Summary
Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.
Abstract
Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 - 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.
Introduction
Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recientemente, RNA-seq fue utilizado para caracterizar cambios de expresión génica en el tiempo durante la hipoxia 13. Aquí, se presentan los detalles experimentales y discuten.
La hipoxia puede lograrse de varias maneras, cada una produciendo un nivel diferente de O2. Aquí, la hipoxia fue establecida por continuamente que fluye ultra alta pureza N2 en frascos, que disminuye [O2] inmediatamente disuelta con reproductivos cinética 10. Es posible que algunas O2 moléculas presentes que contribuyen a la expresión génica y el metabolismo pero este entorno se considera muy cerca de anaerobios. En ausencia de O2, las células de levadura no pueden sintetizar hemo, ergosterol y ácidos grasos insaturados 4,12,14. Así, estudios previos han incluido estos metabolitos cuando levadura sin oxígeno 5,10,15. Sin embargo, muchas respuestas hipóxicas son mediadas por el agotamiento de estos metabolitos y así rellenarlos invierte en el gen hipóxico expresión respuestas 12,16. Con el fin de imitar la hipoxia natural, estos metabolitos no fueron agregados a los medios de comunicación. En el poco tiempo que las células fueron expuestas a hipoxia sin la presencia de estos metabolitos esenciales, no había ningún aumento sensible en la muerte celular (datos no mostrados) ni a estrés prolongado respuesta 13.
La respuesta también es dependiente de la cepa y su genotipo. Especialmente importantes son los alelos de los reguladores conocidos de respuestas hipóxicas 2. El fondo de la cepa de S288C es altamente deseado para que resultados pueden ser comparados con los otros estudios genómicos realizados con esta variedad. Sin embargo, S288C contiene un alelo de pérdida de la función parcial de la HAP1 gen 17, un regulador transcripcional esencial para la respuesta hipóxica. Este alelo fue reparado en S288C usando un wildtype copia de la Σ1278b cepa fondo 11.
Expresión génica es altamente dependiente sobre el medio ambiente celular. Por lo tanto, al realizar el análisis del mRNA del genoma, es importante mantener un ambiente constante mientras varía otro parámetro como tiempo, estímulo o genotipo. Para lograr resultados altamente reproducibles, considere estas tres prácticas para el estudio y sus réplicas biológicas o técnicas. En primer lugar, el mismo experimenter(s) debe realizar el estudio, desde prácticas técnicas pueden variar a través de experimentadores. En segundo lugar, del mismo lote de ingredientes debe utilizarse en los medios de crecimiento, ya que cada lote tiene una composición ligeramente diferente que puede afectar la expresión génica. En tercer lugar, para minimizar los efectos del ciclo de la célula, cada momento debe consistir en células asincrónicas en la fase de registro medio de crecimiento (1-2 x 107 células/mL).
Al caracterizar una respuesta compleja como la gene expresión respuesta a la hipoxia, un curso del tiempo es ventajoso para la determinación de la cinética de varios eventos. Puntos de tiempo específico deben ser elegidos que capturará los principales cambios de la respuesta. En este estudio, se observaron puntos de tiempo entre 0 y 4 h, porque pasados experimentos revelaron cambios generalizados en la expresión génica durante este período 13.
Para medir la expresión génica global, RNA-seq fue usado 18,19. Este método utiliza secuenciación de próxima generación para determinar la abundancia relativa de transcripción de cada gen. En comparación con el análisis de microarrays de DNA, RNA-seq exhibe una mayor sensibilidad (para detectar menos abundantes transcripciones), un mayor rango dinámico (para medir cambios veces mayor) y reproducibilidad superior (seguir con precisión la expresión génica en el tiempo). Normalmente, más celular ARN es ARN ribosómico que muchos métodos han sido desarrollados para enriquecer determinados RNA especie 20. Aquí, granos de poly-T se utilizaron para purificar las transcripciones del mRNA de la poli-que la contengan, aunque varios comercialmente - kits disponibles de agotamiento de rRNA también podrían ser eficaces en el enriquecimiento de mRNA.
