Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.
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Artigo de método
Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os neurônios dependem a isolação elétrica e suporte trófico de oligodendrócitos microambiental. Apesar da importância de oligodendrócitos, as ferramentas avançadas atualmente utilizadas para estudar os neurônios, apenas parcialmente foram tomadas por pesquisadores do oligodendrocyte. Células específicas do tipo de coloração por transdução viral é uma abordagem útil para estudar a dinâmica de organela ao vivo. Este artigo descreve um protocolo para a visualização de mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro por transdução com vírus adeno-associado (AAV), carregando genes mitochondrial proteínas fluorescentes alvo sob o controle transcricional de o promotor de proteína básica da mielina. Inclui o protocolo para fazer organotypic fatias de cérebro de rato coronal. Segue um procedimento para Time-Lapse de imagem de mitocôndrias em seguida. Esses métodos podem ser transferidos para outras organelas e podem ser particularmente útil para estudar organelas na bainha de mielina. Finalmente, descrevemos uma técnica prontamente disponível para visualização de mielina Imaculada em fatias vivos pela microscopia Confocal reflectância (núcleo). Núcleo não requer nenhum equipamento extra e pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo.
Introdução
Matéria de branco do cérebro é composta de axônios de células nervosas envolvidos em mielina, uma membrana de plasma estendida especializada formada pelos oligodendrócitos. Mielina é necessária para a propagação do potencial de ação rápida e confiável e sobrevivência a longo prazo dos dendritos, e uma perda de mielina pode causar disfunção neurológica. Apesar de sua importância, as propriedades de oligodendrócitos são menos conhecidas em comparação com os neurônios e astrócitos. Consequentemente, menos ferramentas foram desenvolvidas para estudar oligodendrócitos.
Viva de imagem das organelas celulares como mitocôndrias, retículo endoplasma....
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Protocolo
os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela autoridade norueguesa de pesquisa Animal. Fornecedores e números de catálogo para os consumíveis e outros necessários equipamentos estão disponíveis na lista de materiais no final do documento.
1. preparação de fatias de Organotypic
Nota: esta receita usa dois filhotes de rato no pós-Natal dia 7-9 (p7-9), que rendem 24 fatias de organotypic divididas em dois pratos de seis-poço de cultura. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos devem ser feitos em uma capa de estéril e luvas de nitrilo ou látex devem ser usadas. Devem ser usados apenas ingredient....
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Resultados
Organotypic fatias de cérebro que foram cultivadas e transfectadas conforme descrito acima mostraram uma distribuição esparsa de oligodendrócitos corticais expressando mito_dsred e GFP. Imunocoloração com anticorpos contra Olig2 e MBP confirmou que a expressão era específica de oligodendrócitos (Figura 1).
Para geração de imagens ao vivo, oligodendrócitos transduzidos foram reconhecidos por sua morf.......
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Discussão
O protocolo para fazer culturas de organotypic descritas aqui é uma versão modificada de18 do protocolo descrito por De Simoni e Yu (2006)5. As mudanças mais importantes foram esboçadas abaixo. Tampão Tris é adicionado ao meio de cultura, o que melhora a sobrevivência das fatias quando fora da incubadora durante a transdução viral e mudança do meio de célula. O procedimento de esterilização para confetti também mudou. Enquanto outros protocolos esterilize confetti em autocl.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås para acesso à célula de laboratório e equipamentos, pessoal de Janelia Biologia Molecular compartilhada recursos para a produção de vírus e do plasmídeo e Koen Vervaeke para obter assistência com medições de potência do laser. Este trabalho foi financiado pela Associação Norueguesa de saúde, Conselho Norueguês de pesquisa e os equipamentos de microscopia foi financiado pelo Norbrain.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Agulhas usadas para entrada e saída de gás |
| bioóxido | marca AGA | 105701 | |
| Sigma-Aldrich | Z615927 | Queimador de | |
| Bunsen (queimador de propano líquido) | VWR | 89038-530 | |
| Conjunto de cabos para controladores de aquecedor | Warner Instruments | 64-0106 | Controlador de temperatura - parte do termômetro |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 para incubadora |
| Tampa de vidro, quadrada Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Para anexar sob o banho para imagens ao vivo. Sele com cola ou vaselina. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Pinça Delicada | Finescience | 11063-07 | Para dissecação |
| Caneta Diamond scriber | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Pipetas de vidro descartáveis Pasteur 230 mm | VWR | 612-1702 | Pipetas de vidro |
| Lâmina de barbear de aço inoxidável de borda dupla | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Lâmina de barbear para vibratomo |
| Solução salina equilibrada de Earle (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Círculos de papel de filtro | Schleicher & Schuell | 300,220 | Papel de filtro usado para filtração de PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use para conectar/ajustar a posição de entrada e saída no banho |
| Toalha de mão C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Plana para Câmara RC-41, | Warner Instruments | 64-1418 | Harpa para segurar confetes no banho. Corte os fios antes de usar com fatias organotípicas. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Modelo 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Capuz de fluxo laminar |
| Soro de cavalo, inativado por calor | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confete |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax com HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Colher Microscopia Heyman Tipo B | Microscopia Eletrônica Sciences | 62411-B | Espátula pequena e arredondada com extremidade afiada para dissecção |
| Unidade de filtro Millex-GP | Millipore | SLGPM33RA | Seringa Inserção |
| cultura de células Millicell, 30 mm | Inserções | de cultura de | células |
| Minipuls 3 Módulo de controle de velocidade | GILSON | F155001 | Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte do módulo de controle (conecte ao cabeçote de dois canais) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta | Surface Thermo Placa | de | Cultura |
| Suspensão de Nistatina | Objetivo Sigma-Aldrich | N1638 | |
| W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Objetiva de imersão em água usada para imagens ao vivo. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldeído, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| Câmara de perfusão PC-R | SiSkiYou | 15280000E | Banho para imagens ao vivo |
| Penicilina-Estreptomicina, líquido | Invitrogen | 15070-063 | |
| Placa de Petri 140 mm | Heger | 1075 | Placa de Petri Grande |
| Placa de Petri 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Placa de Petri média |
| Placa de Petri | pequena de 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 |
| Fosfato tamponado com solução salina (PBS) | Sigma | P4417 | PBS |
| comprimidos R2 Cabeça de dois canais | GILSON | F117800 | Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte da cabeça de dois canais (requer módulo de controle) |
| Espátulas redondas/planas, aço inoxidável | VWR | 82027-528 | Espátula grande para dissecção |
| Papel de areia | VWR | MMMA63119 | Opcional, para alisar pipetas de vidro quebrado |
| Tesoura, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Tesoura grande para dissecção |
| Tesoura, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Tesoura pequena e afiada para dissecação |
| Lâmina de gema de borda única | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Lâmina de barbear de borda única |
| Aquecedor de solução única em linha SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 Controlador de | temperatura - peça do aquecedor |
| Unidade de filtro Steritop-GP, 500 ml, 45mm | de SCGPT05RE | Millipore | para esterilizar soluções |
| Super cola de precisão | Loctite | 1577386 | |
| lâmina de bisturi cirúrgico nº 22 | Swann Morton Ltd. | de lâmina de bisturi arredondado | 209 |
| TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Controlador de temperatura para imagens ao vivo (requer aquecedor de solução e montagem de cabos) |
| Base Trizma | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| incubadora jacketed água série II | Forma Scientific | 78653-2882 | incubadora |
Referências
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T.
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Reimpressões e permissões
