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Artigo de método

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

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DOI:

10.3791/56237

⸱

23 de outubro de 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

Neste artigo

Resumo

Microambiental oligodendrócitos promovem a propagação do potencial de ação rápida e sobrevivência neuronal. Aqui descrito é um protocolo para oligodendrocyte específicas de expressão de proteínas fluorescentes em organotypic fatias de cérebro com imagens subsequentes de lapso de tempo. Além disso, apresenta-se um procedimento simples para a visualização de mielina imaculada.

Resumo

Os neurônios dependem a isolação elétrica e suporte trófico de oligodendrócitos microambiental. Apesar da importância de oligodendrócitos, as ferramentas avançadas atualmente utilizadas para estudar os neurônios, apenas parcialmente foram tomadas por pesquisadores do oligodendrocyte. Células específicas do tipo de coloração por transdução viral é uma abordagem útil para estudar a dinâmica de organela ao vivo. Este artigo descreve um protocolo para a visualização de mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro por transdução com vírus adeno-associado (AAV), carregando genes mitochondrial proteínas fluorescentes alvo sob o controle transcricional de o promotor de proteína básica da mielina. Inclui o protocolo para fazer organotypic fatias de cérebro de rato coronal. Segue um procedimento para Time-Lapse de imagem de mitocôndrias em seguida. Esses métodos podem ser transferidos para outras organelas e podem ser particularmente útil para estudar organelas na bainha de mielina. Finalmente, descrevemos uma técnica prontamente disponível para visualização de mielina Imaculada em fatias vivos pela microscopia Confocal reflectância (núcleo). Núcleo não requer nenhum equipamento extra e pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo.

Introdução

Matéria de branco do cérebro é composta de axônios de células nervosas envolvidos em mielina, uma membrana de plasma estendida especializada formada pelos oligodendrócitos. Mielina é necessária para a propagação do potencial de ação rápida e confiável e sobrevivência a longo prazo dos dendritos, e uma perda de mielina pode causar disfunção neurológica. Apesar de sua importância, as propriedades de oligodendrócitos são menos conhecidas em comparação com os neurônios e astrócitos. Consequentemente, menos ferramentas foram desenvolvidas para estudar oligodendrócitos.

Viva de imagem das organelas celulares como mitocôndrias, retículo endoplasmatic (ER) ou diferentes estruturas vesiculares podem ser útil para estudar as mudanças dinâmicas nas organelas ao longo do tempo. Tradicionalmente, imagem latente de oligodendrócitos vivos foi realizada em monoculturas1,2. No entanto, oligodendrócitos em monocultura não exibir o compacto de mielina, e organotypic ou fatias de cérebro aguda podem, portanto, ser uma opção melhor, ao estudar o movimento de organelas e localização. Localização de pequenas organelas e proteínas na bainha de mielina pode ser desafiador devido à curta distância entre o dendritos axônio e a bainha de mielina circundante. Assim, procedimentos de imunocoloração microscópica luz sozinho não têm a resolução espacial para discriminar entre organelas na bainha de mielina e os dendritos axônio. Isso pode ser resolvido por transdução viral com genes para proteínas fluorescentes organela-alvo conduzidos pelos promotores de tipo específico de célula. As vantagens são uma expressão de célula específica e esparsa, que permite a avaliação precisa da localização da organela e dinâmica. Animais transgénicos também podem ser usados para atingir uma organela-alvo específicos de célula expressão3. No entanto, a produção e a manutenção de animais transgénicos é caros e geralmente não oferece a expressão esparsa que pode ser alcançada por métodos virais.

O método descrito aqui usa transdução viral de oligodendrócitos com proteínas fluorescentes mitocondrial-alvo (dsred ou verde proteína fluorescente, GFP) conduzido pelo promotor de proteína básica da mielina (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) para Visualizar mitocôndrias oligodendrocyte organotypic fatias de cérebro. Além disso, a expressão de uma outra proteína fluorescente no citoplasma (GFP usado junto com o mito-dsred ou tdtomato usado com mito-GFP) é usado para permitir a visualização da morfologia celular, incluindo os compartimentos citoplasmáticos da bainha de mielina. O protocolo inclui o procedimento para fazer fatias de cérebro de organotypic (uma versão modificada do protocolo descrito por De Simoni, Yu, 2006,4,5). Em seguida, descrevemos o procedimento da imagem latente lapso de tempo para estudar o movimento mitocondrial. Este procedimento usa um microscópio confocal ereto com uma troca contínua do meio da imagem latente, uma configuração que permite fácil aplicação de drogas ou outras alterações médias durante a imagem latente. O procedimento da imagem latente lapso de tempo pode ser executado em qualquer microscópio confocal, com algum equipamento extra para manter vivas as fatias conforme descrito abaixo. O protocolo também contém várias dicas para otimizar imagens e reduzir a fototoxicidade.