Aquí, se caracterizó la respuesta de expresión del gen de S. cerevisiae a la hipoxia. Las células fueron expuestas a la hipoxia y luego muestras en ocho puntos del tiempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 y 240 min). Para confirmar la reproducibilidad e identificar estadísticamente cambió las transcripciones, se realizaron tres réplicas biológicas. ARN fue extraído por la interrupción mecánica y purificación de la columna y luego procesada para el análisis de RNA-seq. Se describe la tubería posterior secuenciación y programación scripts son siempre que permiten la replicación exacta de los análisis realizados. Específicamente, Trimmomatic 21TopHat2 22, HTseq 23, el entorno estadístico de R 24y el DESeq2 paquete 25 fueron utilizados para procesar los datos de RNA-seq y a identificar los 607 genes que cambian significativamente durante hipoxia. Análisis de componentes principales (PCA) y expresión génica de las repeticiones indican la reproducibilidad de la técnica. Clustering y heatmaps reveló cinética de expresión amplia, mientras que el análisis del gene ontology (GO) demostró que muchos procesos celulares, como respiración aeróbica, se enriquecen en el conjunto de genes regulados por el oxígeno.
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Protocol
1. inducción de hipoxia
- Un día o más antes del curso de tiempo de hipoxia: preparar la incubadora, celular filtrado sistema de vacío, tanque de gas, frascos, tapones, tubos de vidrio y tubos, como en la Tabla de materiales.
- Coloque el tanque de2 N, incubadora, sistema de aspiración y filtración en proximidad cercana, a habilitar el procesamiento rápido de las células.
- Preparar medio YPD líquido estéril (1% Extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa) mezclando los componentes en una botella de vidrio y autoclave.
- Plan de diseño de frascos en la incubadora.
Nota: El tanque de2 N, el primer frasco será una trampa de agua, el segundo matraz será el último punto de tiempo, el tercer matraz será el segundo a último momento y así sucesivamente hasta el último frasco que es una trampa de agua final. La figura 1 muestra el orden y las conexiones entre los frascos. - El día anterior el curso del tiempo, inocular una colonia de levadura en una cultura de 5 mL de líquido YPD dentro de un tubo de ensayo estéril. Específicamente, recoger una colonia completa de una placa con un palito aplicador estéril. Coloque el palo en el YPD líquido y agitar el palo hasta que la mayoría de las células en suspensión.
- Gire los tubos a 30 ° C durante la noche (~ 16 h).
Nota: Después de 16 horas, las células de tipo salvaje alcanzar saturación (~ 2 x 108 células/mL), indicado por una cultura muy nublada. Otras cepas pueden tardar más tiempo para alcanzar la saturación y prueba midiendo la concentración de células con un espectrofotómetro, tal como se indica en el paso 1.9.4. - En el día del curso del tiempo, después de 16 h de incubación, diluir la cultura saturada 1:50 por utilizando una pipeta de 5 mL a 4 ml de noche cultura en 196 mL de YPD líquido dentro de un matraz de 500 mL estéril. Crecer con agitación a ~ 200 rpm durante 4 horas a 30 ° C.
Nota: Después de 4 h, una cultura de tipo salvaje llega a una concentración de medio registro de ~ 1-2 x 107 células/mL. - Durante la 4 h de incubación, etiqueta los frascos (para las trampas de la hipoxia y el agua) y los 50 mL tubos de recogida. Si la incubadora en el paso 1.7 anterior no se utiliza para el curso del tiempo de hipoxia, encienda la otra incubadora y 30 ° C.
-
Justo antes de someter las células a la hipoxia:
- Añadir 50 mL de agua a dos de los frascos estéril de 250 mL que servirán como las trampas de agua.
- Llenar 1/3 de hielo de cubo con nitrógeno líquido y sumerja un bastidor de espuma de poliestireno para sostener tubos de centrífuga de 50 mL.
- Configurar el sistema de filtro para recolección de células. Añadir un disco de filtro estéril en la unidad inferior del sistema de filtración utilizando pinzas estériles, teniendo cuidado de tocar sólo los bordes del disco de filtro. Coloque la unidad en la unidad inferior del filtro filtro y asegure con abrazaderas el sistema. Asegurar que las unidades superior e inferior están alineadas para que haya un sello hermético y no hay fugas.
- Medir la concentración de células con un espectrofotómetro. Diluir las células por lo que puede medirse en el rango lineal del espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0,6, dependiendo del espectrofotómetro.
