTA e incubar a incubadora de 37 ° C por 3-4 min.
  8. Após a confirmação de que as células são desanexadas, adicionar 800 µ l cultura mídia e ressuspender as células pipetando suavemente para separar as touceiras de célula. Transferir a suspensão de células para um prato de cultura de 35mm com uma lamela quadriculado e adicionar meios de cultura até um volume final de 2ml.
  9. Incubar as células na incubadora como no passo 2.1 por 48 h e, em seguida, prossiga para a secção 4.
    Nota: Se a expressão da proteína recombinante é tóxica (células transfectadas mostram morfologia redonda ou irregular após incubação na etapa 2.8), encurtar o tempo de expressão e executar do laser microirradiation (secção 4) 16-20 h após a transfeccao contanto que o expressão da proteína pode ser confirmado (para a deteção de fluorescência, consulte a etapa 4.3). Neste caso, realize a transfeccao diretamente no prato 35 mm. Semente de 3,0 x 105 HeLa células em um prato de 35mm com uma lamela em grade para atingir aproximadamente 50-70% confluência após plasmídeos de DNA Transfect 30 h. e alterar a mídia 2-6 h depois do transfection. Proceder com laser microirradiation 12-20 h mais tarde, se a expressão da proteína é razoável e células aparecem saudáveis.

3. o ciclo celular de sincronização

Nota: Para o reparo para recombination homologous proteínas (HR), tais como a Rad51 e cohesin, o recrutamento é mais proeminente em fase S/G2 do ciclo celular, na qual HR reparação assume lugar51. Assim, para monitorar o recrutamento destas proteínas, sincronização de célula para a fase S/G2 é necessária.

  1. Sincronização de fase S/G2
    1. Use o protocolo de bloco de timidina duplo para sincronização de célula para S/G2 fase50,51. Após a semeadura as células em um prato de lamela quadriculada de 35mm (consulte a etapa 1.1), Incube as celulas com timidina (para obter uma concentração final de 2,5 mM) em meios de cultura (etapa 1.1) para 17 h a 37 ° C e com 5% de CO2.
    2. Enxagúe as células com 1 mL meio de cultura livre de timidina (etapa 1.1) duas vezes e incube as celulas em meios de cultura 2ml timidina-livre para 9 h como no passo 1.1.
    3. Adicione 200 µ l de solução-mãe de timidina 27,5 milímetros (dissolvida em meios de cultura) para os meios de cultura com as células para uma concentração final de timidina 2,5 mM. Incube as celulas como na etapa 3.1.1 para outro 15 h. enxaguar e incube as celulas em meios de cultura livre de timidina por 4-6 h e induzir a danos no DNA (secção 4).
    4. Confirmar a eficiência de sincronização usando marcadores do ciclo celular (Cyclin A2 e B1 para S/G2 e G2, respectivamente), S/G2 fase DNA danos reparação fatores específicos (por exemplo, Rad51 ou cohesin), ou por IdU/EdU incorporação (para células em fase S)51.
  2. Sincronização de fase G1
    1. Sementes de 6-8 x 104 células de HeLa em um prato de cultura de 35 milímetros com lamela quadriculado (passo 2.1).
    2. Depois de 2 dias, identifica células em metafase, que são ligeiramente levantada e redondas, sob um microscópio invertido usando o objectivo de X 10 e 10 X ocular as lentes. Adquira imagens para gravar a posição das células em metafase na lamela em grade.
    3. Após 3-4 h, confirmar a divisão da célula em duas células filhas (na fase G1) e induzir a danos no DNA (secção 4).

4. titulação de Laser de potência de entrada

Nota: No presente protocolo, podemos induzir dano de DNA usando um 780 nm pulsado sistema de laser NIR fs anexado a um microscópio confocal, ou 800 nm pulsado laser NIR de fs acoplado a um microscópio de fluorescência-epi invertido. Embora a potência de entrada (irradiância efectiva no ponto focal do laser na amostra) necessária para induzir DDR comparável é diferente nestes sistemas, o princípio básico da titulação de potência de entrada é aplicável a ambos, ou nenhum, NIR sistemas32,57 . A energia em situ por irradiação de pulso e pico do laser no ponto focal para os sistemas duas laser estavam no intervalo de 5.33 × 10-2-4 × 10-1 nJ e 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivamente,32.