Por último, uma maneira rápida e simples para visualizar a mielina imaculada pela microscopia Confocal reflectância (núcleo) é descrita. Isso pode ser útil para identificar a bainha de mielina durante a geração de imagens ao vivo. Nos últimos anos, várias técnicas têm sido desenvolvidas para mielina imagem sem qualquer coloração necessária, mas a maioria destes requerem específico equipamento e conhecimentos6,7,8. O procedimento descrito aqui usa as propriedades reflexivas da bainha de mielina e é uma versão simplificada de comprimento de onda único-excitação de microscopia de reflectância espectral de Confocal (Pontuação, no qual vários comprimentos de onda de laser é combinadas para visualizar mielina) 9. núcleo pode ser feito em qualquer microscópio confocal que tem um laser de 488 nm e um filtro de emissão 470-500 nm bandpass ou um filtro de emissão ajustável.

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Protocolo

os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela autoridade norueguesa de pesquisa Animal. Fornecedores e números de catálogo para os consumíveis e outros necessários equipamentos estão disponíveis na lista de materiais no final do documento.

1. preparação de fatias de Organotypic

Nota: esta receita usa dois filhotes de rato no pós-Natal dia 7-9 (p7-9), que rendem 24 fatias de organotypic divididas em dois pratos de seis-poço de cultura. Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos devem ser feitos em uma capa de estéril e luvas de nitrilo ou látex devem ser usadas. Devem ser usados apenas ingredientes de grau de cultura celular.

