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RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

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DOI:

10.3791/56251

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8 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

Neste artigo

Resumo

Um protocolo experimental é apresentado para avaliação do solo cultivado sistemas de raiz de planta com RGB e geração de imagens hiperespectrais. Combinação de tempo de imagem RGB série com informações quimiométricas de hiperespectrais verifica otimiza insights sobre a dinâmica de raiz da planta.

Resumo

Melhor entendimento da dinâmica de raiz da planta é essencial para melhorar a eficiência de utilização de recursos de sistemas agrícolas e aumentar a resistência das cultivares safra contra estresses ambientais. Um protocolo experimental é apresentado para RGB e imagem hiperespectral de sistemas da raiz. A abordagem utiliza rhizoboxes, onde plantas crescem no solo natural ao longo de um tempo maior para observar sistemas totalmente desenvolvidos de raiz. Configurações experimentais são exemplificadas pela avaliação rhizobox plantas sob estresse hídrico e estudar o papel das raízes. Uma configuração de imagem RGB é descrita para a quantificação de barata e rápida de desenvolvimento radicular ao longo do tempo. Imagens hiperespectrais melhora a segmentação de raiz do fundo solo comparado a limiarização de cor com base em RGB. A força especial de imagens hiperespectrais é a aquisição de quimiométricas informações sobre o sistema de raiz-solo para entendimento funcional. Isso é demonstrado com mapeamento conteúdo de água de alta resolução. Imagem espectral, no entanto, é mais complexa na aquisição de imagens, processamento e análise em comparação com a abordagem RGB. Uma combinação de ambos os métodos pode otimizar uma avaliação abrangente do sistema raiz. Exemplos de aplicações, integração de raiz e características na superfície são dadas para o contexto da pesquisa fisiológica fenotipagem e planta de planta. Reforço da imagem latente de raiz pode ser obtido através da otimização de qualidade de imagem RGB com melhor iluminação usando diferentes fontes de luz e, por extensão, dos métodos de análise de imagem para inferir sobre propriedades de zona raiz de dados espectrais.

Introdução

Raízes fornecem várias funções essenciais para as plantas tais como armazenamento de assimila, fixação de plantas terrestres no solo e a absorção e o transporte de água e nutrientes1. Do ponto de vista evolutivo, a formação dos eixos de raiz é considerada uma condição fundamental para a origem da terra plantas2. Apesar deste importante papel, historicamente raízes ocuparam apenas uma posição marginal na pesquisa biológica. Em tempos mais recentes, no entanto, existe uma crescente interesse científico em sistemas de raiz de planta como evidenciado na Figura 1.

figure-introduction-1
Figura 1: Relevância de estudos de raiz em Ciências de planta.
Número de raiz relacionados com estudos como uma porcentagem de todos os estudos de planta publicada em revistas do SCI nas últimas décadas. Pesquisar resultado da Scopus usando palavras-chave "planta" e "planta e raiz". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dois principais motivos podem ser a hipótese de fundamentam os recentes avanços na pesquisa de raiz. Vegetação terrestre, primeira é exposta a estresses ambientais mais frequentes, como resultado da mudança global3. No contexto da produção de culturas agrícolas estima-se que globalmente cerca de 30% da área agrícola são limitados por água e fósforo4,5. Redução do estresse de colheitas são uma razão principal para rendimento significativas lacunas que são estimados globalmente em menor 50% da produtividade potencial de sequeiro agro-ecossistemas6. Além de disponibilidade de recursos baixos, isso também está relacionado à eficiência de uso recurso pobre, ou seja, insuficiente capacidade de uma planta para explorar os recursos disponíveis7. Isso resulta em perdas de recursos móveis, tais como o nitrato, que pode afetar negativamente a outros ecossistemas. Por exemplo, a eficiência de uso de nitrogênio global atual é estimada em 47%8. Usar o recurso melhor eficiência através de métodos de melhoria da gestão e cultivares, portanto, de grande importância para ambos sustentado crescimento dos produtos agrícolas, bem como para a sustentabilidade ambiental. Nesta fábrica de contexto raízes são consideradas para ser um alvo chave para melhoria de culturas e cultivo sistemas9,10.

Um segundo fundo importante para o interesse recente em raízes de plantas é o avanço tecnológico nos métodos de medição. Métodos raiz tempo tem sido restrito pelos dois principais desafios: para medição de raízes de plantas que crescem no solo, eles tiveram que ser isolados para quantificação, principalmente lavando11, perturbando o arranjo arquitectónico dos eixos de raiz. Observação de raiz in situ utilizando escavação métodos, conservando assim a localização natural das raízes no solo, têm sido utilizados para descrição botânica12. Ainda são muito demorados e, portanto, não atende aos requisitos de taxa de transferência de análise comparativa estrutural-funcional sistema de raiz. Por outro lado elevado-throughput métodos para medição de arquitectura de raiz foram feitos principalmente em meios artificiais e para mudas de plantas13 onde a extrapolação para o ambiente natural de crescimento das plantas é questionável14.

O crescimento recente da investigação de raiz é fortemente ligado ao avanço em métodos15por imagens. Abordagens em estudos de raiz de imagem aproximadamente pode ser agrupado em três tipos. Primeiro, existem métodos 3D de alta resolução como CT e MRI16. Esses métodos são mais adequados para estudar processos de interação das raízes de plantas com o solo, tais como secas induzidas pelo xilema embolia17. Normalmente são aplicados à comparativamente pequenas amostras onde eles permitem observações detalhadas. Uma comparação de CT e MRI para potes de diferente tamanhos e raiz fina imagem é fornecida em18. Em segundo lugar, há elevado-produção de imagem métodos19,20. Esses métodos são na maior parte com base em comum 2D RGB imagens de raízes crescendo em meios artificiais (gel, papel de germinação) onde o alto contraste permite comparativamente simples dissecação entre raízes e plano de fundo. Eles são adequados para a comparação de alta taxa de transferência entre os traços de raiz de mudas de genótipos diferentes culturas sob padronizada artificial crescente condições13. Entre essas duas abordagens são métodos rhizobox: eles usam imagens 2D de raízes crescendo no solo por longo período de tempo e tem taxa de transferência média21,22. Um desafio recente para imagem (2D) raiz é capturar também indicadores de funcionalidade de raiz, além da descrição da estrutura23.

No presente trabalho, apresentamos os protocolos experimentais para rhizobox crescido sistemas de raiz, usando (i) uma barata e simples feito por RGB de imagem (ii) um mais complexo NIR imagem instalação e imagem. Resultados de exemplo obtidos a partir destas duas configurações são mostrados e discutidos no contexto da planta fenotipagem e Plante a pesquisa fisiológica.

Protocolo

1. Caixas radiculares para crescimento de plantas

OBSERVAÇÃO: O sistema experimental utiliza caixas radiculares para cultivar plantas destinadas à obtenção de imagens das raízes. Primeiro, são descritos o design das caixas e o substrato utilizado, seguidos dos detalhes sobre o procedimento de preenchimento.