  1. Ligue o laser NIR e permitir que o sistema de laser para aquecimento por 1h antes da utilização.
  2. Coloque um prato de células num palco aquecida (37 ° C) em uma câmara que permite CO2 (5%) e controle de umidade (100%).
    Nota: Se uma câmara de2 CO não estiver disponível, use CO2-meios de cultura independente para até 5-6 h. Se não houver uma fase de aquecimento, manter as células sob o microscópio para < 20 min e substitua imediatamente para a incubadora de cultura de tecidos com controle de umidade, temperatura adequada e CO2. Estas condições de cultura podem variar dependendo do tipo de célula específica utilizado bem como o organismo de derivação (por exemplo, mamíferos e anfíbios).
  3. Para análise de células vivas de proteínas fluorescente etiquetadas, selecione um filtro GFP (450-490 nm de excitação, emissão de 515-586 nm) ou Cy3 (540-552 nm de excitação, emissão de > 590 nm) para GFP ou proteína mCherry-fundido, respectivamente, usando uma 100 X ou imersão de óleo X 63 objetivo.
  4. Busca de células que possuem sinais de fluorescência comparáveis, refletindo a níveis comparáveis de expressão da proteína. Evite as células com expressão demasiado forte ou demasiado fraca para reduzir a variabilidade de célula para célula em medidas de fluorescência.
  5. Titula-se a potência de entrada do laser.
    1. 780 nm NIR do laser anexado a um microscópio confocal
      1. Use a função de lixívia de software para atingir faixas lineares dentro do núcleo celular para a exposição de varreduras de laser único (resolução 512 x 512 pixels, zoom X1, descorado região 4 x 50 pixels, tempo de permanência de pixel de 12,8 µs, iteração x1) com o objectivo de óleo (100 X / 1,3 at).
      2. Ajuste a porcentagem de transmissão do laser (usando o software/hardware embutido no sistema de microscópio a laser pelo fabricante) a 5% sem alterar outras configurações.
      3. Coloque um celular no centro do campo. Clique em região de ferramenta de interesse (ROI) e desenhar uma linha ou caixa (aproximadamente 50 x 4 pixels) no núcleo usando o mouse e clique no botão de "Bleach" para induzir dano do ADN.
        Observação: Em etapas subsequentes de irradiação, "branqueamento" deve ser aumentado em incrementos de 5% a 40% ou até 100%, se necessário.
      4. laser NIR 800 nm anexado ao microscópio de fluorescência-epi
      5. Controlar a entrada de alimentação através de um (63 X / 1.4 at) objectivo de imersão de óleo de contraste de fase por rotação motorizada de um filtro de polarização introduzido no caminho do feixe e montado em um palco de rotacional motorizado controlado por computador32,39 , 58.
      6. Ajustar o ângulo do polarizador (°) e medir a potência de entrada (mW) inserindo o microscópio, usando um medidor de energia do laser. Determine os ângulos de polarizador que fornecem poderes de entrada que variam de 20 mW-155 mW em incrementos de 5-10 mW.
      7. Defina o ângulo de polarizador que corresponde a 20 mW de potência de entrada.
        Nota: Para o nosso sistema de laser, se o ângulo de polarizador é 40 °, o poder de entrada é 65 mW. Aumente a potência de entrada, com incrementos de 5-10 mW.
  6. Para análise de células vivas, vá para as etapas 6.1 e 6.3. Para a deteção de imunofluorescência das proteínas endógenas ou modificações proceda à seção 5. Após a análise, vá para a etapa 4.7 para titulação mais do poder do laser. Para analisar o requisito de fator upstream, ir para a seção 7.
    Nota: Recrutamento de fatores BER e NHEJ é rápida (dentro de alguns minutos) e transiente (< ~ h 30 min - 1 dependendo do fator e < ~ 4 h post danificar indução, respectivamente). Em contraste, o recrutamento dos fatores HR Rad51 e cohesin é detectável em ~ 30 min - 1 h e tendem a persistir mais de 8 h em DNA não reparados lesões44,50,51. Assim, é necessário examinar pontos pós irradiação para reparação de diferentes fatores de tempo diferente.
  7. Aumentar a potência de entrada por incrementos desejados (ou seja, 5% para 780 laser NIR e 5-10 mW para 800 NIR) como na etapa 4.4 e repita os passos 4,5-4,7 em um novo conjunto de células para determinar o limiar (50% do recrutamento de mostrar células danificadas) e pico (100% de células show recrutamento) para cada proteína.

