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Artigo de método

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

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DOI:

10.3791/56260

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8 de novembro de 2017

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Resumo

Células estaminais pluripotentes embrionárias e induzida pode auto renovar e se diferenciar em vários tipos de células do corpo. As células pluripotentes são assim, cobiçadas por pesquisa em medicina regenerativa e estão atualmente em ensaios clínicos para doenças oculares, diabetes, doenças cardíacas e outras doenças. O potencial de se diferenciar em tipos de células especializadas, juntamente com os recentes avanços no genoma de tecnologias, incluindo o sistema CRISPR/Cas de edição forneceram oportunidades adicionais para costurar o genoma de iPSC para variadas aplicações incluindo a doença de modelagem, terapia gênica e polarização vias de diferenciação, para citar alguns. Entre as tecnologias de edição disponíveis, o CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes tem emergido como uma ferramenta de escolha para a edição específica do genoma eucariótico. Os CRISPRs são facilmente acessível, barato e altamente eficiente em edições específicas de engenharia. O sistema requer uma nuclease Cas9 e uma sequência de guia (20-mer) específica para o destino de genômico adjacentes um 3-nucleotide "NGG" protospacer-adjacente-motivo (PAM) para direcionamento Cas9 para o locus genômico desejado, ao lado de um traçador de vinculação Cas9 universal (RNA chamada RNA guia única ou sgRNA). Aqui nós apresentamos um passo a passo do protocolo para a geração eficiente de iPSC alimentador independente e livre de pegada e descrever metodologias para edição de genoma de iPSC usando complexos Cas9 ribonucleoprotein (RNP). O genoma edição protocolo é eficaz e pode facilmente ser multiplexado por sgRNAs pre-complexantes para mais de um destino com a proteína Cas9 e simultaneamente entregando dentro das células. Finalmente, descrevemos uma abordagem simplificada para a identificação e caracterização de iPSCs com edições desejadas. Tomados em conjunto, as estratégias delineadas são esperadas para agilizar a geração e edição de iPSC para múltiplas aplicações.

Introdução

A reprogramação de células somáticas humanas ao estado pluripotentes pela superexpressão de reprogramação fatores revolucionou a investigação em células estaminais com aplicações em modelagem de doença, medicina regenerativa e desenvolvimento de drogas. Vários métodos de reprogramação não-virais estão disponíveis para entrega de reprogramação fatores e gerando iPSCs, mas o processo é a mão de obra intensiva e não muito eficiente1. Os métodos virais, apesar de eficiente, estão associados com problemas de integração do vírus e tumorigenicidade2,3,4. Neste manuscrito, relatamos o uso de citoplasmática vírus Sendai para entrega reprogramação fatores e estabelecer linhas de iPSC pegada livre que a falta de integração de qualquer sequências de vetor viral em seus genomas5. Sendai vírus é um vírus de RNA que é diluído de passagens de citoplasma ~ 10 célula após a infecção e produz fatores de reprogramação em abundância, levando a rápida e eficiente de reprogramação6,7. As iPSCs estabelecida pode então ser prontamente uma transição para médio alimentador-free para evitar o uso de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como alimentador células8.

Nesta publicação, além de delinear o vírus Sendai mediado reprogramação, descrevemos um protocolo melhorado para edição iPSCs, que tem o potencial para fornecer células humanas ilimitadas com modificações genéticas desejadas para a pesquisa. Nós usamos tecnologia CRISPR/Cas9 para a modificação de iPSCs, que agora está sendo usado para uma ampla gama de aplicações, incluindo bate-ins e nocautes, exclusões de genômicas em grande escala, biblioteca em pool de triagem para a descoberta do gene, genética de numerosos organismos-modelo e terapia de gene a9,10,11. Esta técnica envolve a formação de complexos de Streptococcus pyogenes-derivada Cas9 nuclease e 20-mer guia RNAs que alcançar o reconhecimento do alvo através de base-emparelhamento com sequência genômica alvo adjacente ao 3' protospacer nucleotídeo adjacente sequência de motivo (PAM). A nuclease Cas9 induz um nucleotídeos de interrupção dupla encalhado ~ 3 do site da PAM, que é posteriormente reparados predominantemente por não-homóloga fim juntando o caminho (NHEJ) por inserções ou exclusões no quadro de leitura aberto e desse modo funcional nocaute de genes12.

Nosso protocolo melhorado inclui os detalhes para cultura de células de pâncreas humanas, sua reprogramação na mitotically inativado fibroblastos embrionários de rato (MEFs) para alcançar uma eficiência mais elevada de reprogramação, posterior adaptação à cultura livre de alimentador para Matrigel, caracterização de iPSCs estabelecido, CRISPR guiado RNA concepção e preparação, entrega em iPSCs como complexos de RNP, única célula classificação para gerar linhas clonais de iPSCs editado, fácil de rastreio e identificação de edições e caracterização de única célula clones. Exclusões de genômicas eficientemente foram geradas neste estudo pela introdução de proteína Cas9 e dois complexos de RNP sgRNA CRISPR para induzir quebras encalhadas dobro (DSBs) e exclusão da intervenção do segmento. Esse método capitaliza sobre o uso de dois guias para gerar exclusões no quadro de leitura aberto, alta eficiência de NHEJ levando ao baixo número de clones que precisa ser caracterizado e fácil triagem preliminar dos clones por capilar automatizado unidade de electroforese, analisador de fragmento. Estes genoma eficazes métodos para gerar modelos de doenças humanas baseadas em células-tronco de edição logo se tornará uma abordagem padrão e rotina em qualquer laboratório de células-tronco. Finalmente, genoma preciso edição tornará possível ir além da modelagem de doença de células-tronco e potencialmente poderia ajudar a catalisar terapias baseadas em células.