  1. Projeto das caixas radiculares
    1. Construa caixas radiculares (Figura 2) com uma placa traseira e estruturas laterais feitas de PVC cinza com espessura de 15 mm. Utilize um tamanho de caixa de 300 mm x 1000 mm. Para a janela frontal, use vidro mineral de 6 mm, fixado à estrutura de PVC por trilhos metálicos parafusados nas paredes laterais.
    2. Construa três furos na estrutura inferior para permitir o drenamento de água em excesso. Esses furos podem ser opcionalmente fechados com parafusos de plástico.
    3. Antes do preenchimento, ajuste o diâmetro interno da caixa radicular (entre 10 mm e 30 mm) inserindo chapas de policarbonato alveolar. Recomenda-se um espaço interno de 10 mm para a maioria das culturas, a fim de reduzir o peso (o peso da caixa radicular sem solo é de 13,2 kg) de todo o sistema.

Diagrama da estrutura da parede com PVC, vidro, folhas alveolares; design de drenagem; dimensões indicadas.
Figura 2: Sistema experimental de caixa de rizosfera e seus componentes.
A figura à esquerda mostra as dimensões de uma caixa de rizosfera e a figura à direita mostra seus componentes individuais, sendo uma placa traseira de PVC cinza com estrutura lateral, um vidro mineral frontal, folhas alveolares para diâmetro interno variável e cantoneiras metálicas para fixar o vidro frontal ao compartimento traseiro. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

  1. Substrato
    1. Encha as caixas radiculares com solo de campo (para este experimento: solo superficial franco-argilo-arenoso de um chernozem calcáreo) peneirado para um tamanho de partícula de 2 mm.
    2. Abra as caixas radiculares para preencher o compartimento interno (placa traseira com molduras laterais) na posição horizontal, utilizando substrato pré-umedecido. Encha na horizontal para evitar estratificação e segregação entre partículas finas e grossas, o que ocorre ao encher na posição vertical despejando o substrato pela abertura superior.
    3. Pré-umedeça o substrato antes do enchimento. Dependendo do tipo de substrato (especialmente do teor de silte e argila), não exceda um teor de água de 0,12–0,18 cm3*cm-3 para evitar amolgamento e degradação da estrutura. Adicione a diferença entre o teor de água da pré-mistura e o teor alvo após o enchimento do substrato nas caixas radiculares.
      NOTA: O enchimento com substrato (secado em estufa) seco e a subsequente adição de toda a água não é recomendado, pois pode resultar em forte acomodação do substrato e formação de grandes rachaduras.
  2. Exemplo passo a passo do enchimento
    1. Defina o teor de água alvo. Aqui, ele é inicialmente definido em 80% da água disponível para a planta (PAW), condição em que as plantas não sofrem com deficiência hídrica.
    2. Determine a capacidade de campo (FC) e o ponto de murcha permanente (PWP) do substrato. Aqui, obtenha a FC usando um tubo de PVC de altura equivalente (100 cm) ao das caixas radiculares.
      1. Feche a extremidade inferior do tubo com um tampão contendo pequenos orifícios de drenagem, adicione 1 cm de cascalho para evitar o entupimento dos orifícios pelas partículas finas do substrato e preencha o substrato com a mesma densidade aparente utilizada nas caixas radiculares (1,3 g cm-3).
      2. Sature o tubo com água até ocorrer drenagem e deixe em repouso por dois dias para equilíbrio (o teor de água resultante é, por definição, equivalente à capacidade de campo), cobrindo a abertura superior com filme plástico para evitar evaporação. O valor de capacidade de campo alcançado para o solo neste experimento foi de 0,357 cm3 cm-3.
        NOTA: O teor de água no PWP deve ser conhecido previamente por métodos físicos padrão do solo (por exemplo, medições com placa de pressão24) ou por funções pedotransferidas baseadas na textura25. Aqui, é igual a 0,12 cm3 cm-3 para o solo utilizado.
      3. Se a FC também for medida por extração com placa de pressão, utilize o teor de água em um potencial matricial de h = -100 hPa e não h = -330 hPa, a fim de corresponder à geometria da caixa radical (altura de 100 cm = 100 hPa).
      4. Calcule o teor de água (WC) a 80% da PAW: WC (cm3 cm-3) = 0,80 (FC - PWP) + PWP. Para os limites hidráulicos do solo usado aqui, obtém-se um teor volumétrico de água de 0,31 cm3 cm-3 a 80% da PAW.
      5. Calcule a quantidade de água para um volume de caixa radical de 2850 cm3 (30 cm de largura, 1 cm de espaço interno, 95 cm de altura, mantendo os 5 cm superiores livres de substrato para irrigação). Isso resulta em um volume de água de 883,5 cm3, equivalente a 883,5 g, considerando a densidade da água de 1,0 g cm-3 a 20 °C.
    3. Defina a densidade aparente (db) para o enchimento das caixas radiculares. Aqui, definida como 1,3 g cm-3, valor típico encontrado em solos agrícolas de campo. A quantidade de substrato seco necessária para preencher um volume de caixa radical de 2850 cm3 nessa db equivale a 3705 g de solo seco.
    4. Pré-umedeça o solo seco até um teor gravimétrico de água de 0,108 g g-1 (equivalente a um teor volumétrico de água de 0,14 cm3 cm-3) adicionando 400 g de água a 3705 g de solo seco e misture suavemente para obter uma distribuição homogênea de água. Desagregue manualmente os torrões maiores para manter o tamanho das partículas ≤ 2 mm.
    5. Encha o solo pré-umedecido nas caixas radiculares abertas e compacte suavemente utilizando uma chapa de poliestireno (30 x 10 x 1,5 cm) para cobrir o volume interno da caixa, resultando assim em uma db homogênea de 1,3 g cm-3.
    6. Adicione a quantidade restante de água (483,2 g) para atingir o teor de água alvo de 0,31 cm3 cm-3 pulverizando sobre a superfície com um borrifador. Assegure gotas pequenas para evitar degradação da estrutura superficial e umedecimento homogêneo. Mantenha a caixa sobre uma balança durante a pulverização para monitorar a quantidade real de água adicionada ao substrato.
    7. Deixe a água redistribuir por 10 minutos e, em seguida, pressione o vidro contra a superfície e fixe-o com os trilhos metálicos laterais. O peso final médio das caixas radiculares com substrato umedecido foi de 17818 ± 68 g (13230 g de peso da caixa radical + 3705 g de solo seco + 883 g de água).
      NOTA: O teor homogêneo de água colocado nas caixas horizontais se redistribuirá quando as caixas forem colocadas em sua posição final, de acordo com o gradiente potencial resultante. Este é um processo físico em todos os vasos de crescimento de plantas, conforme sua geometria (altura), e os pesquisadores devem estar cientes da hidráulica dos vasos26.