  1. Garrafas de autoclave, ferramentas de dissecação (1 tesoura grande, 1 pequena tesoura, 1 espátula plana grande, 1 pequena espátula arredondada e afiada e 1 fórceps, Ver os materiais de lista para obter detalhes), vidro pipetas, pontas de pipetas e lenços de tecido usados para a preparação de fatia.
  2. Como metade das pipetas de vidro devem ser usados com grande abertura, romper a extremidade estreita.
    1. Pontuação com um scriber do diamante pen (se disponível) em torno da pipeta apenas abaixo do ponto onde o vidro começa a estreitar. Então coloque a extremidade pontiaguda da pipeta em uma luva de nitrilo ou similar. Cuidadosamente, quebre a ponta dobrando a pipeta enquanto a empurra contra uma bancada de trabalho.
    2. Então sem corte final quebrado, esfregando um pedaço de papel da areia ou derreter ligeiramente em um bico de Bunsen. As pipetas quebradas são usadas para transferir o cérebro corte fatias com extremidade quebrada transformada-se o bulbo de borracha e abre o grande final tocar as solução/fatias.
      Nota: Isto não é feito em uma capa de estéril e pode ser feito de vários dias de antecedência.
  3. Preparar pratos de cultura.
    Nota: Isto pode ser feito no dia antes de cortar ou pelo menos 2 horas antes de cortar.
    1. Membranas de politetrafluoretileno (PTFE) esterilizar (" confetti "). Use duas pinças esterilizadas para retirar as peças de plástico azuis circundantes único confete e esterilizar mergulhando duas vezes em uma placa de Petri contendo 96% de etanol (EtOH). Em seguida, estabelecer confete flat em um prato de Petri estéril grande secar.
      Nota: O confetti são membranas PTFE hidrofílicas semelhantes das membranas nas inserções de cultura. O uso de confetes auxilia a imagem ao vivo porque única fatias podem ser facilmente transferidas da inserção para a configuração do microscópio, levantando o confetti com fórceps (ver 4.8. para obter detalhes). Alternativamente, as fatias do cérebro podem ser cultivadas sem o confetti (em que as fatias irão anexar diretamente para a membrana da inserção da cultura). Neste caso, a inserção da membrana deve ser cortada com um bisturi para transferir a fatia para o banho do microscópio.
    2. Adicionar 1 mL de meio de cultura (receita em reagentes ' tabela) para cada poço dos pratos bem seis cultura.
    3. Cultura de um lugar inserir em cada poço usando Pinças esterilizadas. Evitar bolhas de ar entre a inserção e o meio de cultura.
      Nota: Para economizar dinheiro e o ambiente, é possível reutilizar as inserções de cultura. Isso pode ser feito por lavagem completa em água destilada H 2 O (dH 2 O) seguida de incubação em 70% EtOH durante um período mínimo de 24 h até reutilização. Ao se preparar para uma nova cultura, secar as inserções em uma placa de cultura de células sob radiação ultravioleta (UV) luz de 15-30 min.
    4. Coloque dois confetti (esterilizado e seco) em cada uma das inserções da cultura. Coloque o confete para as bordas das pastilhas para sobreposição mínima.
    5. Colocar as placas na incubadora a 37 ° C com 5% CO 2 cultura celular.
  4. Meio de dissecação frio de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás bioxide (95% O 2 /5%CO 2). Para manter a solução estéril, conectar o tubo do cilindro de gás de um filtro de seringa estéril (tamanho de poros de 0,22 µm). Filtro
    1. par a outra extremidade da seringa a um tubo estéril conectado a uma pipeta de vidro estéril. Colocar a pipeta de vidro na solução, cobrir com parafilm e ligar o gás. Manter o meio de dissecação na Ice.
  5. Preparar a área de dissecação/fatiar.
    Nota: Idealmente, este procedimento deve ser feito em uma capa de estéril. Se isto não for possível, o vibratome pode ser deixada em uma bancada de trabalho. Neste caso, é recomendável usar uma máscara de rede e cara de cabelo.
    1. Usando uma única borda lâmina de barbear, cortar um pedaço retangular (aproximadamente 2 cm x 0,5 cm) de gel de agarose (receita em reagentes ' tabela) e colar isso no palco do vibratome, tal que o lado comprido enfrenta a lâmina vibratome.
    2. Limpe todas as superfícies e as partes vibratome com 70% EtOH e limpe-o com lenços de tecido autoclavados.
      Nota: É importante que todas as peças que estarão em contato com o tecido cerebral são completamente secas desde EtOH pode danificar as células.
    3. Anexar uma lâmina de barbear estéril para o vibratome e executar a verificação de vibração se o vibratome tem essa função.
    4. Ferramentas de dissecação autoclavado lugar no bairro juntamente com tecido autoclavado wipes, quatro pequenos pratos de Petri, um bisturi de ponta redonda, 2 pipetas de vidro com bulbos de borracha, duas pipetas de vidro Open-end (ver pt. 1.1) e super cola (pulverizada com EtOH).
    5. Pour médio borbulhados dissecação para o barco de vibratome e para os quatro pequenos pratos de Petri.
