Artigo de método

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

DOI:

10.3791/56218

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30 de outubro de 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biochemical Genetics and Metabolism, The Rockefeller University

Neste artigo

Resumo

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Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Resumo

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Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico1. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal2. Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.

Introdução

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Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que ....

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Protocolo

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todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade Rockefeller ' s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Todos os animais estavam alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos.

1. quimiotaxia In Vitro e

  1. cultura THP-1 células 6 em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 4-(2-hidroxietil) -1- piperazineethanesulfonic ácido (ácido HEPES 25mm) (completar a mídia), mantendo a densidade entre 0,5-1,0 x 10 6 células/mL.
  2. Cultura de células em um 35 mm prato, etiqueta 3.5 x 10....

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Resultados

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Quando usar tintura de calceína-AM, inspeção visual das células confirmará a captação do rótulo (Figura 1). Leituras de fluorescentes automatizadas controlará a migração como trânsito de células na parte inferior da inserção ao longo do tempo. Estes dados mostram claramente uma indução de migração de células para o MCP-1, bem como um aumento da resposta pelo soro (Figura 2A). Dependendo da força do estímulo migratório, há um inte.......

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Discussão

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Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.

Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (tão freque.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo programa Bernard L. Schwartz para cientistas de médico na Universidade Rockefeller, fundo de desenvolvimento terapêutico de Robertson da Universidade Rockefeller, e o centro de Sackler de Biomedicina e nutrição pesquisa na Universidade de Rockefeller.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific11875-093
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
Soro Fetal BovinoATCC30-2020
Frasco de cultura de célulasCorning353136
Calcein AMThermo Fisher ScientificC1430Excitação: 485nm, Emissão: 520nm
Célula placa de culturaCorning1007
placa de 24 poçosCorning353504
Fluoroblok Inserção de FibronectinaCorningCB354597
tubo cônico de 15 mLCorning352097
Tecnologia de Sinalização CelularAlbumina de Soro Bovino9998S
Recombinante Humano MCP-1Peprotech300-04
Soro bovino adultoSigmaB9433
HBSS com cálcio e magnésio; sem fenol vermelhoThermo Fisher Scientific14025-092
Leitor de placas SpectraMax M2eMolecular Devices
Olympus IX71 microscópio de fluorescência invertidaOlympus
IsothesiaHenry Schein saúde animal11695-6776-2Anestesia com isofluorano
Filtro de células 40um nylonFalcon Corning352340
ACK lysing bufferQualidade Biológica118-156-101
CellTracker Laranja CMTMR CoranteThermo Fisher ScientificC2927Excitação: 541nm, Emissão: 565nm
CellTracker Green CMFDA DyeThermo Fisher ScientificC2925Excitação: 485nm, Emissão: 520nm
Seringa de 5mlSeringa BD309646
seringa TB de 1 mlSeringa BD309625
linha celular THP-1ATCCTIB-202
Anticorpo anti-camundongo CD3 Violeta Brilhante 421Biolegend100228Excitação: 405nm, Emissão: 421nm
Anticorpo CD19 anti-camundongo Violeta Brilhante 605Biolegend115540Excitação: 405nm, Emissão: 603nm
Placa inferior redonda de 96 poçosCorning353077
LSRIIBD BiosciencesCitômetro de fluxo
de

Referências

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  1. Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyt....

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Ensaio In VitroRastreamento In VivoCitometria de FluxoMarca o FluorescenteTransfer ncia AdotivaGradiente de QuimiocinasInje o Retro orbitalIsolamento de Ba o

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