Nota: Una unidad de OD600 es ~ 3 x 107 células/mL, dependiendo de la morfología de la célula y espectrofotómetro. Se espera una concentración de ~ 1-2 x 107 células/mL, correspondiente a OD600 ~0.33 - 0.66. -
Obtener rápidamente la muestra de tiempo 0.
- Conecte el sistema de filtro a un vacío fuerte (~ 10 mbar) a través de tubo de vacío y una trampa de frasco de 1.000 mL. Encienda la aspiradora. Vierta la cultura (generalmente unos 20 mL) en la unidad y espere a líquido ser tirado a través del filtro (~ 10 s, dependiendo de la fuerza del vacío).
- Con cuidado retire el disco de filtro con unas pinzas limpias y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque inmediatamente el tubo de centrífuga en el estante sumergido en nitrógeno líquido. Importante, no pre-enfriar los tubos antes de insertar el filtro ya que podría explotar los tubos.
- Después de > 30 s, lugar el tubo en un congelador de-80 ° C para la posterior extracción de RNA. Después de cada filtración, limpiar y volver a montar el sistema de filtro. Enjuague el sistema tirando agua a través de 10 s sin un disco de filtro. Por último, seque el sistema con una toalla de papel.
- Diluir la cultura 4 h en frascos diferentes para los distintos puntos de tiempo, para que cada frasco alcanza registro media concentración (~ 1-2 x 107 células/mL) en el momento indicado de la hipoxia.
Nota: La tabla 1 muestra las diluciones que se utilizaron para la cepa haploide de tipo salvaje S288C HAP1+ . Es aconsejable probar cada cepa en estas condiciones de cultivo hipóxico y ajustar en consecuencia las diluciones. - Una vez que las células y los medios de comunicación se añaden a los matraces, reemplazar el papel de aluminio que cubre el frasco con un tapón que contiene dos tubos de vidrio insertados.
- Coloque los frascos en la incubadora en el diseño determinado anteriormente.
- Conecte firmemente la tubería como se muestra en la figura 1.
- Compruebe que todos los tapones se empujan firmemente en los orificios del matraz.
- A tiempo 0, abra la válvula del regulador. Luego ajuste el medidor de flujo a 3 L/min.
Nota: Burbujeo se observará en ambos frascos de agua, indicando flujo adecuado de gas. Si este no es el caso, compruebe que los tapones estén bien apretadas y tubería esté correctamente conectada. - La incubadora de cierre y ajuste la velocidad de agitación a ~ 200 rpm. Iniciar un temporizador.
- Antes de cada momento, establecer el sistema de filtración como se describe anteriormente en el paso 1.9.3.
-
En cada punto del tiempo (p. ej., 5 min, 10 min, etc.), con dos personas procesar rápidamente las celdas como sigue:
- Primera persona: Retire el matraz adecuado del soporte y sacar el tapón (con tubo de vidrio conectado).
Nota: Esto no interrumpirá el flujo de N2 a cualquiera de los frascos de cultivo restantes pero rompe temporalmente el flujo a la última trampa de agua. - Segunda persona: Pipetear 1 mL de cultivo y pipetear en una cubeta. Vuelva a conectar el tubo del frasco de cultura que está ahora en el extremo de la línea a la última trampa de agua (un tubo y una tapón voluntad eliminarse en el proceso). Entonces, medir la concentración de células en la cubeta, como se describió anteriormente en el paso 1.9.4.
- Primera persona: Vierta el resto de la cultura en el sistema de filtración de vacío y luego realizar filtrado y congelación como se describió anteriormente en el paso 1.9.5.
- Primera persona: Retire el matraz adecuado del soporte y sacar el tapón (con tubo de vidrio conectado).
- Cuando haya terminado con todos los puntos de tiempo, apague el gas N2 . Primero cerrar el regulador y esperar a que la presión liberar y luego apague el medidor de flujo. Finalmente, desmontar el sistema y limpiar todos los materiales con agua y luego con etanol al 70%.
2. extracción de RNA
- Preparar buffer RLT para purificación del ARN a columna, como se describe en la Tabla de materiales.
- Preparar una solución de trabajo de la ADNsa añadiendo 10 μl de la solución madre de DNasa a 70 μl de buffer RDD por muestra (véase Tabla de materiales).
- Retirar los tubos de 50 mL que contiene filtros y células del congelador de-80 ° C y coloque en hielo se descongele (~ 15 min). Realice los pasos siguientes con los tubos en hielo.