      Nota: Este passo só deve ser feito imediatamente antes de dissecação desde médio a partir deste ponto não é borbulhar ou mantido no gelo
  6. Montagem e dissecar cérebros.
    Nota: Para obter fatias de saudáveis, esta etapa deve ser feita rapidamente e com precisão. É necessário alguma prática.
    1. Eutanásia animal #1 pela luxação do neckor de acordo com as diretrizes locais e então decapitar com a tesoura grande.
    2. Usando pequenas, afiadas tesouras, rapidamente retire a pele, fazendo uma incisão sagital do pescoço ao nariz e retirá-para revelar o crânio.
      1. Corte ao longo da sutura sagital, seguida por incisões laterais na parte interior dos ossos frontal e a sutura lamboid (fronteira entre os hemisférios e cerebelo).
      2. Use pinça para dobrar aberto no crânio de cada lado. Os nervos cranianos são cortados do cérebro inserindo uma espátula arredondada, afiada sob o lado ventral do cérebro e suavemente movendo a espátula lateralmente.
    3. Usar uma lâmina única borda para fazer uma coronal corte rostral no cerebelo.
      Nota: Esta corte irá determinar o ângulo em que as fatias são cortadas. É, portanto, conveniente em um ângulo reto.
    4. Flip o cérebro fora do crânio e em um pequeno prato de Petri contendo meio de dissecação.
    5. Repetir passos 1.6.1.-1.6.4. para animal #2 e lugar este cérebro em uma segunda Petri dish.
      Nota: Os animais não são estéreis. Faz a dissecação de um lado da capa e em seguida, mova para o lado oposto, limpo uma vez que o cérebro tem sido retirado do crânio.
    6. Alterar luvas.
      7. Cérebro de anexar
    7. para vibratome fase: adicionar uma camada fina de super bonder no palco em frente do gel do agarose montado. Segure o lado do cérebro #1 com uma simples espátula grande com o recém cortadas (caudal) tocando a espátula e o revestimento do lado ventral (e sendo tão perto quanto possível) o gel de agarose.
      1. Em seguida, Coloque suavemente o cérebro para a cola por estendendo-os a espátula com um conjunto de pinças. Certifique-se de deixar espaço suficiente para o cérebro #2.
        Nota: É importante que o cérebro está bem conectado ao palco, mas sem excessiva colagem, como isto pode obstruir o corte.
    8. Imediatamente após a montagem do cérebro #1, use a espátula grande para adicionar algumas gotas de meio de dissecação em cima do cérebro. Isto manterá o cérebro húmido, endurecer a cola e evitar que grudem para os lados dos cérebros.
    9. Repita etapas 1.6.7 e 1.6.8. para cérebro #2.
    10. Anexar o palco sobre o barco de vibratome.
  7. Corte 230 µm coronal fatias grossas com uma amplitude de 1-1.5 mm, uma frequência de 85 Hz e uma velocidade de 0,2 mm/s. Collect fatias aproximadamente entre 1,4 mm rostral e caudal de Bregma 2,1 mm.
    1. Fatias coletar cortarem cada fatia usando pipetas de vidro Open-end (pt. 1.1). Transfira as fatias para uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Usar um bisturi arredondado para cortar as fatias em dois pedaços, dividindo os dois hemisférios.
  8. Quando todas as fatias são cortadas, coloque as fatias para os pratos de cultura.
    1. Tirar o prato de cultura (um de cada vez) a incubadora.
    2. Cuidadosamente usando as pipetas de vidro Open-end, transferir uma fatia para cada um dos papelinhos.
      Nota: As fatias devem deitado no meio do confete. Isto requer alguma habilidade. No entanto, se algumas fatias não são perfeitas, é melhor deixá-los do to gastar tempo tentando movê-los como é importante entrar todas as fatias da incubadora mais rápido possível.
    3. Usar uma pipeta de vidro (extremidade pontiaguda) para remover suavemente o excesso de meio sem tocar a fatia.
      Nota: Fatias não devem ser mergulhadas em água durante a incubação. Assim, o excesso de meio deve ser aspirado tal que as fatias são expostas ao ar (uma fina película de médio ainda vai cobrir as fatias). Fatias que permanecem imersos no líquido serão geralmente insalubre ou morrer (4 e nossas observações).
    4. Mover o prato de volta na incubadora, uma vez que todos os papelinhos tem uma fatia.
    5. Repita etapas 1.7.8.-1.8.4. prato #2.
  9. Alterar o meio de cultura.
    Nota: Isto deve ser feito no dia seguinte (dia 1 in vitro, DIV1) de corte e em seguida a cada 2-3 dias.
    1. Pré-aqueça o meio de cultura em banho-maria ou incubadora.
    2. Em um capuz estéril, usar sucção à vácuo ou uma pipeta regular com uma ponta estéril para aspirar o meio de cultura de cada poço. Isto é feito delicadamente derrubando o prato (por cerca de 30 graus) e colocando a ponta da pipeta na borda da inserção da cultura.
    3. Remover aproximadamente 800 µ l de cada poço (deixando apenas suficiente médio para manter a parte inferior da inserção da coberta no meio). Em seguida, usando uma pipeta limpa, adicione 800 µ l do meio pré-aquecido a cada poço. Em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora de cultura celular.