2. Configuração da câmara climática

  1. Equipe a câmara climática (Figura 3) com 8 lâmpadas de LED que forneçam iluminação homogênea de 450 μmol m-2 s-1, com picos espectrais em 440 (azul) e 660 (vermelho) nm, para crescimento ideal das plantas.

Diagrama do experimento de estresse em plantas; configuração de LED, estação meteorológica, condutância estomática, gráfico de déficit de vapor.
Figura 3: Câmara climática com rizocaixas para experimento de estresse.
(A) Visão lateral da câmara inteira com iluminação por LED, estação meteorológica e PC (aqui usado para registrar higrômetros foliares); vista direita com close-up do estrado metálico que sustenta as rizocaixas em inclinação de 45 ° e placas de madeira utilizadas para proteger a janela de vidro das rizocaixas da incidência de luz. (B) Experimento de estresse com beterraba sacarina, combinando quatro estágios com estresse devido à demanda atmosférica diferente (alta/baixa) e disponibilidade de água no solo (alta/baixa). As barras verdes da condutância estomática média indicam a resposta das plantas ao estresse. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

  1. Defina os parâmetros ambientais de acordo com as necessidades da planta ou do experimento. Aqui, utilize 14 horas de luz e 10 horas de escuro para a iluminação. Durante o estabelecimento da planta e antes do início dos tratamentos de estresse, ajuste a temperatura para 20° C durante o dia e 15° C durante a noite e mantenha a umidade relativa em 50 ± 8%.
  2. Posicione as caixas radiculares em uma inclinação de 45° utilizando uma estrutura metálica adequada. Isso maximiza o crescimento radicular em direção à superfície de vidro devido à gravitropismo.
  3. Cubra a janela de vidro com uma placa de madeira para manter a zona radicular no escuro e evitar o crescimento de algas causado pela penetração de luz através da superfície de vidro.

3. Configuração e tratamentos do exemplo com beterraba sacarina

  1. Pré-germinar sementes de beterraba sacarina em papel de filtro úmido por três dias a 20 °C em incubadora até a emergência da radícula. Isso garante o plantio com plantas viáveis.
    NOTA: A pré-germinação não é necessária para plantas com alta vigor de germinação, evitando assim o risco de danificar a radícula no momento do plantio. Para sementes de beterraba sacarina com pericarpo espesso, entretanto, o risco de sementes não viáveis é alto e a pré-germinação acelera significativamente a emergência da radícula em comparação com o plantio direto no solo.
  2. Faça um pequeno furo com cerca de 1,5 cm de profundidade no centro da caixa radicular com uma chave de fenda, posicione uma semente com pinça com a radícula orientada para baixo e próxima à janela de vidro (isso melhora a visibilidade inicial) e cubra-a suavemente com solo.
  3. Adicione uma camada de 0,5 cm de cascalho fino (2-4 mm) sobre o solo para proteger os agregados do solo da desagregação durante a irrigação e reduzir as perdas por evaporação. Para facilitar a emergência, mantenha a superfície do solo livre de cascalho na região onde a semente foi posicionada.
  4. Adicione 10 g de água para melhorar o estabelecimento.
  5. Durante o estabelecimento e o crescimento inicial, até o início dos tratamentos experimentais de estresse, irrigue as caixas radiculares a cada 2-4 dias para manter o teor inicial de umidade de 80% PAW.
    1. Determine a quantidade de água de irrigação necessária pesando as caixas radiculares e adicionando água até atingir o peso inicial de cada caixa individual. Para irrigação manual, use uma pipeta para evitar a degradação da estrutura superficial durante a rega.
  6. Organize as caixas radiculares de acordo com o delineamento estabelecido na câmara climática. O protocolo descrito aqui baseia-se em um experimento com seis cultivares de beterraba sacarina em cinco repetições, em delineamento completamente casualizado (DCC).
    1. Reposicione as caixas radiculares cada vez que forem retiradas do suporte metálico para pesagem e irrigação. Isso evita quaisquer efeitos de heterogeneidade residual (luminosa) dentro da câmara climática.
  7. Defina o momento de início dos tratamentos de estresse e o tipo de estresse. As seguintes condições (Figura 4) são utilizadas aqui.
    1. Inicie as medições no estádio BBCH 15 (cinco folhas desdobradas), com raízes cobrindo cerca de 75% da profundidade da caixa radicular e a copa suficientemente desenvolvida para medições nas folhas. Mantenha cada estádio por pelo menos três dias para garantir a adaptação às novas condições e realizar as medições.
    2. Para observações sem estresse, mantenha as condições iniciais com umidade ótima do solo (80% PAW) e condições ambientes (20°C/15°C de temperatura, 50 ± 8% de UR), resultando em um déficit de pressão de vapor diurno (DPV) de 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figura 3 C).
    3. Aumente a demanda atmosférica para um DPV diurno de 2,45 ± 0,4 kPa elevando a temperatura para 27°C/20°C e reduzindo a UR para 35%, mantendo a umidade do solo em 80% PAW.
    4. Posteriormente, seque as caixas radiculares até 40% PAW, equivalente a um teor de água de 0,215 cm3 cm-3, suspensando a irrigação. Restabeleça as condições ambientes iniciais com baixa demanda atmosférica (DPV de 1,28 kPa).
    5. Combine os estresses aumentando a demanda atmosférica para um DPV de 2,45 kPa e mantenha a umidade do solo em 40% PAW.

