Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.
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Artigo de método
Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Avanços na fluorescente microscopia e biologia celular são intimamente correlacionados, com a maior capacidade de Visualizar eventos celulares, muitas vezes levando a saltos dramáticos na nossa compreensão de como as células função. O desenvolvimento e a disponibilidade de microscopia de super-resolução ampliou consideravelmente os limites de resolução óptica de ~ 250-20 nm. Os biólogos não estão mais limitados para descrever interações moleculares em termos de colocalization dentro de uma área de difração limitada, prefiro agora é possível visualizar as interações dinâmicas de moléculas individuais. Aqui, nós esboçamos um protocolo para a visualização e a quantificação de proteínas celulares por microscopia de depleção do estado fundamental para a imagem latente de celular fixo. Nós fornecemos exemplos de duas proteínas de membrana diferentes, um elemento de um membrana plasmática-localizada voltagem-dependente tipo L Ca2 + canal (CaV1.2), o retículo endoplasmático translocon e sec61β. Discutidos são os parâmetros específicos do microscópio, métodos de fixação, foto-interruptor formulação da reserva e armadilhas e desafios de processamento de imagem.
Introdução
Reações de sinalização celulares traduzem mudando ambientes internos e externos para iniciar uma resposta celular. Eles regulam todos os aspectos da fisiologia humana, servindo como base para o hormônio e liberação de neurotransmissores, o batimento cardíaco, visão, fertilização e função cognitiva. Interrupção destas cascatas de sinalização pode ter consequências graves na forma das condições fisiopatológicas, incluindo a doença de Alzheimer, Parkinson e câncer. Durante décadas, biológicos e médicos investigadores usaram com sucesso proteínas fluorescentes, sondas e biosensores juntamente com microscopia de fluorescência, como as principais ferramentas para compreende....
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Protocolo
1. lavar as lamelas de vidro
- o dia antes do processamento da amostra, limpar as lamelas de vidro #1.5 pelo sonicating em uma solução 1 M de KOH por 1h. Isso remove qualquer fluorescentes contaminantes que possam estar presentes nas lamelas.
- Enxaguar o KOH das lamelas com água desionizada.
- Uma vez que limpou em KOH, armazenar as lamelas em etanol a 70% até estar pronto para usar.
2. As lamelas de vidro revestimento
Nota: as etapas nesta seção devem ser executadas em uma capa de cultura de células para evitar a contaminação.
- Use a pinça p....
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Resultados
Conforme documentado na introdução, há muitos microscopia de super-resolução diferentes modalidades de imagem. Este protocolo, centra-se na imagem de super-resolução GSD. Imagens representativas e mapas de localização são mostrados na Figura 2 e Figura 3.
A Figura 2 mostra uma célula de COS-7 transfectada com o ER proteína, mCherry-Sec61β e.......
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Discussão
A recente explosão de tecnologias que permitem a geração de imagens para além do limite de difração ofereceram novas janelas para as complexidades da pilha mamífera sinalização no espaço e no tempo. Essas tecnologias incluem tempestade, STED, PALM, GSD, SIM e suas variantes (por exemplo, dSTORM, FPALM). A engenhosidade dos cientistas por trás destas técnicas permitiu-nos contornar as limitações impostas pelas leis da física que regem a difração de luz. Apesar desta grande realização, cada uma destas técnicas faz.......
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Divulgações
Os autores têm sem interesses concorrentes para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma concessão da AHA a R.E.D (15SDG25560035). Autores gostaria de reconhecer o Dr. Fernando Santana para uso do microscópio Leica SR GSD 3D e Dr. Johannes Hell para gentilmente fornecendo o anticorpo FP1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | Para limpar a lamínula |
| #1.5 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | Para células de crescimento/processo/imagem |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Diluir para 1x com água desionizada |
| Poli-L-Lisina | Sigma | P4832 | Auxilia na adesão celular à laminina |
| de vidro de coberturaSigma | 114956-81-9 | Auxilia na adesão celular ao vidro de cobertura | |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Meios de cultura de miócitos ventriculares |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Meios de cultura celular |
| Soro fetal bovino (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Suplemento de mídia |
| Penicilina/estreptomicina | Sigma | P4333 | Mídia suplemento |
| 0,05% tripsina-EDTA | Corning | 25-052-CL | Solução de cultura celular |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Reagente de transfecção transitória |
| Ca2+-livre PBS | Gibco | 1419-144 | Cultura celular |
| 100% Metanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Fixação de células |
| Paraformaldeído | Elétron Microscopia Sciences | 15710 | Fixação Celular |
| Glutaraldeído | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Fixação Celular |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA ou outras alternativas de solução de bloqueio existem |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergente para permeabilizar células |
| Coelho anti-CaV1.2 (FP1) | Presente | N/A | Existem anticorpos anti-CaV1.2 comerciais, como Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Anticorpo primário |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Anticorpo secundário |
| Alexa Fluor 568 cabra anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Anticorpo secundário |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | Previne o crescimento microbiano para armazenamento a longo prazo de amostras |
| Catalase | Sigma | C40 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| Glicose oxidase | Sigma | G2133 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| Tris | Sigma | T6066 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| cloridrato de beta-mercaptoetilamina | Fisher | BP2664100 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| β-mercaptoetanol | Sigma | 63689 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Ingrediente tampão de fotocomutação |
| Dextrose | Fisher D14-212 | Ingrediente tampão de fotocomutação | |
| Depressão de vidro slides | Neolab | 1 - 6293 | Para montar amostras |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | Para selar a lamínula |
| sec61β - plasmídeo mCherry | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD microscópio 3D | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Solução | 20 % SEAblock em PBS | ||
| Solução de incubação | 0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, em PBS | ||
| Solução de incubação | de anticorpos secundários1:1000 em PBS |
Referências
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G.
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Reimpressões e permissões