- Etiqueta 2 mL tubos de tapón de rosca y colocar en hielo, un tubo para cada muestra. Añadir ~0.6 mL de ácido lavado los granos en cada tubo, utilizando un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cucharada y medir las cuentas.
- Añadir 0,6 mL del tampón frío de la RLT en los tubos de 50 mL.
- Pipeta hacia arriba y hacia abajo para quitar las células de filtro y suspender en la solución. Evitar que el filtro permanezca en la solución como empapará el filtro de la solución. Quitar toda la solución absorbente en el filtro utilizando la punta de la pipeta para apretar el filtro contra la pared del tubo.
- Transferir todo el líquido del tubo de 50 mL a los tubos de tapón de rosca que contiene granos.
- Colocar los tubos de tapón de rosca en un homogeneizador de molino de grano y duración de un minuto.
Inmediatamente Coloque los tubos en hielo durante tres minutos. Otra vez, colocar los tubos en el homogenizador y duración de un minuto. - Retirar los tubos del homogeneizador y el lugar en el hielo durante 5 minutos. Las cuentas se asentarán en la parte inferior de los tubos.
- Realizar el resto de los pasos a temperatura ambiente.
- Con una pipeta, transferir solamente el lisado (~ 350 μL), evitando los granos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Microcentrífuga por 2 min a máxima velocidad y luego traslado el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Agregar 1 volumen de etanol al 70% (a base de etanol de grado biología molecular prueba 200). Mezclar por pipeteo.
- Transferencia de la solución y cualquier precipitado a una columna de RNA que se ha colocado dentro de un tubo de colección de 2 mL.
- Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través (el líquido en el tubo).
- Añadir 350 μl de tampón RW1 a la columna. Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.
- Añadir 80 μl DNasa I mezcla de incubación de la membrana de la columna (no permita que en los lados del tubo) y dejar para reposar 15 minutos.
- Añadir 350 μl de tampón RW1 a columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.
- Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar flujo a través.
- Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga por 2 min a ≥12, 000 x g.
- Cuidadosamente retire la columna y coloque en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Microcentrífuga a toda velocidad durante 1 minuto (para secar completamente la membrana).
- Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna.
- Eluir el RNA de la columna por microcentrifuging durante 1 min a ≥12, 000 x g. Al cargar las columnas en la microcentrífuga, asegúrese de que las tapas del tubo de colección se enfrentan en la dirección de la centrifugadora gira, para evitar que las tapas de interrupción.
- Añadir otro 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna, manteniendo la columna en el mismo tubo de microcentrífuga.
- Microcentrífuga durante 1 min a ≥12, 000 x g, por lo que el volumen del efluente final es 60 μL.
- Almacenar cada tubo de 1,5 mL que contiene 60 μL de RNA en el congelador de-80 ° C.
3. determinar la calidad y la concentración de RNA
- Medir la concentración de ARN y ADN en cada muestra de RNA, con un Fluorímetro, (b) ADN y RNA-específico fluorescente tintes y tubos de ensayo (c), que se enumeran en la Tabla de materiales. Siga las instrucciones de los tintes y el fluorómetro.
- Por otra parte, medir la concentración de ácidos nucleicos con un espectrofotómetro de UV a 260 nm.
Nota: Una una lectura260 de 1.0 es equivalente a ~ 40 μg/mL solo ARN. - Prueba calidad de RNA ejecutando el RNA en un analizador comercial de ácido nucleico (véase Tabla de materiales) o en un formaldehído/agarosa estándar gel 26.
4. RNA-seq análisis
- De la estirpe de RNA total, son 21 μl de 100 ng/μl de RNA en agua libre de ARNasa. Use 1 μl de este 21 μL para la concentración de RNA como el anterior. Presentar lo restantes 20 μl (2 μg) ARN total para un centro de secuenciación externa para el enriquecimiento de mRNA, preparación de la biblioteca específica de filamento (con ocho o más códigos de barras para multiplexación) y secuencia (véase Tabla de materiales). Alternativamente, localmente realizar enriquecimiento de mRNA y la preparación de la biblioteca y luego presentar la biblioteca para la secuencia.
- Piscina de ocho o más muestras de multiplexado y la secuencia en un carril de un secuenciador de última generación.