4. Métodos de imagem de raízes

  1. Combine métodos de imagem para aproveitar suas respectivas vantagens e com base nas informações desejadas.
    1. Utilize imagens RGB na faixa do visível (VIS) para acompanhar o crescimento, arquitetura e morfologia radicular ao longo do tempo, o que implicitamente exige medições frequentes. As vantagens da imagem RGB são: (i) baixo custo, (ii) aquisição rápida de imagens, (iii) baixa demanda de espaço em disco rígido (tamanho da imagem: 48 MB) e (iv) alta resolução (3648 x 5472 pixels).
    2. Utilize a imagem hiperespectral (HSI) na faixa do infravermelho próximo (NIR) quando forem necessárias características quimiométricas da raiz e do solo. As vantagens são: (i) características espectrais para segmentação entre raízes e fundo do solo e (ii) acesso a propriedades físico-químicas do sistema (por exemplo, teor de água do solo, idade da raiz). As desvantagens são: (i) tempo maior de varredura (cerca de 16 minutos por caixa radicular), (ii) grande volume de dados (13,7 GB por imagem da caixa radicular), (iii) resolução mais baixa da câmera NIR (320 x 256 pixels) e (iv) maior complexidade na análise dos dados.
  2. Imagem RGB de raízes
    1. Utilize uma caixa de imagem (Figura 4) que proteja da luz ambiente e fixe a posição da câmera, composta por uma estrutura metálica com largura de 1 m e altura de 1 m, com paredes laterais revestidas com chapas de prensado. Na extremidade frontal, fixe a câmera em duas posições a uma distância de 80 cm da caixa radicular.
      1. Fixe uma fita métrica na estrutura da caixa radicular com fita adesiva transparente e posicione a caixa radicular no suporte da caixa de imagem.
      2. Ilumine a caixa radicular utilizando quatro tubos fluorescentes de 24 W fixados a uma distância de 80 cm da caixa radicular. Além disso, instale quatro tubos UV de 15 W a 20 cm da caixa radicular como iluminação alternativa, aproveitando a auto-fluorescência da raiz em caso de baixo contraste entre a raiz e o fundo do substrato (colorido).
      3. Tire duas imagens (posição superior e inferior) para cobrir a metade superior e inferior de uma caixa radicular, com uma sobreposição de cerca de 3 cm.
    2. Adquira imagens RGB com uma câmera digital de lente única reflex (DSLR), fixada por placas de liberação rápida nas respectivas posições da caixa de imagem.
      1. Utilize as seguintes configurações ao usar os tubos fluorescentes. Adapte essas configurações de exemplo a quaisquer alterações nas dimensões, iluminação ou modelo da câmera.
        1. Desative o foco automático e o estabilizador na objetiva da câmera. Configure a câmera no modo manual.
        2. Defina a sensibilidade ISO para 500. Defina a velocidade do obturador para 13. Defina a abertura para 5,6.
        3. Desative o travamento do espelho. Defina o balanço de branco para Balanço Automático de Branco.
      2. Utilize as seguintes configurações para iluminação com tubos UV:
        1. Desative o foco automático e o estabilizador na objetiva da câmera. Configure a câmera no modo manual.
        2. Defina a sensibilidade ISO para 1000. Defina a velocidade do obturador para 13. Defina a abertura para 5,6.
        3. Desative o travamento do espelho. Defina o balanço de branco para Fluorescência.
    3. Combine as imagens RGB das partes superior e inferior da caixa radicular em uma única imagem usando um editor de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop). Utilize a fita métrica na estrutura lateral das caixas radiculares e verifique os objetos sobrepostos (raízes e características do solo).
      1. Copie as duas imagens separadas, cada uma com tamanho de 3648 x 5472 pixels, para um novo arquivo de tamanho 3648 x 10944 pixels com fundo branco.
      2. Reduza a opacidade da camada de uma das imagens para 60% e alinhe as partes sobrepostas das imagens (fita métrica, objetos). Em seguida, restaure a opacidade da camada para 100%.
      3. Com base na régua presente na imagem, adicione duas linhas vermelhas de exatamente 1 cm ao topo da imagem, em uma região sem raízes. Essas linhas serão usadas posteriormente na análise da imagem para dimensionar corretamente as medidas de comprimento.
      4. Combine todas as camadas e remova as partes da imagem fora da janela preenchida com solo, utilizando a ferramenta de recorte.
      5. Salve a imagem como arquivo TIFF para análises posteriores.
      6. No caso de imagens com iluminação UV, reduza as cores para tons de cinza antes de salvar, utilizando a barra de ferramentas Ajustes-Preto e Branco e selecionando o filtro predefinido Alto Contraste Azul.
    4. Para segmentação entre raízes e fundo do solo, bem como para quantificação de características radiculares de interesse (por exemplo, comprimento, superfície, diâmetro, ramificação), utilize qualquer software de análise de raízes (consulte www.plant-image-analysis.org para ferramentas disponíveis). Neste caso, utiliza-se o WinRhizo.
      1. Abra a imagem TIFF da caixa radicular no software.
      2. Calibre a escala de comprimento da imagem utilizando as barras de escala adicionadas à imagem.
      3. Selecione Baseado na Cor no menu Análise, escolhendo Distinção entre Raiz e Fundo.
      4. Defina um arquivo de calibração com classes de cor correspondentes a raízes e solo (fundo). Para as imagens de exemplo utilizadas aqui (cf. Figura 8), definem-se três classes de cor para raízes (laterais velhas, laterais jovens, raiz principal) e três classes de cor para o solo.
      5. Para imagens em tons de cinza (iluminação UV), selecione (i) Baseado em níveis de cinza e (ii) Raiz Clara sobre Fundo Preto no menu Distinção entre Raiz e Fundo e utilize um limiar de intensidade Lagarde local para segmentação.
      6. Abra um arquivo de dados onde os resultados serão salvos.
      7. Execute a análise e posteriormente verifique se há regiões (por exemplo, nas bordas) mal classificadas. Nesse caso, defina uma região de exclusão e reinicie a análise. Para raízes não classificadas, adicione classes de cor adicionais e reinicie a análise. Para elementos classificados incorretamente como raízes, ative/aumente as opções de filtragem Detritos e Bordas Irregulares.

Configuração de imagem de planta com lâmpadas UV e halógenas; suporte para caixa radicular, suportes para câmera para análise de raiz e dossel.
Figura 4: Caixa de imagem para aquisição de fotos RGB de caixas radiculares.
Vista esquerda do lado frontal onde as caixas radiculares são fixadas para imageamento com fontes de luz no interior; vista direita do lado traseiro onde a câmera é montada. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