2. Transdução viral

  1. compra ou fazer AAVs com um plasmídeo de interesse, conforme descrito anteriormente, 10 , 11.
    Nota: Este protocolo descreve o uso do serótipo AAV 2/8 (AAV 2/8) carregando mitocondrial alvo dsred ou GFP como gene repórter sob o controle transcricional da proteína básica de mielina promotor 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) para visualizar as mitocôndrias oligodendrocyte. AAV 2/8 carregando GFP ou tdtomato como gene repórter conduzido pelo promotor geral CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) é usado para visualizar o citoplasma oligodendrocyte. Assim, a combinação de AAV2/8 MBP_mito_dsred com CAG_GFP de AAV 2/8 dá mitocôndrias vermelhas e verde citoplasma em oligodendrócitos, Considerando que a combinação de AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dá verdes mitocôndrias e citoplasma de vermelha. As construções são descritas em mais detalhe em outro lugar 13.
  2. No dia 7 in vitro (DIV7), transduce oligodendrócitos com os AAVs.
    Cuidado: Siga as normas de segurança para trabalhar com AAVs. Certifique-se de ter a formação adequada e a aprovação de nível de biossegurança exigido. Todos os pontos seguintes devem efectuar-se em um gabinete de segurança biológica classe II usando luvas e avental. Aqui, aplicação do vírus adeno-associados à área das fatias de córtex é descrita, como esta é a área que mostra a melhor recuperação. Meio de cultura de
    1. dilua o AAV no pré-aquecido (37 ° C). Diluições em torno de 2 × 10 9 genoma cópias/mL (GC/mL) são recomendadas para obter uma transdução esparsa de oligodendrócitos, que permite a geração de imagens de células únicas dentro da fatia. No entanto, um piloto usando diferentes títulos deve ser feito para garantir uma densidade de oligodendrócitos transduzidas que é adequada para as experiências específicas. Se forem utilizados dois AAVs diferentes, deveriam ser misturadas na mesma solução e adicionados à auxiliar simultaneamente.
    2. Adicionar cerca de 1,3 µ l diluída AAV para cada fatia: Certifique-se de fora da ponta da pipeta é seca. Pipetar µ l 1.3 diluído AAV e segurar a pipeta acima do córtex, tão próxima quanto possível sem tocar na fatia com a ponta da pipeta (cerca de 1 mm).
    3. Então Empurre lentamente uma solução fora da pipeta. Quando a solução toca a fatia, mova a ponta da pipeta sobre o córtex para espalhar a solução sobre a área do córtex inteiro.
      Nota: Este procedimento deve ser feito tão rapidamente quanto possível para evitar manter as fatias para fora do capô por mais tempo do que o necessário. Fazer isso em um prato ao tempo e o primeiro prato que volta na incubadora antes de começar no prato #2. Para obter uma distribuição satisfatória de AAV, sem danificar o tecido requer alguma prática e uma mão firme.
  3. Se um microscópio de fluorescência vertical está disponível no laboratório de célula, a expressão da proteína pode ser verificado durante o tempo em cultura, colocando o prato sob o microscópio.
    Nota: O prato não deve ser mantido fora da incubadora por mais de 2-5 minutos.

3. Imagem de lapso de tempo

Nota: A imagem pode ser realizada sempre que os níveis de expressão dos marcadores fluorescentes são suficientes e as fatias com um ar saudáveis (geralmente DIV11-14).