5. mancha da imunofluorescência

Nota: para a deteção de modificação covalente de proteínas, tais como o PAR (marcador de dano complexa) e a fosforilação de H2AX (γH2AX) (marcador DSB), bem como de dímero de pirimidina ciclobutano (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) e 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticulação e base de marcadores de dano, respectivamente), células devem ser fixadas e coradas com anticorpos específicos. Além disso, é melhor confirmar os resultados obtidos com as proteínas recombinantes fluorescente etiquetadas pela pesquisa de anticorpos das proteínas endógenas, distinguir artefatos induzidos pela superexpressão de proteínas recombinantes de fusão.

  1. Corrigir células em pontos diferentes de tempo após a indução de danos (etapa 4.5) dependendo dos fatores, substituindo os meios de cultura (consulte a etapa 1.1) com 1,5 mL de paraformaldeído 4% / 1 X PBS durante 10 minutos a RT
    Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos e todo o trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada.
  2. Remover 4% paraformaldeído/PBS e adicione 1 mL de detergente/PBS de 0,5% por 10 min no RT
  3. Remover células de detergente/PBS e enxágue de 0,5% com 2 mL de PBS durante 5 min, duas vezes e incube as células em 2 mL de solução de bloqueio (soro de vitelo de 10%, 1% BSA/PBS) por 1h no RT
  4. Remover a solução de bloqueio e adicionar 2 mL de PBS para células e substituir PBS com solução de anticorpo primário 250 µ l de 3% BSA/PBS durante a noite a 4 ° C ou 1 h no RT. Use um 1: 200-diluição 1: 500 (concentração típica de aproximadamente 1 µ g/mL, empiricamente determinada) para detecção de anticorpos específicas para diferentes marcadores de dano de DNA (por exemplo, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (ORL, NHEJ); RAD51/cohesin (ORL, HR); CPD/6-4PP (reticulação dano); 8-oxoG/DNA (por exemplo, NTH1) glycosylases (base de dano); PAR (danos complexos de alta dose)).
  5. Remover a solução de anticorpo e enxagúe com 2 mL de PBS durante 5 min duas vezes, remover PBS e incubar com 250 µ l 0,1% anticorpo secundário em 3% BSA/PBS por 1h no escuro no RT
  6. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 2 mL de PBS durante 5 min duas vezes e manter as células em 1,5-2 mL de solução Isotónica a 4 ° C para a imagem latente em etapas 6.1 e 6.2.