  1. Imagem hiperspectral de raízes
    1. Configuração do hardware
      1. Utilize um sistema de imagem hiperspectral de raízes (Figura 5) composto por (i) uma câmera monocromática NIR refrigerada termoelétricamente, com 14 bits, faixa espectral de 900 nm a 1700 nm, resolução de 320 por 256 pixels e taxa de quadros de 100 Hz, e (ii) um espectrógrafo de imagem com faixa espectral de 900 nm a 2500 nm e resolução espectral de 3,6 nm. Posicione uma fonte de iluminação linear de halogênio (quatro spots de 50 W) em geometria 45°/-45°. Monte o sensor de imagem em um sistema de posicionamento de dois eixos. A janela de varredura possui tamanho de 240 x 1000 mm, ou seja, 30 mm em cada borda da caixa de raízes não são cobertos pela imagem.
      2. Controle o sistema por meio de um script em Matlab para (i) aquisição dos padrões branco e escuro, (ii) definição do tempo de integração da câmera, (iii) seleção da resolução espacial (tamanho do pixel de 0,1 mm; tamanho do pixel de 1,0 mm) e espectral (todas as 222 bandas espectrais com resolução de 3,6 nm; espectro suavizado com 54 bandas e resolução de 14,8 nm), e (iv) definição da região de varredura na caixa de raízes.
      3. Salve as imagens como arquivos SIF. Para evitar problemas durante o salvamento de arquivos grandes, subdivida cada passo da imagem escaneada (9 passos por caixa de raízes) em quatro segmentos (três de 300 mm de comprimento, um de 100 mm de comprimento) e salve separadamente com um nome de arquivo único composto pelo número do passo (1 a 9), parte (1 a 4), data e hora (AAAA.MM.DD HH:MM:SS). Uma varredura completa de uma caixa de raízes exige um espaço em disco rígido de 13,7 GB.
    2. Aquisição e análise de imagem.
      NOTA: Figura 6 mostra as etapas de aquisição de imagem, segmentação e análise.
      1. A aquisição de imagem compreende a seleção das configurações da câmera para qualidade ótima da imagem e a definição dos parâmetros de varredura.
        1. Determine os tempos de integração da câmera para a varredura da caixa de raízes e para o padrão branco no software da câmera.
          1. Abra a interface gráfica de imagem e mova a câmera para uma posição da caixa de raízes onde haja raízes.
          2. Ajuste o tempo de integração da câmera, visando um objeto claro (isto é, raiz), de modo que aproximadamente 85% da faixa dinâmica total da câmera seja utilizada no histograma exibido pelo software. Repita para o padrão branco movendo o sistema de posicionamento da câmera para mirar o padrão branco. Em seguida, feche o software da câmera.
        2. Abra a interface gráfica de imagem em Matlab e faça todas as configurações para a varredura atual da caixa de raízes. Para os dados relatados aqui, utilize as seguintes configurações:
          Tempo de integração do padrão branco: 1000
          Tempo de integração da caixa de raízes: 4000
          Resolução espectral: Resolução total (isto é, 222 bandas espectrais de faixa estreita)
          Resolução espacial total (tamanho do pixel de 0,1 mm)
          1. Adquira os padrões escuro e branco antes de cada sessão de imagem, por exemplo, uma vez ao dia. O padrão escuro representa o ruído da câmera, enquanto o padrão branco fornece a refletividade máxima. Esses dados são necessários para a normalização da imagem durante o pré-processamento.
          2. Defina se toda a caixa de raízes ou apenas parte dela será escaneada. No caso atual, caixas de raízes inteiras são imagens. Em seguida, inicie a varredura.
      2. Processe a imagem com um script em Matlab. As operações realizadas pelo script são descritas.
        NOTA: Os scripts estão atualmente em versão não documentada e podem ser obtidos com o autor correspondente. Após a documentação adequada, estarão disponíveis para download no site da instituição do autor correspondente (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Componha um passo completo da imagem a partir do centro da caixa de raízes (contendo raízes), mesclando as quatro partes do passo.
          NOTA: Nesta etapa, não é necessário nem recomendado usar uma imagem espectral de uma caixa de raízes inteira (isto é, todos os 9 passos), pois o tamanho do arquivo tornará cada etapa de cálculo no Matlab muito demorada, e a informação contida em um único passo central é suficiente para as primeiras etapas da análise de imagem.
        2. Normalize a imagem utilizando os padrões escuro e branco adquiridos e levando em conta os diferentes tempos de integração dos padrões branco e da caixa de raízes, que são salvos automaticamente durante a varredura em um arquivo.
        3. Opcionalmente, aplique um filtro de suavização para remover ruídos da imagem. O script atualmente oferece filtragem mediana com kernel 3x3 e correção múltipla de dispersão. Para a avaliação da imagem apresentada aqui, nenhum filtro é aplicado.
        4. Exiba a imagem em todas as bandas espectrais registradas para obter uma primeira visão geral e decida um comprimento de onda para exibição ao selecionar regiões de interesse (cf. segmentação de imagem).
      3. Realize a segmentação entre raízes e fundo do solo em um script separado com os seguintes passos.
        1. Selecione regiões de interesse (ROI) para raiz e solo para identificar características espectrais para segmentação. Use a ferramenta de seleção livre para marcar uma ROI na imagem exibida em um comprimento de onda previamente identificado com bom contraste entre raízes e solo. Aqui, use três ROIs na raiz (laterais antigas e jovens, raiz principal) e duas ROIs no solo (região seca e úmida).
        2. Exiba um retângulo com as ROIs selecionadas e a parte restante como uma máscara preta e visualize a imagem da ROI selecionada em todos os comprimentos de onda.
        3. Remova todas as linhas na matriz da imagem que contenham pixels com intensidade espectral = 0 (pixels pretos).
        4. Fundir as ROIs de raiz e solo em uma matriz de primeiro plano (raiz) e uma matriz de fundo (solo) para segmentação.
        5. Busque bandas espectrais (intensidade de espectros individuais ou razões espectrais) que proporcionem a melhor separação entre o primeiro plano da raiz e o fundo do solo27. Quantifique a distinção entre os histogramas resultantes de pixels para raiz e solo utilizando a distância de Bhattacharyya28.
        6. Selecione um valor de intensidade limiar que separe os histogramas.
        7. Crie uma imagem binária aplicando o limiar selecionado à imagem original. Isso define todos os pixels com intensidade menor que o limiar como zero e aqueles com intensidade maior como um (feito automaticamente pelo script).
        8. Salve a imagem binária como arquivo tiff.
      4. Abra a imagem binária e analise as características das raízes. Selecione (i) Com base nos níveis de cinza e (ii) Raiz pálida sobre fundo preto no menu Distinção entre Raiz e Fundo e use limiar de intensidade global (a imagem já está binarizada).
      5. Para mapear o teor de água a partir dos dados hiperspectrais, adquira um conjunto de dados de calibração e aplique uma equação de calibração a uma imagem da caixa de raízes.
        1. Divida uma caixa de raízes em compartimentos de 5 cm usando folhas de poliestireno para preenchê-los com solo (mesmo substrato e db utilizados no experimento) com diferentes conteúdos de água (Figura 8).
        2. Calcule as quantidades respectivas de água a serem misturadas com o solo e preencha os compartimentos (mesmo procedimento descrito em 1.3. para a caixa de raízes inteira).
        3. Varra a caixa de raízes de calibração com as mesmas configurações utilizadas para as caixas de raízes plantadas.
        4. Realize os seguintes passos usando um script.
          1. Mesclar as quatro partes de um passo da caixa de calibração de água em um único passo e normalize-o com os padrões escuro e branco.
          2. Selecione caixas retangulares em cada compartimento com diferentes conteúdos de água e salve-as em um array de estrutura.
          3. Determine a característica espectral que melhor separa os compartimentos de conteúdo de água. Isso é feito com um algoritmo de busca pelo máximo global das diferenças de intensidade entre espectros médios de conteúdos de água adjacentes.
          4. Calcule o valor médio da intensidade espectral para esta característica em cada compartimento de conteúdo de água da caixa de raízes de calibração.
          5. Ajuste uma equação de regressão através do teor de água medido diretamente e do quantificador espectral respectivo.
          6. Aplique a equação de regressão a cada pixel não classificado como raiz em uma imagem da caixa de raízes e para a característica espectral (banda) determinada acima, que melhor se relaciona ao teor de água.