  1. Certifique-se que o microscópio, perfusão e aquecimento estão corretamente configuradas para que a solução de imagem borbulhada é aquecida e pode entrar e sair do banho.
    Nota: Existem várias soluções para câmaras de banho. Uma versão simples é apresentada aqui.
    1. Fazer em - e tomadas do banho por agulhas de seringa cega (curvado ~ 45 °) que estão conectados para os lados da banheira por aderência blu-aderência/fun.
    2. Certifique-se de que a tubulação vai de um frasco de solução de imagem borbulhado continuamente, através da bomba peristáltica, através do tubo de aquecimento da caldeira e depois para a agulha da seringa a entrada no banho.
    3. Conectar-se a outro tubo à saída da agulha da seringa. Este tubo depois vai através da bomba peristáltica e volta para o frasco de solução de imagem (ou uma garrafa de resíduos).
  2. Solução de imagem de bolha (receita em reagentes ' tabela) com gás de bioxide.
    Nota: Isto deve ser started pelo menos 15 minutos antes de imagem e continuar durante todo o experimento.
  3. Vez na bomba peristáltica e aquecedor e executar a solução através do banho para obter a temperatura ideal de banho (37 ± 0,5 ° C). Certifique-se de que o sensor do termómetro conectado à unidade de temperatura está submersa na solução banho.
  4. Ligar o microscópio, lâmpada da fluorescência e lasers apropriados.
    5. Caminho de
  5. conjunto acima uma luz adequada para a amostra.
    Nota: Isto pode variar dependendo da configuração do microscópio e sonda. Conhecimento geral de como usar o microscópio confocal é necessário e não será tratado aqui.
  6. Usar um objectivo de imersão de água com o apropriado ampliação e abertura numérica (n.a.). Nós usamos um objectivo de plano-apochromat de imersão de água 40 x (n.a. 1.0).
  7. Open pinhole para alcançar uma secção óptica de aproximadamente 2 a 2,5 µm para o vídeo lapso de tempo. Isso reduz a ocorrência de mitocôndrias, movendo-se fora de foco durante o lapso de tempo.
  8. Fatia de organotypic de transferência para o banho:
    1. Adicionar uma gota de solução de imagem ou de meio de cultura para uma placa de Petri de plástico pequeno.
    2. Em uma capa de estéril, estéril de uso de fórceps para transferir uma fatia de organotypic da membrana inserir para a gota. O fórceps só devem tocar o confete e não a fatia.
    3. Colocar a tampa sobre o prato de Petri.
    4. Imediatamente colocar a placa de cultura contendo o resto das fatias de volta na incubadora.
    5. Trazer placa de Petri contendo fatia para o microscópio.
    6. Desligar a bomba peristáltica enquanto transfere a fatia para banho de microscópio. Primeiro, use fórceps para levantar confetti com fatia de placa de Petri para o topo do banho (o confetti flutuarão). Então coloque as duas pontas da pinça de cada lado do confete para que eles toquem o confete sem tocar a fatia e empurre o confetti através da solução no fundo da banheira. Centralizar o confete no meio do banho.
      7. Uso de fórceps para colocar a âncora de grampo (harpa) em cima do Confeti sem tocar a fatia de
    7. .
      Nota: Uma harpa é uma âncora de platina em forma de ferradura que é usada para evitar que a fatia de flutuante ou à deriva no banho. Para fatias agudas, cordas finas correr de um lado da harpa para o outro (semelhante a uma harpa de música). Para fatias de organotypic, a harpa deve ser stringless e ajustar o tamanho do confetti de tal forma que ele pode pôr em cima do Confeti sem tocar a fatia.
    8. Ligar bomba peristáltica.
  9. Baixar o objectivo para a amostra.
  10. Selecione a célula e região para imagem.
    Nota: Evite a exposição excessiva das células da luz de laser, pois isso pode causar toxicidade celular (veja dicas nos pontos abaixo).
    1. Use as oculares e a lâmpada fluorescente para encontrar um oligodendrocyte aparência saudável com a expressão correta. Tipicamente, oligodendrócitos que têm um forte superexpressão da proteína fluorescente aparecem insalubres. Oligodendrócitos insalubres terão processos com uma aparência sem forma, e as mitocôndrias aparecerá fragmentadas. Oligodendrócitos saudáveis, a soma e processos aparecem lisos e mitocôndrias têm vários comprimentos (embora normalmente muito mais curto do que em neurônios e astrócitos 13 , 14 , 15).
    2. Coloque a célula de interesse no meio do campo de vista.
    3. Uso o " viver " função no software (para microscópios Zeiss e Leica) para identificar a célula na tela e escolha uma área de interesse, por exemplo, uma parte da célula que contém vários processos primários ou bainhas de mielina ou um único processo ou bainha de mielina.
      Nota: Para conseguir o máximo de processos/bainhas de imagem possível, escolher áreas contendo processos que põem relativamente plana na direção x-y.
    4. Ampliar o campo de interesse (normalmente, produzindo uma imagem com tamanho de pixel de 0,14 - 0,30 µm).
    5. Usando o " regiões " tool, desenhe um retângulo ao redor da área e escolha a opção para digitalizar apenas a região selecionada. Varredura de tempo e, portanto, exposição do laser, é reduzida pela verificação somente a região selecionada.