- Descargar el fichero FASTQ que contienen toda las secuencia de lecturas y lee el índice correspondiente. Descargar el archivo de texto que contiene los códigos de barras multiplex.
Nota: Las lecturas de índice pueden estar presentes en un archivo separado de FASTQ. Coloque todos estos archivos en un directorio. - Colocar el script que aquí, "fastq_pipeline.sh", en el mismo directorio. Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador.
Nota: esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, la calidad de la secuencia de comandos recorta la lee la Lee los mapas del genoma y genera un archivo delimitado por tabuladores que contiene el número de lecturas por gen por cada muestra. - Depositar los archivos FASTQ y crudos datos leer en Gene expresión Omnibus de NCBI antes publicación 27. Siga las instrucciones para "Datos de la secuencia de alto rendimiento de envío a GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- Importar los datos de cuenta leer en el ambiente estadístico de R y realizar análisis estadístico, utilizando el script de R que aquí, "time_course_script. R". Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador.
Nota: Esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, este script importa los datos leídos, normaliza la Lee, identifica genes que cambian significativamente durante el curso del tiempo, realiza análisis de PCA y grafica la expresión de genes seleccionados.
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Representative Results
El curso del tiempo de hipoxia y RNA-seq análisis fueron realizados independientemente tres veces. Para examinar la reproducibilidad de las tres repeticiones, datos de expresión genética para todos los genes se analizan mediante análisis de componentes principales (ACP). La figura 2 muestra cómo cambian las muestras durante los dos primeros componentes principales, que en conjunto representan el 58.9% de la variabilidad. Este análisis indicó que cada curso del tiempo exhibe cambios similares (como se muestra por la forma similar de cada curva). Además, las dos últimas repeticiones eran más parecidas entre sí que a la primera repetición. Esto es consistente con el hecho de que las dos últimas repeticiones fueron realizadas por la misma persona con los mismos lotes de componentes de los medios de comunicación, mientras que la primera repetición fue realizada por una persona diferente y lotes. Este hallazgo pone de relieve el hecho de que la consistencia de la técnica y productos químicos es un factor importante en la obtención de alta reproducibilidad. Por último, análisis PCA es útil en determinar si los puntos de tiempo escogido capturan los principales cambios que ocurren durante el curso del tiempo. Centrándose en una curva de replicar, hay grandes distancias entre las muestras anteriores, lo que indica grandes cambios en la expresión génica y distancias más pequeñas entre las muestras más adelante, indicando cambios más pequeños y posiblemente el extremo del interruptor de aeróbico a expresión del gen hipóxico.
A continuación, el paquete de DESeq2 en el R25 fue utilizado para identificar los genes que muestran un cambio significativo respecto a 0 (valores de p en la tabla adicional 1). De estos importantes genes, 607 cambiada más de 4 (veces cambios en la tabla adicional 1). Los patrones de expresión de estos genes fueron agrupados, por lo que genes regulados del mismo modo fueron agrupados juntas y luego muestra en un mapa de calor (figura 3). Esta figura muestra que los cambios de expresión son altamente reproducibles a través de repeticiones. También, los genes presentan cinética variable con aumentos y disminuciones en la expresión. Muchos genes exhiben un pico de aumento o disminución en 30 min, probablemente debido a un estrés transitorio respuesta 13.
Figura 4 representa la expresión de dos o y dos genes de alza se habían encontrados a O2-regulado. Los genes cambian expresión reproducible, con curvas similares entre las réplicas biológicas. El gen con la menor variabilidad entre repeticiones es DAN1, con la superposición de las curvas. El gen con más variabilidad es CYC1, tal vez porque la expresión de este gen es naturalmente variable. Esta figura también ilustra que doblar grandes cambios (hasta 1,024-fold) se ha detectado.
Identificar los procesos celulares enriquecidos el conjunto de 607 O2-genes regulados, vaya término enriquecimiento fue realizaron (tabla 2 suplementaria). Como era de esperar, muchos O2-regulada de los genes desempeñan un papel en la respiración celular, otros aspectos del metabolismo y procesos ribosomal 13.
| Muestra # | Tiempo en hipoxia | cultura de mL + mL YPD | ||
| 2 | 5 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 min | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 min | 4 mL + 16 mL | ||
Tabla 1. Diluciones de células de realizar a tiempo 0.