Configuração do espectrógrafo para análise óptica; iluminação de halogênio, caixa de rizosfera, unidade de controle de energia/movimento.
Figura 5: Scanner hiperspectral de raízes.
Os principais componentes do scanner são indicados. A imagem menor mostra a câmera durante a aquisição de imagem de uma caixa de rizosfera. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama de análise de imagem hiperspectral: configuração de aquisição, segmentação, mapeamento de água, análise quimiométrica.
Figura 6: Etapas da imagem hiperspectral de raízes.
A imagem hiperspectral de raízes consiste em três etapas principais: (i) aquisição de imagem, (ii) segmentação de imagem e (iii) análise dos dados espectrais. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Experimento de germinação de sementes; gradientes de umidade em poliestireno e papel de germinação.
Figura 7: Caixa radicular para calibração de água.
A caixa radicular contém compartimentos com substrato em diferentes teores de água, subdivididos por lâminas de poliestireno. O papel de germinação nos compartimentos secos garante que partículas do solo não sejam arrastadas para os compartimentos vizinhos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

5. Exemplos de aplicação

OBSERVAÇÃO: Informações quantitativas sobre raízes são aplicadas no contexto do fenotipagem de plantas (comparação de cultivares) e para pesquisas fisiológicas em plantas. Os seguintes dados acima do solo são relatados para exemplificar esses casos.

  1. Área foliar: Meça a área foliar de forma não destrutiva em estágios selecionados durante o experimento por meio do comprimento e largura das folhas como proxy. Alternativamente, imagens da copa podem ser utilizadas29.
    1. No final do experimento, meça o comprimento e largura das folhas juntamente com a área das folhas cortadas utilizando um medidor de área foliar. Calibre o método não destrutivo aplicando uma equação de regressão aos pares de dados.
  2. Matéria seca: No final do experimento, meça a matéria seca acima do solo cortando as plantas com tesoura e seque-as por 24 horas a 105 °C em uma estufa.
  3. Condutância estomática: Meça a condutância estomática com um porômetro foliar. Antes da medição, mantenha o dispositivo por pelo menos uma hora na câmara climática para permitir que os sensores se equilibrem com as condições ambientes e calibre o dispositivo cada vez que as condições ambientais na câmara climática forem alteradas. Realize medições em pelo menos três folhas por planta.

Resultados

São apresentados resultados de exemplo para segmentação de raízes com base em imagens RGB e HS. Para a imagem espectral, é fornecido um exemplo de mapeamento de água em alta resolução. Por fim, são apresentados resultados que demonstram o contexto científico em que os dados de raízes baseados em imagens são aplicados.

Medição da raiz baseada em RGB

Figura 8 mostra uma série temporal de imagens de raízes em cores RGB da cultivar de beterraba sacarina Ferrara. As imagens revelam alguns artefatos decorrentes da iluminação não homogênea das caixas radiculares, com áreas mais claras ao longo do lado esquerdo e diferentes níveis de brilho na região de sobreposição entre as imagens superiores e inferiores.

Estudo de crescimento da raiz RGB, beterraba 'Ferrara', dias 20-35, análise de lapso de tempo, diagrama de crescimento.
Figura 8: Série temporal de crescimento da raiz a partir da imagem RGB.
As imagens mostram o cultivar de beterraba Ferrara em diferentes dias após a semeadura (DAS). As imagens apresentam alguns artefatos devido à iluminação não homogênea no lado esquerdo da imagem e entre as imagens superiores e inferiores. Barras de escala, 2 cm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 9 apresenta detalhes sobre a segmentação de raízes com base no limiar de cor para a cultivar Ferrara no dia após a semeadura (DAS) 35. Como referência (Figura 9A), utiliza-se uma imagem binária na qual todas as raízes foram rastreadas manualmente com um Tablet Gráfico. O tempo necessário para o rastreamento manual de todo o sistema radicular denso e completamente desenvolvido da beterraba foi de aproximadamente quatro horas. Figura 9B mostra uma visão detalhada de uma área selecionada na parte superior da imagem, onde estão presentes raízes laterais antigas. Nessa região, vários eixos radiculares não são classificados pelo limiar de cor. Na parte inferior (Figura 9C), ao contrário, onde predominam raízes jovens brancas, a segmentação baseada na cor classifica corretamente todos os eixos radiculares. O sistema radicular binarizado (Figura 9D) exibe uma área preta no lado esquerdo, decorrente de um artefato de iluminação, que foi definida como região de exclusão antes da realização da análise quantitativa. Figura 9E mostra os histogramas de pixels correspondentes às características selecionadas (raízes versus solo) para o canal vermelho da imagem RGB da Ferrara no DAS 35. Os pixels das raízes (cor azul) mostram claramente três picos correspondentes às laterais jovens claras, laterais antigas escuras e raiz principal. A sobreposição entre as laterais antigas e o fundo do solo é muito acentuada, resultando em eixos radiculares não classificados (cf. Figura 9B).

Diagrama de segmentação de raízes baseado em cores RGB com análise de histograma de tipos de raízes e diferenciação do solo.
Figura 9: Segmentação de raízes utilizando um limiar de cor.
(A) Sistema radicular segmentado manualmente utilizando uma mesa digitalizadora, (B) área com eixos de raízes antigas mal segmentados na parte superior e (C) eixos jovens adequadamente segmentados na parte inferior da imagem, e (D) imagem binária obtida a partir do limiar baseado em cor. (E) Histogramas de pixels para características selecionadas da imagem RGB. As raízes são representadas pelas barras azuis com diferentes tipos de raízes indicados; o solo é representado pelas barras vermelhas. Barras de escala em A e D, 2 cm; barras de escala em B e C, 1 cm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

O comprimento total visível das raízes quantificado para a imagem de referência segmentada manualmente é de 1534,1 cm, enquanto a segmentação automatizada baseada em cor fornece um comprimento total de raiz de 1427,6 cm.

Imagens em escala de cinza obtidas por iluminação UV não apresentam vantagem no caso mostrado aqui e tiveram desempenho inferior em comparação com o limiar de cor (comprimento das raízes: 1679,7 cm). As raízes antigas não puderam ser segmentadas, e houve mais ruído na imagem, provavelmente devido à menor intensidade luminosa das lâmpadas UV. No entanto, no caso de raízes jovens com alta autofluorescência e um substrato de fundo claro, a iluminação UV ainda pode ser uma opção, conforme mostrado em uma imagem obtida de outro experimento em que areia foi usada como substrato de fundo (Figura 10).

Microscopia de fluorescência; estrutura da raiz; esquerda: confocal com tonalidade azul, direita: imagem em campo claro.
Figura 10: Iluminação UV para visualizar raízes sobre fundo claro.
Exemplo de um sistema radicular de trigo duro crescendo em uma caixa de rizosfera preenchida com areia de quartzo. A caixa de rizosfera é fotografada com iluminação para (A) luz UV e (B) luz fluorescente (diurna). Barras de escala, 2 cm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Medições da raiz baseadas em HSI

Figura 11 apresenta os espectros médios de três áreas de interesse nas raízes (laterais velhas e jovens, raiz principal) e duas áreas de interesse no solo (parte superior e inferior da caixa radicular).