      Nota: Regiões retangulares horizontais serão digitalizadas mais rápido do que o verticais regiões devido ao menor número de linhas digitalizadas necessário. Se uma região retangular vertical é digitalizada, o tempo de digitalização pode ser reduzido, rodando o campo de verificação de 90º (usando a ferramenta de rotação).
  11. Poder de ajuste do laser e ganho para ter uma boa visão sobre mitocôndrias.
    Nota: Use o poder do laser mínimo necessário. Se possível, aumente o ganho ao invés de crescente poder do laser. Além de causar toxicidade celular, poder do laser muito alto irá branquear os objetos imagens ao longo do tempo, exigindo um novo aumento de potência do laser ou ganho durante a verificação. O poder do laser necessária e ganho dependerá do nível de expressão e o microscópio. Com um microscópio confocal LSM700, usamos um 555 nm laser com uma potência de 20-40 µW para imagem dsred ou tdtomato e um 488 nm do laser é usado em 20-30 µW a imagem GFP (medido na abertura traseira do objectivo de poder do laser). Ganho é definido alto para geração de imagens ao vivo, geralmente na faixa de 700-800 para as boas práticas agrícolas e 850-980 para dsred e tdtomato. O alto ganho pode causar algum ruído de fundo mais, que é removido, aumentando o deslocamento digital (deslocamento valores normalmente colocam entre 0 e 15). Em nossa experiência, usando o MBP_mito_GFP dá um melhor sinal-ruído do que MBP_mito_dsred.
    12. Velocidade de digitalização
  12. select.
    Nota: Minimizar o tempo de digitalização usando uma velocidade de digitalização rápida e desenhando-se uma pequena região de digitalização (ver ponto 4.10.5 abaixo). Também é possível salvar a digitalização tempo realizando uma varredura bidirecional. No entanto, isso não é recomendado devido à pior qualidade de imagem.
  13. Conjunto de frequência e duração da gravação de lapso de tempo, por exemplo, captura imagens em 2 segundos para um total de 20 minutos para a imagem latente mitocondrial em oligodendrócitos.
    Nota: A frequência e a duração devem ser definidas de acordo com a mobilidade dos objetos de interesse. Maior frequência irá expor o espécime para mais a luz do laser, mas mais rápido-mover objetos também exigem uma menor duração total de vídeos de lapso de tempo (por exemplo, as mitocôndrias nos neurônios, que se movem com mais frequência e em uma velocidade muito maior do que as mitocôndrias em oligodendrócitos, são tipicamente fotografada a cada segundo por um total de 2 minutos 16).
  14. Iniciar a gravação de lapso de tempo.
    Nota: O mitocôndria pode mover-se fora de foco e/ou deriva da região da imagem durante a gravação. Para minimizar as vibrações e movimento, ajuste em - e saídas de banho e reduzir a velocidade da bomba, se necessário. Pequenas mudanças em foco geralmente ainda ocorrem. Assim, o monitoramento contínuo da tela durante a imagem latente é necessária, com pequenos ajustes do foco durante a gravação.
  15. Captura uma z-pilha da célula inteira para futura identificação de célula e fotografada processo.
    Nota: Para melhor resolução, a pinhole deve ser reposto para 1 unidade arejada para a pilha de z.
  16. Opcional: Visualizar mielina imaculada.
    Nota: Em oligodendrócitos transformados com GFP (citoplasmática), das bainhas de mielina geralmente pode ser identificadas como linhas retas do citoplasma (as cristas citoplasmáticas) ligadas a um processo primário (ver Figura 2 A e B). No entanto, se a expressão de GFP é demasiado fraco ou um marcador citoplasmático não é usado, é possível visualizar a bainha de mielina por microscopia confocal de reflectância (núcleo), como explicado aqui.
    1. Configurar um novo caminho de luz no software com excitação do laser em 488 nm e captura emitida luz em torno do mesmo comprimento de onda, por exemplo, 470-500 nm.
    2. Ajustar poder laser e ganhar até mielina é visível (ver exemplo em < forte classe = "Xfig "> Figura 3). Usando um microscópio de LSM 510 Meta, normalmente usamos um poder do laser de 7-12 µW (medido na abertura traseira do objectivo).
  17. Opcional: elaboração de fatias de imunocoloração.
    1. Se a célula de imagem deve ser identificada após imunocoloração, capturar uma imagem de baixa ampliação (10x) da célula e indique sua localização na imagem desenhando uma seta ou similar. Para auxiliar a deteção da célula, recomenda-se também desenhar um mapa manual da fatia inteira, indicando a localização da célula.
    2. Fix fatia em paraformaldeído 4% (PFA) agitador por 1 hora em temperatura ambiente.
      Atenção: O PFA é prejudicial. Usar protectores e só usar um capuz ventilado.
    3. Diluir o fixador 01:10 em PBS e sai a 4 ° C até começando a imuno-histoquímica conforme descrito em outro lugar 17.
      Nota: Embora as fatias podem ser deixadas no fixador diluído por várias semanas, fluorescência pode desvanecer-se. Realização de imuno-histoquímica no prazo de 10 dias de fixação é recomendada.