Estas diluciones se han determinado experimentalmente en registro de media concentración (1-2 × 107 células/mL) después de la hora indicada en el N2.
Tabla complementaria 1. Expresión y datos estadísticos para todos los Genes.
Esta tabla contiene el nombre sistemático, el p-valores ajustados para las siete pruebas de DESeq2 (es decir, 5 min vs 0 min, 10 min vs 0 min, etc.), el mínimo ajustado valor p y el cambio de doblez máxima log2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Complementario tabla 2. GO plazo resultados de enriquecimiento.
Esta tabla muestra procesos de GO, su representación en el conjunto de 607 O2-regulación de genes y su representación en el genoma. Entonces, la prueba de Chi-cuadrado se utilizó para identificar términos ir fueron significativamente sobre o debajo-representados en el conjunto de 607 genes. VAYA análisis de enriquecimiento se realizó mediante GO Slim Mapper en SGD 28. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura 1. Configuración de hipoxia para tomar puntos de tiempo sin interrumpir el flujo de Gas a los puntos de tiempo posteriores.
Es importante que todas las conexiones siguen siendo seguros, como se describe en el protocolo. Tenga en cuenta la ubicación del corto (9 cm) y largos tubos de vidrio (17 cm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de componentes principales (PCA) muestra la relación entre las tres réplicas biológicas.
Cada curva tiene el minuto 0 a minuto 240 muestras en orden. La expresión de gene de log2 normalizado para todos los genes se utilizó en la PCA. PC1 representa el 34.7% de la varianza total y PC2 representa el 24.2%. La línea negra es la primera repetición, la línea roja es el segundo, y la línea azul es la tercera. Tenga en cuenta que las flechas se utilizan para señalar el minuto 240 momento en diferentes muestras. Se realizó análisis de componentes principales (PCA) en R con la función prcomp (Q-mode o descomposición de valor singular) en la matriz transformada log2 que contiene genes en columnas y los puntos de tiempo en filas 29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Mapa de calor muestra expresión de las 607 Genes identificados como O2-regulado.
Estos genes fueron significativos en al menos una de las pruebas de DESeq2 y cambiaron la expresión de más de 4. Es log2(expresión relativa). Rojo = aumento de la expresión. Verde = expresión disminuida. Intensidad del color es proporcional al grado de cambio. Antes de crear el mapa de calor en el TreeView 30, expresión génica era k-medios agrupados con k = 10 en Cluster 3.0 31. La tecla de debajo del mapa de calor muestra la escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Niveles de mRNA relativa de cuatro Genes en el tiempo en las tres repeticiones.
La línea negra es la primera repetición, la línea roja es el segundo, y la línea azul es la tercera. Gen común/sistemática nombres son CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Cy NCE103/YNL036W. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo adicional 1. fastq_pipeline.sh
Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo adicional 2. time_course_script. R
Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de hipoxia han cerrado el frasco o el tubo al aire 32, utilizado el cloruro de cobalto hipoxia mimética 33o empleado inducen hipoxia anaeróbico cámaras o bolsas de 34. Cada uno de estos métodos puede resultar en diferentes niveles de hipoxia o de otros cambios ambientales no deseados. Sería útil para el estudio de expresión génica mientras sistemáticamente variando la mezcla de gases (por ejemplo, 90% N2 y 10% O2), como levadura en la naturaleza son propensas a experimentar menos graves condiciones hipóxicas. En segundo lugar, ergosterol y ácidos grasos insaturados (por ejemplo, Tween 80) no se agregaron a los medios de cultivo, ya que influyen expresión génica como se explica en la introducción. En tercer lugar minimizar los cambios de expresión génica causadas por diferentes fases de crecimiento, empíricamente determinada se realizaron diluciones para que cuando una cultura llegaron a un punto del tiempo, fue en la fase de registro medio de crecimiento (~ 1-2 x 107 células/mL). Cuarto, la rápida filtración y congelación (~ 15 s) de las células que se han quitado de la hipoxia es crítica, como cambios de expresión del gene pueden ocurrir en < 5 minutos de la exposición a O2, tal como ocurre cuando las células se recogen por centrifugación (datos no mostrados). El tiempo en que las células se exponen a O2 podría reducirse por realizar el crecimiento y la cosecha de células anóxica campana o cámara. En quinto lugar, fue elegida una variedad apropiada para este estudio; para ser consistente con otros estudios de genómica, se empleó el fondo común de cepa de laboratorio de S288C. Sin embargo, las cepas S288C contiene un alelo del mutante hap1 y así reparado 11. Esto permitió el estudio de los genes como CYC1 que responden a los niveles2 O vía la Hap1 transcripción factor 11.