Gráfico de análise espectral da raiz, refletância normalizada versus comprimento de onda, comparações entre solo e raiz.
Figura 11: Espectros médios de raiz e solo.
Espectros de regiões de interesse (ROIs) na raiz (três tipos de raiz) e no solo (parte superior e inferior da caixa de rizosfera). As ROIs são selecionadas para determinar um critério ótimo de segmentação entre raiz e solo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

É evidente que as raízes principais e laterais jovens diferem substancialmente do fundo quanto à intensidade na maioria das bandas espectrais. Para as laterais antigas, as diferenças de intensidade são muito menores. Uma característica que pode ser inferida visualmente é a inclinação distinta do espectro na região de absorção da água (1450 nm). Nesta região, a inclinação dos espectros das raízes é maior em comparação com os espectros do solo. Além disso, pode-se identificar uma alteração nos espectros da raiz principal e das laterais jovens na região próxima a 1100 nm, que não ocorre nas laterais antigas.

Figura 12A mostra o resultado do algoritmo de busca que identifica uma razão espectral com o maior contraste entre primeiro plano e plano de fundo. A razão entre os espectros em 1476 nm e 1076 nm fornece a melhor separação entre raízes e solo. O histograma resultante dos pixels de primeiro plano das raízes e do plano de fundo do solo é apresentado na Figura 12B. Embora haja alguma sobreposição, a maioria dos pixels está claramente separada do plano de fundo do solo. Ajustando uma curva gaussiana bimodal ao histograma e utilizando a distância de Bhattacharyya para quantificação, obtém-se um valor de 7,80. Um valor superior a 3,0 indica um alto contraste na imagem, permitindo uma separação confiável28.

Mapa de calor espectral e histograma para análise de intensidade de comprimento de onda; análise de dados de emissão óptica.
Figura 12: Diferença na refletância entre o primeiro plano da raiz e o plano de fundo do solo para diferentes razões de bandas espectrais e histograma de pixels na razão espectral utilizada para segmentação.
(A) Cores claras (amarelo) indicam alto contraste entre primeiro plano e plano de fundo, cores escuras (azul) indicam baixo contraste. As primeiras 15 bandas foram removidas devido ao ruído. As linhas vermelhas indicam a razão de bandas com maior contraste. (B) Histograma de pixels de raízes (azul) e solo (vermelho) na razão espectral de segmentação. As barras azuis representam a raiz e as barras vermelhas representam o solo. O valor de intensidade corresponde à razão entre a banda espectral 160 e a banda espectral 49. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A imagem binária (Figura 13) é criada aplicando-se um limiar global de intensidade da razão espectral identificada em um valor de 1,008 calculado a partir da distância do histograma27. A análise do comprimento da raiz desta imagem fornece um comprimento total de 1557,3 cm, o que representa um erro de apenas 1,5% em comparação com a imagem de referência rastreada manualmente.

Diagrama da estrutura da rede neural; árvore dendrítica; imagem de microscopia; visualização da conectividade neuronal.
Figura 13: Imagem binária do sistema radicular da cultivar de beterraba açucareira Ferrara.
A imagem foi obtida mediante a aplicação de um limiar espectral global. Barra de escala (canto inferior esquerdo), 2 cm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Embora a segmentação da raiz tenha melhorado com o uso de informações espectrais em comparação com informações baseadas em cor, a principal intenção da imagem hiperspectral é a análise de propriedades quimiométricas da imagem. Isso é exemplificado por meio do mapeamento do teor de água de uma imagem de caixa de raiz.

Figura 14A mostra os espectros médios dos compartimentos na rizocaixa de calibração (cf. Figura 7) preenchida com solo de diferentes conteúdos de água. A forma dos espectros é semelhante entre os compartimentos, ou seja, aqui uma razão espectral não fornece necessariamente um critério de classificação mais estável. Assim, a intensidade em uma única banda espectral (1680 nm), onde a diferença média entre conteúdos de água adjacentes é maximizada, é identificada como o melhor critério de separação. Os histogramas de pixels resultantes para este comprimento de onda espectral são mostrados na Figura 14B.

Gráficos de análise espectral; (A) espectros de absorção, (B) distribuição de intensidade para estados úmido-seco.
Figura 14: Características espectrais para calibração do teor de água.
(A) Espectros médios de nove compartimentos de água da caixa-radicular de calibração com diferentes conteúdos de água; (B) Histogramas de pixels para os compartimentos de água na banda 216, onde a distância média entre compartimentos vizinhos é máxima. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A relação entre a intensidade média do pixel em 1680 nm e o teor de água medido é mostrada na Figura 15.

Gráfico de umidade do solo; ajuste exponencial e linear. Teor de água versus reflectância; capacidade de campo, ponto de murcha.
Figura 15: Relação entre reflectância espectral e teor volumétrico de água.
A figura mostra pares de dados de teor de água medido e reflectância espectral com curvas empíricas (linear e exponencial) ajustadas aos dados, excluindo os teores mais altos de água (triângulos vermelhos). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

A diferenciação de teores de água mais elevados com base na intensidade espectral torna-se difícil. Uma regressão significativa (linear ou exponencial) com alto valor de R2 pode ser ajustada para teores de água até cerca de 0,30 cm3 cm-3. Condições de solo mais úmido não podem ser previstas com confiabilidade pelo valor de intensidade. Comportamento semelhante, com uma relação exponencial entre refletividade e teor de água e com resposta decrescente para teores de água superiores a 0,30 cm3 cm-3, também foi observado em outros estudos30.

Uma imagem de rizocaixa com mapeamento detalhado do teor de água é mostrada na Figura 16. Quatro aspectos devem ser destacados. Primeiro, uma região com menor teor de água pode ser observada nas partes com raízes da rizocaixa. Segundo, a maior depleção está concentrada nas proximidades de eixos radiculares individuais. Terceiro, zonas de depleção também ocorrem onde não há eixos radiculares visíveis na superfície, indicando regiões onde as raízes estão ocultas no solo. Quarto, o mapeamento de água sem processamento adicional de imagem resulta em uma aparência irregular devido à agregação do solo. Isso pode indicar uma distribuição heterogênea do teor de água na escala do agregado, mas também pode refletir o efeito da morfologia da superfície na qualidade da imagem. Técnicas quimiométricas de processamento de imagens são uma opção para superar esses efeitos morfológicos em imagens espectrais31, mas ainda não foram implementadas nos scripts Matlab utilizados aqui.

Diagrama da estrutura de um neurônio; detalhe dos ramos dendríticos na análise de rede neural.
Figura 16: Mapeamento do teor de água em uma caixa radicular.
As cores azul-escuras representam regiões com alto teor de água, enquanto as áreas de verde a vermelho indicam regiões com baixo teor de água. A raiz da planta é sobreposta à imagem em preto. Barra de escala (canto inferior esquerdo), 2 cm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Exemplos de aplicação

Figura 17 relaciona características quantitativas da raiz obtidas por análise de imagem com medições da parte aérea.