6. análise de fluorescência quantitativo de Immunostained ou células vivas

  1. Capturar imagens de células coradas ou ao vivo (n > 10) usando o microscópio utilizado para irradiação. Para o sistema de microscópio de fluorescência-epi, usar a resolução de 1.344 x 1.024 pixels e salvar imagens como arquivos TIFF de 16 bits. Para um microscópio confocal, use 1 ampliação de X; Laser de argônio para GFP/FITC, aqui vai 594 laser para Cy3/mCherry; 512 x 512 ou 1.024 x 1.024 pixels de resolução de imagem; 5, número de velocidade de digitalização: 1 para verificação rápida ou 2 + para uma média ao longo de várias digitalizações para melhorar o sinal à relação de ruído.
  2. Use uma análise de imagem, programas projetados para medir a intensidade do pixel.
    1. Use a ferramenta de retângulo de Volume para desenhar um ROI em torno do local do dano à imagem de célula individual. Use o mesmo tamanho ROI para medir o sinal de fluorescência de fundo no nucleoplasma adjacente, mas não se sobrepõem com os sites de danos. Isto é importante para a normalização de fotobranqueamento associado ao sistema de microscópio confocal-não.
    2. Para medir sinais de fluorescência usando o programa de análise de imagem, clique em "Relatório de análise de Volume" encontrado em caixa de ferramentas. Uma nova janela aparecerá. Sob a seção "Dados para exibição", marque somente o "Nome" e "Densidade". Clique em "Concluído" para visualizar as medições.
    3. Exporte os valores para um programa de planilha, clicando no ícone de tabela, encontrado na parte inferior da janela do relatório de Volume e selecionadas "abas (formato de excel)" para "Arquivo" e separadores de campo para exportar destino.
    4. Para obter sinais relativos, use o programa de planilha para dividir a intensidade de fluorescência no local do dano (coluna 1) por que no controle de fundo (coluna 2) na região do nucleoplasma e subtrair 1 para normalização.
  3. Análise de tempo-curso de fluorescência quantitativo em tempo real usando o microscópio confocal
    1. Identifica fluorescente etiquetadas proteína-positivo células usando o microscópio como no passo 4.3.
    2. Realize imagens de fluorescência de lapso de tempo antes de dano e nos pontos de tempo diferente após a indução de danos na secção 4. Primeiro desenhe a lixívia ROI (para indução de dano), em seguida, selecione o "Acquire > série temporal" submenu, defina "Número" como 20 e o "ciclo de atraso" como 30 s, escolher "branquear uma vez após a primeira varredura" e clique em "Iniciar B". Neste caso, a primeira imagem é adquirida imediatamente antes da indução de danos, seguida por 19 aquisições de imagem em um intervalo de 30 s. Intervalos ("atraso de ciclo") podem ser alterados dependendo da finalidade do estudo.
    3. Concluído o aquisição de imagem, clique em "Quer dizer" e desenhar o ROI na região de danos. Clique em "Show Table" para obter uma tabela que lista a intensidade dentro do ROIs selecionado. Normalizar os dados dividindo-se a intensidade da fluorescência do site da dano em pontos diferentes do tempo pela intensidade da região mesma antes de danos e subtrair por 1.

7. pequenos parasitas RNA (siRNA) Transfection

Nota: O esgotamento da proteína alvo é uma maneira eficaz de delinear a exigência do montante fator para o recrutamento de proteína observada danificar sites (secção 4). Além disso, a estratégia é a melhor maneira de abordar a especificidade de um anticorpo usado para detecção de imunofluorescência (ver secção 5).

  1. Dia 1: Preparar 2 poços de uma placa de 24 células HeLa semeando 6-8 x 104 células de HeLa em meios de cultura 0,5 mL em cada poço, um para transfeccao siRNA de controle e um para PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Dia 2: Confirme que as células são aproximadamente 40-50% de Confluencia. Realizar a primeira rodada de transfeccao siRNA: diluir 5 pmol siRNA em 25 µ l de soro livre de meios de cultura, adicionar 3 lipídios µ l baseado reagente de Transfeccao para dentro do tubo, misture delicadamente e incubar durante 5-10 min a RT
  3. Enxagúe as células com meio de cultura fresco 0,5 mL de uma vez e manter as células em meio de cultura fresco de 0,5 mL (consulte a etapa 1.1).
  4. Adicionar os complexos RNA-lipídica para as células e misture delicadamente inclinando o prato e para trás. Colocar as células de volta na incubadora como no passo 2.1.
  5. Aspirar a mistura de transfeccao e adicionar 0,5 mL meio de cultura fresco (etapa 1.1) após 6 h.
  6. Dia 3: Realize a segunda rodada de siRNA transfections (consulte a etapa 7.2). Em seguida, as sementes 60-100% das células em um prato de lamela quadriculada de 35mm conforme descrito na etapa 2.3.
  7. Dia 5: Prosseguir com laser microirradiation usando a condição de poder do laser ideal para recrutamento máximo do fator de interesse, conforme determinado pela seção 4. Normalmente, esgotamento eficiente pode ser observado em cerca de 60-90% das células HeLa.
    Nota: Como alternativa e complementar abordagem, inibidores, se disponível, pode ser usada para inibir a função do fator de interesse32,44. Para analisar o efeito da inibição da sinalização DDR, adicionar inibidor PARP 20 µM, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inibidor ou 10 µM DNA-dependente proteína quinase com inibidor da subunidade catalítica (DNA-PKcs) e inibidor de ATM 10 µM em dimetilsulfóxido (DMSO) para o pratos 1 h antes da indução de danos. Adicione DMSO apenas às células de controle.