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Resultados

Organotypic fatias de cérebro que foram cultivadas e transfectadas conforme descrito acima mostraram uma distribuição esparsa de oligodendrócitos corticais expressando mito_dsred e GFP. Imunocoloração com anticorpos contra Olig2 e MBP confirmou que a expressão era específica de oligodendrócitos (Figura 1).

Para geração de imagens ao vivo, oligodendrócitos transduzidos foram reconhecidos por sua morf...

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Discussão

O protocolo para fazer culturas de organotypic descritas aqui é uma versão modificada de18 do protocolo descrito por De Simoni e Yu (2006)5. As mudanças mais importantes foram esboçadas abaixo. Tampão Tris é adicionado ao meio de cultura, o que melhora a sobrevivência das fatias quando fora da incubadora durante a transdução viral e mudança do meio de célula. O procedimento de esterilização para confetti também mudou. Enquanto outros protocolos esterilize confetti em autocl...

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Divulgações

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen e Magnar Bjørås para acesso à célula de laboratório e equipamentos, pessoal de Janelia Biologia Molecular compartilhada recursos para a produção de vírus e do plasmídeo e Koen Vervaeke para obter assistência com medições de potência do laser. Este trabalho foi financiado pela Associação Norueguesa de saúde, Conselho Norueguês de pesquisa e os equipamentos de microscopia foi financiado pelo Norbrain.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose Sigma A9539
BD Microlance 19GBD301500Agulhas usadas para entrada e saída de gás
bioóxidomarca AGA105701
Sigma-AldrichZ615927Queimador de
Bunsen (queimador de propano líquido)VWR89038-530
Conjunto de cabos para controladores de aquecedorWarner Instruments64-0106Controlador de temperatura - parte do termômetro
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 para incubadora
Tampa de vidro, quadrada CorningThermo  Fischer Scientific13206778Para anexar sob o banho para imagens ao vivo. Sele com cola ou vaselina.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Pinça DelicadaFinescience11063-07Para dissecação
Caneta Diamond scriberTed Pella Inc.54463
Pipetas de vidro descartáveis Pasteur 230 mmVWR612-1702Pipetas de vidro
Lâmina de barbear de aço inoxidável de borda duplaElectron Microscopy Sciences#7200Lâmina de barbear para vibratomo
Solução salina equilibrada de Earle (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Círculos de papel de filtroSchleicher & Schuell300,220Papel de filtro usado para filtração de PFA
Fun tackLoctite1270884Use para conectar/ajustar a posição de entrada e saída no banho
Toalha de mão C-Fold 2Katrin344388
Harp, Plana para Câmara RC-41,Warner Instruments  64-1418Harpa para segurar confetes no banho. Corte os fios antes de usar com fatias organotípicas. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Modelo 1.2Heto-Holten96004000MCapuz de fluxo laminar
Soro de cavalo, inativado por calorGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR Membrane, PTFE, MilliporeFHLC0130Confete 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax com HEPESThermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro Colher Microscopia Heyman Tipo BMicroscopia Eletrônica Sciences62411-BEspátula pequena e arredondada com extremidade afiada para dissecção
Unidade de filtro Millex-GPMilliporeSLGPM33RASeringa Inserção
cultura de células Millicell, 30 mmInserçõesde cultura decélulas
Minipuls 3 Módulo de controle de velocidadeGILSONF155001Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte do módulo de controle (conecte ao cabeçote de dois canais)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon DeltaSurface Thermo  PlacadeCultura
Suspensão de NistatinaObjetivo Sigma-AldrichN1638
W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC Zeiss441452-9900-000 Objetiva de imersão em água usada para imagens ao vivo. (WD=2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldeído, granularElectron Microscopy Sciences#19208
Câmara de perfusão PC-RSiSkiYou  15280000EBanho para imagens ao vivo
Penicilina-Estreptomicina, líquidoInvitrogen15070-063
Placa de Petri 140 mm Heger1075Placa de Petri Grande 
Placa de Petri 92x16 mm Sarstedt 82.1473Placa de Petri média 
Placa de Petripequena de 55x14,2 mmVWR391-0868
Fosfato tamponado com solução salina (PBS)SigmaP4417PBS
comprimidos R2 Cabeça de dois canais GILSONF117800Bomba peristáltica para imagens ao vivo - Parte da cabeça de dois canais (requer módulo de controle)
Espátulas redondas/planas, aço inoxidávelVWR82027-528Espátula grande para dissecção
Papel de areiaVWRMMMA63119Opcional, para alisar pipetas de vidro quebrado
Tesoura,  17,5 cmFinescience14130-17Tesoura grande para dissecção
Tesoura, 8,5 Finescience14084-08Tesoura pequena e afiada para dissecação
Lâmina de gema de borda únicaElectron Microscopy Sciences#71972Lâmina de barbear de borda única
Aquecedor de solução única em linha SH-27BWarner Instruments64-0102 Controlador detemperatura - peça do aquecedor
Unidade de filtro Steritop-GP, 500 ml, 45mmde SCGPT05REMilliporepara esterilizar soluções
Super cola de precisãoLoctite1577386
lâmina de bisturi cirúrgico nº 22Swann Morton Ltd.de lâmina de bisturi arredondado209
TC324BWarner Instruments64-0100Controlador de temperatura para imagens ao vivo (requer aquecedor de solução e montagem de cabos)
Base TrizmaSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
incubadora jacketed água série IIForma Scientific78653-2882incubadora
de banho Lâmpadas de pipeta da Lâmpadas de pipeta Unidade de filtro de PICM03050 Millipore140675 Fischer Scientific Filtro Controlador de temperatura

Referências

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

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