Puntos de tiempo fueron elegidos porque exhibieron cambios de la expresión del gene grande en experimentos anteriores de hipoxia. Los resultados mostrados aquí pueden informar experimentos futuros. Por ejemplo, sería útil usar una resolución más alta de puntos de tiempo durante intervalos que muestran grandes cambios (p. ej., hipoxia de 0 a 30 min.) para capturar más finamente la diversa cinética. Además, momentos más tardías, más allá del período de tiempo analizado aquí (es decir, 4 h de hipoxia) pueden revelar más cambios de expresión.
RNA-seq se utilizó para medir los niveles de mRNA debido a que su reproducibilidad y su amplio rango dinámico permiten medición de pliegue grandes cambios 18,35. ARN fue extraído por la interrupción mecánica de las células usando granos sacudidos vigorosamente y purificado en una columna. Podrían utilizarse otros métodos de purificación de RNA, como fenol caliente 36. Idealmente, la concentración de RNA estará en el rango de 200 ng/μl - 1000 ng/μl, ya que la concentración de RNA se diluirá a 100 ng/μL para reversa de la transcripción y preparación de la biblioteca. La concentración de RNA debe medirse con un fluorómetro y tinte de RNA específicas; un espectrofotómetro UV es limitado debido a que mide la concentración total de ácidos nucleicos, que consiste en RNA y DNA. La calidad del RNA se determina por electroforesis en gel; bandas de ARN ribosómico deben estar bien definidas en el gel y manchas indica degradación de RNA. Aquí, las transcripciones del mRNA se enriquecieron, pero hay diversos métodos para aislar diferentes RNA tipos 20 que también pueden ser importantes en la respuesta.
Ahorrar recursos, entre 8 y 12 muestras fueron multiplexadas y secuenciadas juntos en un carril, lo que resulta en un promedio de por lo menos 693 lecturas por gene para cada muestra, suficiente para reproducible determinar el número de lecturas por gene. De hecho, más de 12 muestras podrían ser multiplexadas en un carril, probablemente dando por resultado muestreo adecuado de la mayoría de los genes. Para calcular que la media Lee por gene, el número total de lecturas que asignan a los genes (en el archivo de salida HTSeq) fue dividido por el número de genes que proporcionan a HTSeq (en este estudio, 7140). Para calcular el número máximo de muestras que pueden ser multiplexados en un carril, considerar genes de interés que presentan la más baja expresión (es decir, normalizado más bajo cuentas), utilizando los datos de este y otros estudios de RNA-seq. Si las cuentas leerlas normalizadas de un gen varían a través de repeticiones, entonces el número de lecturas puede ser demasiado bajo, lo que sugiere que menos muestras deben ser multiplexadas por carril de secuenciación.
Secuenciación de próxima generación va a generar archivos FASTQ la Lee y otra información. Si multiplexación fue realizada, pueden generar un archivo de código de barras y un archivo adicional de FASTQ. Estos archivos pueden descargarse para análisis local, como en el presente Protocolo. Por otra parte, hay varios online secuencia de próxima generación herramientas de análisis para aquellos no familiarizados con las funciones de línea de comandos o R. En este sentido, recomendamos Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). En el presente Protocolo, dos secuencias de comandos que han sido escritos por los autores se utilizan para el análisis de procesamiento y expresión de FASTQ. Los scripts son bien anotados y pueden ser editados para diferentes diseños experimentales y configuraciones de computadoras. También, las dos secuencias de comandos y la tabla de "Materiales" proporcionan sitios para la descarga de las herramientas utilizadas en estas secuencias de comandos. El primer guión, "fastq_pipeline.sh", es un script de shell que se ejecutará en la línea de comandos en un terminal de UNIX/Linux. Este script multiplexa el fichero FASTQ original que contiene todas las lecturas obtenidas de un carril del secuenciador, generando un fichero FASTQ para cada muestra en eso carril. A continuación, lee en cada fichero FASTQ es calidad cortada con Trimmomatic de configuración por defecto 21. Lee cortado entonces se asigna al genoma de referencia de S. cerevisiae S288C (SGD R64-1-1_20110203) con TopHat2 de configuración por defecto 22. El guión finalmente utiliza HTSeq para determinar el número de lecturas que se asignan a cada característica anotada 19.
