Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

Resumo

Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.

Resumo

O ensaio de baseada em célula livre de rótulo é vantajoso para estudos bioquímicos por causa disso não requer o uso de animais experimentais. Devido à sua capacidade para fornecer informações mais dinâmicas sobre células sob condições fisiológicas do que ensaios bioquímicos clássicos, este ensaio de célula livre de rótulo em tempo real com base no princípio da impedância elétrica está atraindo mais atenção durante o passado década. No entanto, sua utilização prática pode ser limitada devido ao custo relativamente caro de medição, no qual caro consumível descartável ouro "microchips" é utilizados para o analisador de célula. Neste protocolo, temos desenvolvido uma estratégia geral para regenerar a matriz microeletrodos ouro equipados para um analisador de célula livre de etiqueta comercial. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, lavagem com etanol e água e uma etapa de fiação. O método proposto foi testado e demonstrou ser eficaz para a regeneração e o uso repetido de placas eletrônicas comerciais pelo menos três vezes, que ajudará pesquisadores salvar sobre o alto custo de execução dos ensaios de celular em tempo real.

Introdução

Devido ao seu eficiente e menos trabalhoso processo experimental, tecnologia livre de etiqueta baseada em célula tem testemunhado o rápido crescimento na última década para fins analíticos, bem como seleção, tais como no aspecto da proteômica^1,2 , drogas entrega³, etc.^4,5 comparado com métodos bioquímicos tradicionais destinadas a análise de células, ensaio de pilha rótulo livre em tempo real com o protótipo desenvolvido pela Giaever e colegas de trabalho anteriormente⁶ é baseado no princípio de ....

Protocolo

Nota: em geral, o processo de regeneração inclui digestão de tripsina e a etapa de lavagem com água e etanol. O tempo de digestão muda de acordo com o número de células utilizadas e o tipo e o número de células utilizadas podem variar dependendo os fins experimentais. É aconselhável verificar os microchips regenerados usando métodos ópticos e eletroquímicos para otimizar as condições de regeneração. Durante o experimento, solúveis e insolúveis químicos podem estar envolvidos, e aqui estes dois casos típicos dos processos de regeneração são detalhados.

1. preparação de soluções de regeneração

Nota: Preparar e lidar ....

Resultados

Propriedades de superfície de microchips de ouro: os procedimentos de regeneração utilizados neste protocolo foram descritos na Figura 1. A Figura 2 mostra o microscópico fotos do fresco de superfície e regenerado placas eletrônicas por microscópio óptico. Como mostrado na Figura 2A e Figura 2, microscópicos observações indicam que hou.......

Discussão

Estamos resumidos diversos métodos disponíveis^{17,23,24,25,26} para regenerar microchips no quadro 1. Basicamente, esses métodos envolveram relativamente duras condições experimentais para alcançar a regeneração completa de chips por causa da presença de interações de molécula-molécula forte como a do complexo imune usado para chips SPR. No enta.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
camundongo anti-rato CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1.000; Coloração: 1:500
Cabra policolônica anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Coloração: 1:500
Coelho policlonal anti-Ki67	Abcam	Cat # AB15580	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Coloração: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Coloração: 1:500
Triton-X (detergente na coloração ICC)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfato	Galen Suprimentos de Laboratório	Cat# GAG-HS01
Heparina	Sigma	Cat# M3149
Peptona de sólidos do leite	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Colesterol de lã ovina	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Colágeno IV	Corning	Cat# 354233
Ácido oleico	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Tripsina	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicilina/ Estreptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamina	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetilcisteína	Sigma	Cat# A9165
Insulina	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrina	Sigma	Cat# T1147
Selenito de sódio	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (glicose alta)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poli-D-lisina	Placas Primaria Sigma	Cat# A-003-E
	VWR	Cat# 62406-456
Reagentes de estoque	reconstituição	Concentração usada	Armazenamento
Apo-transferrina	10 mg/mL em PBS	1:100-20	° C
N-acetilcisteína	5 mg/mL em H2O	1:1.000-20	° C
Selenito de sódio	2,5 mg/mL em H2O	1:25.000-20	° C
Colágeno IV	200 μ g/mL em PBS	1:100-80	° C
TGF-b2	20 μ g/mL em PBS	1:10,000-20	° C
IL-34	100 μ g/mL em PBS	1:1.000-80	° C
Colesterol de lã ovina	1,5 mg/mL em 100% de etanol	1:1.000-20	° C
Sulfato de heparano	1 mg/mL em H2O	1:1.000-20	° C
Ácido oleico/ácido gondóico	gondóico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL em 100% de etanol	1:1.000-20	° C
Heparina	50 mg/mL em PBS	1:100-20	° C
Solutions	Receita		Comentários
Tampão de Perfusão	50 μ g/mL de heparina em DPBS++ (PBS com Ca++ e Mg+ +)		Use quando estiver gelado
Tampão de Douncing	200 μ L de 0,4% DNaseI em 50 mL de DPBS++		Use quando estiver gelado
Panning Buffer	2 mg/mL de peptona de sólidos do leite em DPBS++
Microglia Meio de crescimento (MGM)	DMEM/F12 contendo 100 unidades/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μ g/mL de N-acetilcisteína, 5 μ g/mL de insulina, 100 μ g / mL de apo-transferrina e 100 ng / mL de selenito		Use MGM gelado para retirar a microglia do prato de immnopanning.
Revestimento de Colágeno IV	MGM contendo 2 μ g/mL de colágeno IV
Tampão de separação de mielina	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sem Ca++ e Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2		Misture bem após a adição de  CaCl2 e MgCl2
TGF-b2/IL-34/Meios de crescimento contendo colesterol (TIC)	MGM contendo 2 ng/mL de TGF-b2 humano, IL-34 murino de 100 ng/mL, 1,5 μ g/mL de colesterol de lã ovina, 10 μ g / mL de sulfato de heparano, 0,1 μ g/ml de ácido oleico e 0,001 μ g/ml de ácido		Certifique-se de adicionar colesterol ao meio aquecido a 37 & C e não adicione mais de 1,5 μ g/mL ou precipitará. Não filtre meios que contenham colesterol. Equilibre o meio TIC com 10% de CO2 por 30 min- 1 hora antes de adicionar às células para garantir o pH ideal.