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Resultados

Usando células PtK2 estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titulação de entrada de alimentação do laser foi realizada para determinar a condição ideal para o seu recrutamento (Figura 1)32.

Em locais de dano do laser de potência entrada alta, o agrupamento significativo de CPD (dano de reticulação normalmente gerado pelo dano de ultravioleta (UV)) bem como GFP-NTH1 DNA glycosylase que especificamente reconhece dano b...

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Discussão

As vantagens do uso do laser microirradiation para pesquisa DDR são:

1. é viável para induzir diferentes tipos e quantidades de DNA danos de quebras simples ao complexo dano do ADN, e para detectar fatores diferentes reparo no DNA danificar sites ajustando os parâmetros de irradiação do laser. Também é possível causar danos várias vezes no mesmo núcleo celular a fim de avaliar os efeitos de trans (conforme Figura 3).

2. importa...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o Dr. Akira Yasui na Universidade de Tohoku, Japão para o plasmídeo de expressão de GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi no Scripps Research Institute, La Jolla, Califórnia para o TRF2-YFP e EGFP-53BP11220-1711 plasmídeo de expressão. Este trabalho foi financiado pelo escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-04-1-0101) e o Instituto de Laser Beckman Foundation Inc. (para M.W.B), a Ford Foundation Fellowship da Academia Nacional de Ciências (para B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (para K. Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ti: Laser de femtossegundo pulsado NIR de safira Mira-900Coherent Inc.Microscópio invertido Mira 900
Objetiva Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NAZeissAPOCHROMAT Ph3 
Platina de Rotação Compacta Newport CorpPR50PP
WarnerTC-344B
Sistemade Aquecimento Ibidi 10918
Ibidi;11920
(RoHS)CampoCoerenteMaxII-TOP 
Câmera Digital CCD ORCA-R2HamamatsuC10600
LSM 510 META Microscópios de Varredura a LaserCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35mm Pratos em Grade MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 células epiteliais renaisATCCCCL 56 
Células HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
Meio Independente de CO2 Life Technologies18045-088
MEM Avançado Life Technologies12492-013suplementado com L-Glutamina, 4% de
penicilina/estreptomicinaFisher Scientific15140122
L-GlutaminaFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
Timidina   SIGMAT9250
serum free media        (Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido)Fisher Scientific11058021
Anti-Cycolbutance dímero de pirimidina (CPD) (camundongo)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (camundongo)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (coelho)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (coelho)Abcamab70163
Polímeros anti-PAR (camundongo)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (coelho)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse)Novus Biological NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Coelho)                                        (para detecção de coesina)Yokomori (KY)
Anti-Rad51 (Coelho)Santa Cruz BiotechnologySC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus BiologicalsNB100-102
8-oxiguanina Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Coelho)                                       gerado no laboratórioref 43
  Anti-hCAPG (Coelho)                                      (para detecção de condensina)gerado em laboratórioref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Transfection ReagentQiagen301705
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 linha celular estável       gerado no laboratórioref 49 
Linha celular estável GFP-NEIL2gerada em laboratórioref 54
Linha celular estável GFP-NTH1gerada em laboratórioref 32
Plasmídeo GFP-SMC1gerado em laboratório
Plasmídeo GFP-Kugerado em laboratório
Anti-MDC1 (coelho)  Novus BiologicalsNB100– 395
Anti-gH2AX (coelho)  Millipore07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) Linha celular estável PtK2gerada em Berns labref 32
TRF2-YFP PtK2 linha celular estávelgerada em Berns labref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
inibidor de PARGTrevigen4680-096-03
DNA– Inibidor de PKcs  NU7026 InibidorN1537
KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldeído MICROSCOPIA ELETRÔNICA SCIENC MS100503-916 (EA)
Quantidade Um Software de Análise 1-D Versão 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC Programa de análise de imagens
Excelprograma deplanilha
Triton X100Fisher ScientificBP151-500detergente
Dulbecco's phosphate-buffered sally (DPBS) 10X sem cálcio e magnésioFisher Scientific14200166diluir para 1X 
Controlador de Temperatura Sistema de Incubação de Gás Medidor de Energia e Potência a Laser FBS gerado no laboratório KY KY KY KY KY KYKY de ATM Sigma microsoft

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