El segundo script, "time_course_script. R", también ha sido escrito por los autores y se ejecuta en el entorno estadístico R del 24. El guión inicialmente las importaciones en son el leer datos generados por HTSeq. Cada muestra se supone que es un punto del tiempo y así se organiza en relación con los otros puntos del tiempo. Las cuentas crudas de leer luego importadas en el paquete de R, DESeq2 25, con el fin de identificar los genes que se expresan diferencialmente en cualquiera de los puntos del tiempo en relación con el primero (es decir, aeróbicos, tiempo 0). Debido a su flexibilidad, DESeq2 se puede utilizar para realizar otras pruebas estadísticas, como si la expresión cambia en función del tiempo 13. Por otra parte, otras herramientas empleando la estadística paramétrica y no paramétrica para RNA-seq leer datos de la cuenta pueden ser usado 20. La escritura entonces normaliza las cuentas leerlas para controlar el grado de la secuencia de cada muestra, y log2 transforma las cuentas. Estas lecturas procesadas se utilizan para realizar análisis PCA, para determinar el cambio de doblez máxima de cada gen y para crear los gráficos de expresión en la figura 4.
Un tema importante es la mejor manera de utilizar las estadísticas para identificar los genes que responden significativamente a la hipoxia. Al menos tres réplicas biológicas del curso del tiempo están necesarios para calcular la variabilidad natural de cada gen y determinar así los genes que responden a la hipoxia más significativamente de lo esperado por azar. Alternativamente, es posible identificar con éxito los genes que responden con el tiempo, sin repeticiones biológica 13,25,38,39. El principal inconveniente de estos métodos es que no toma en cuenta la variabilidad biológica de cada gene. Sin embargo, si no se realizan repeticiones de RNA-seq, cambios de expresión de cada gen se podrían verificar por realizar que RT-qPCR con biológicos múltiples Replica 13.
Hay dos ventajas principales a evaluar varios puntos de tiempo de respuesta. En primer lugar, como comentamos anteriormente (sobre todo en la figura 2), un curso de tiempo identifica los intervalos exhibiendo cambios de gran expresión, informando si puntos del tiempo adicional se requiere para mejorar la resolución de la cinética o para observar acontecimientos posteriores de la respuesta. En segundo lugar, un curso de tiempo permite la diferenciación de la cinética de expresión de cada gen. Esto ayuda con la identificación únicas vías de señalización que actúan en momentos específicos durante la respuesta y da la penetración en el momento de iniciación y terminación de la señalización. En concreto, la agrupación de genes por el patrón de expresión que se realizó aquí dio lugar a conjuntos de genes regulados conjuntamente. Los promotores de un conjunto de genes pueden compartir un sitio de unión del factor de transcripción, lo que sugiere que el factor de transcripción se convierte en activo cuando los genes cambian de expresión.
Al estudiar una respuesta celular, la variabilidad observada es ideal debido a los estímulos (p. ej., hipoxia) y no a otras variables experimentales. Sin embargo, como se ve en la figura 2, el investigador o los lotes de los componentes de los medios de comunicación hacen importantes contribuciones a la variabilidad en la expresión génica. Por lo tanto, estos parámetros deben considerarse para alcanzar alta reproducibilidad y mínima variabilidad experimental. Tan poco tiempo como sea posible debe separar cada repetición, debido a variables experimentales son más propensos a cambiar a medida que pasa el tiempo.
En conclusión, este método puede utilizarse para monitorizar con precisión alteraciones del genoma en niveles del mRNA (u otros eventos tales como modificaciones de las histonas o niveles de la proteína) durante un curso de tiempo de hipoxia. El método puede adaptarse para otros organismos, especialmente las especies microbianas que pueden cultivarse en cultivo líquido. Tales análisis de tiempo-curso de genoma complementarán los estudios de morfología celular, la actividad de la proteína y el metabolismo. Juntos, estos datos se conducen a una comprensión más rica de una respuesta celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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