Análise de dados de crescimento de plantas; gráficos de comprimento radicular, razão da área superficial, matéria seca, condutância estomática.
Figura 17: Exemplos típicos de aplicações para dados radiculares.
(A) e (B) mostram informações sobre raízes utilizadas para a caracterização da parte aérea e subterrânea da planta em um contexto de fenotipagem. (A) representa o crescimento radicular do cultivar de beterraba sacarina Ferrara, (B) compara seis cultivares de beterraba sacarina cultivados em caixas de rizosfera utilizando a razão entre área foliar e radicular (dados de uma repetição). (C) e (D) são relações funcionais entre características conforme observadas em pesquisas fisiológicas de plantas. (C) mostra a influência da razão entre área foliar e radicular na produção de matéria seca e (D) a relação entre área superficial da raiz e condutância estomática. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura 17A e 17B são relevantes para fenotipagem com foco na caracterização abrangente de partes aéreas e subterrâneas da planta. Figura 17A mostra o crescimento radicular da cultivar de beterraba sacarina Ferrara (cf. Figura 8 para imagens). A expansão do sistema radicular indica a capacidade de uma cultivar de explorar o volume do solo em um determinado período do ciclo de vegetação. Figura 17B mostra a razão entre a área foliar e a área radicular de seis cultivares de beterraba sacarina, fornecendo um descritor para o equilíbrio entre o suprimento (raiz) e a demanda (folha) da planta.

Figuras 17C e 17D apresentam exemplos de relações funcionais de interesse na pesquisa fisiológica. Na Figura 17C, a relação entre área foliar e radicular é relacionada à matéria seca formada durante o experimento, indicando o papel predominante da superfície assimiladora como fator limitante para o acúmulo de matéria seca. A falta de significância, apesar de um valor comparativamente alto de R2, está relacionada ao baixo número de pares de dados (n=6) utilizados aqui. A Figura 17D revela que cultivares com maior área radicular (absorção aprimorada) apresentam condutância estomática média mais elevada ao longo do experimento. A área radicular maior aparentemente sustenta a extração de água, prolongando assim a abertura dos estômatos.

Discussão

Os protocolos fornecem duas abordagens complementares para o solo cultivado de imagem de sistema radicular. Um passo crítico para resultados experimentais confiáveis está enchendo do rhizoboxes que tem que garantir uma camada homogênea e até mesmo substrato no vidro da frente para proporcionar contato solo-raiz apertado a janela de observação e evitar lacunas de ar. Esta é a principal razão para usar o solo peneirado comparativamente fino de < 2 mm: agregados maiores resultam em morfologia de superfície superior a janela de observação com vazios entre os agregados. Além de um maior risco de desidratação de dica de raiz, isso também requer mais complexas técnicas de processamento de imagem para mapeamento de água31.

Modificações do protocolo, portanto, focar melhor e rápido enchimento de rhizoboxes. Tempo de enchimento atualmente é cerca de 30 minutos pela caixa. Além do uso de rhizoboxes com duas janelas de vidro para a imagem latente de ambos os lados e modificações para otimizar a homogeneidade de iluminação para imagens RGB melhores são testados. Nova prorrogação de hardware também pode considerar a integração de planar optodes32 , bem como da capacidade de imagem33 no sistema rhizobox. No entanto, esta é além de atividades de atualização atuais.

Modificações de software focar o registo automático da imagem para fundir a parte superior e inferior RBG fotos34. Para hiperespectrais extração de recurso sem supervisão avançado de imagem aproxima-se28 , bem como métodos de deteção de destino supervisionados mais sensíveis tais como SVMs35 são testados. Assim, os dados hiperespectrais potencialmente permitem a avaliação de múltiplas Propriedades rizosfera, solo e raiz36. Além disso pretende-se desenvolver um (semi) automatizados software para rhizobox raiz imagens com base em uma versão modificada do sistema radicular Analyzer37 quantificar morfológica (comprimento, diâmetro, superfície), bem como traços arquitectónicos (frequência de ramificação, ângulos de ramificação).

A principal limitação do protocolo em comparação com abordagens de imagem 3D é a restrição à superfície visível raiz e propriedades da rizosfera. No entanto foi demonstrado que os traços visíveis de raiz são um proxy confiável para o sistema inteiro da raiz21. A técnica de rhizobox é facilmente combinada com tradicional amostragem destrutiva (lavagem) no final do crescimento dinâmico da imagem latente para validar a relação de visível vs traços do sistema total da raiz. Como esta relação pode variar entre espécies21, amostragem destrutiva é recomendada para assegurar uma conclusão confiável de traços visíveis para qualquer nova série fenotipagem com uma espécie de diferentes culturas.

A principal vantagem do protocolo aqui apresentado é a combinação de condições de crescimento realistas (solo), relativamente alto rendimento potencial para a imagem RGB temporalmente resolvido e inferência na funcionalidade de raiz (por exemplo, absorção de água) via os dados de raiz e rizosfera quimiométricas de imagens hiperespectrais. Desse modo, os métodos supera restrições de inferência em plântulas de alto rendimento e raiz não-solo de imagem métodos14, enquanto parcialmente permite insights profundos fenotipagem em processos de funcionais com complexidade menos experimental e maior rendimento em comparação com métodos avançados de 3D15.

Nas próximas experiências o protocolo será usado para estudar o efeito de micorriza no desenvolvimento do sistema radicular e a funcionalidade de leguminosas, bem como para as características de raiz de fenotipagem de espécie de cultura de cobertura em relação à estrutura do solo, nitrogênio e carbono ciclismo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem financiamento do austríaco ciência fundo FWF através do projeto número P 25190-B16 (as raízes da resistência à seca). Estabelecimento da infra-estrutura de imagens hiperespectrais foi apoiado financeiramente pela Federal governo da Baixa Áustria (Niederösterreich terra) através do projeto K3-F-282/001-2012. Financiamento adicional para o experimento de beterraba foi recebido da pesquisa AGRANA & GmbH de centro de inovação (ARIC). Os autores agradecer Craig Jackson para suporte técnico durante o experimento e inglês correção do manuscrito. Também reconhecemos Markus Freudhofmaier que contribuíram para o estabelecimento da configuração de imagem RGB e Josef Schodl para construção de montagem rhizobox.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturConstrutor
Lâmpadas LED ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Tubo de luz fluorescente HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
Tubo de luz UV Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Versão estendida 12.0 x 32Adobe Systems Software Irlanda Ltda.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Câmera Xeva-1.7-320 SWIRXenicsXEN-000105
Espectrógrafo Imspector N25EEspécime Scanner
de imagem hiperespectralCarinthian Tech Research AGConstrutor experimentalProjeto e montagem de scanner de imagem hiperespectral e software
Matlab R2106aMathworksIncluindo Caixas de Ferramentas para Processamento de Imagens, Processamento de Sinais e Estatística e Aprendizado de Máquina
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Medidor de ÁreaLI-COR
BASF Folhas de poliestireno de estirenoObi Baumarkt9706318Diferentes tipos de folhas de poliestireno ou outro material que separa o solo úmido de forma diferente podem ser usados
experimental

Referências

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