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Protocolo

1. protocolo de reprogramação

  1. geração de iPSC humana de células pancreáticas humanas primárias
    1. casaco 6-poço da placa com colágeno frio 1,5 mg/mL e deixe-a do gel a 37 ° C por 1 h.
    2. Placa de passagem antecipada humanas pilhas pancreatic principais no meio de Prigrow III (~ 1-1,5 × 10 5 células) em um colágeno revestida 6-placa em dia -2 para atingir aproximadamente 2,5 × 10 5 células ou pelo menos 60% confluencia por bem no dia do transdução (dia 0). Para o primeiro estudo, chapa de pelo menos 2-3 poços para ficar bem com confluência desejada no dia 0. Use pelo menos um bem como um controle para contar as células.
    3. No dia de transdução (dia 0), aquecer 1 mL de meio de Prigrow III em um banho de água para cada poço a ser transformados. Colheita de células de um controle bem em 1 mL de meio FBS 10% com 1 mL de tripsina/EDTA por 5 min ou até as células detach para realizar uma contagem de células. Para fazer 10% médio FBS, adicionar DMEM, 10% FBS, 1% L-glutamina, 1% piruvato de sódio e 1% não aminoácidos essenciais.
    4. Contagem e verificar a viabilidade das células usando o contador de célula e calcular o volume de cada vírus necessários para atingir o alvo com base do título número e vírus de celular. Use a multiplicidade de infecção (MOI) de KOS = 5, hc-Myc = 5 e hKlf4 = 3 para as células do pâncreas.
    5. Um conjunto de degelo de Sendai vector tubos no armazenamento no gelo-80 ° C e adicionar cuidadosamente os volumes calculados de cada um dos três tubos vector Sendai para 1 mL de meio de Prigrow III, pré aquecido a 37 ° C. pipeta suavemente para misturar a solução. Um poço em uma placa de 6 é suficiente para transducing com vetores virais de Sendai para gerar células reprogramadas.
    6. Aspire o meio de Prigrow III de células e lentamente adicione a mistura de vírus a reprogramação de poços que contém as células. Incubar as células durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com um ambiente umidificado de 5% de CO 2.
    7. Cuidadosamente descartar a mistura de vírus em células e substitua meio fresco Prigrow III no dia seguinte, 24 h após a transdução. Cultura de células para a 5D e mudar o meio cada dia alternativo.
    8. No dia 5, preparar MEFs em 0,1% gelatina pré-revestido pratos de cultura de 10 cm (1,3 x 10 6 células/prato). Crescer MEFs T175 frascos até dia 4 e dia 5, expor as células para 6.000 rads de uma fonte de radiação-γ antes da semeadura de células 13 ou uso a fonte comercial do MEF.
    9. No dia 6, use 1 mL de solução de desprendimento celular por 10 min para separar as células transduzidas, todos eles em pratos MEF no meio de Prigrow III da placa com inibidor de rocha (estoque de 5 mM, final 10 µM) e incubar durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C, com uma atmosfera umidificada re de 5% de CO 2.
    10. Alterar o meio de Prigrow III a hESC médio no dia seguinte. Para fazer 500 mL do meio de hESC, adicionar DMEM/F-12, substituição de soro de nocaute de 20% (v/v) (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamina; 100 µM não essenciais aminoácidos e 100 µM 2-Mercaptoetanol. Mudar o meio suavemente todos os dias agora.
    11. Observar as placas regularmente para o surgimento de aglomerados de células ou colônias indicativa das células reprogramadas. As células transformadas formam agregados clonais com morfologia de paralelepípedos e grande núcleo e nucléolo. Marcar o provável ' iPSC ' colônias e verifique-os regularmente para o crescimento.
    12. Quase quatro semanas depois de transdução como colônias estão prontas para a colheita ou transferência, preparar placas MEF 24 boas por chapeamento 1.3 x 10 6 placa revestidos de células/gelatina como antes para a transferência das colônias única.
      1. Preparar matriz da membrana (por exemplo, Matrigel) controlos baseado em factor de diluição no certificado de análise. Adicione uma alíquota de 25 mL de DMEM/F-12 para revestir quatro 6 placas (1 mL/poço) e incubar a temperatura ambiente (RT) pelo menos 1 h antes do uso. Escolher manualmente a 12-24 colônias usando uma ponta de pipeta estéril para aspirá-los e transferir para placas MEF em 500 µ l de meio hESC.
      2. Aspire a mídia no poço para suavemente, interromper ou separar as colônias. Também escolha 24-48 colônias em placas de 24 poços matriz membrana revestida. Para as placas de membrana revestida, use mTeSR1 (suplementado com inibidor de pedra 10 µM) por 24 h e mudam todos os dias. Dentro de 6-10 d de arrancar as colônias, eles estão prontos para ser transferido para as novas placas de membrana 24-bem e/ou 12-poços para expansão clonal.
    13. Se necessário, retire as colônias em MEFs usando colagenase 1 mg/mL por 20 min, lavar duas vezes com hESC/mTeSR1 e transferência para membrana revestido placas 12 ou 24-boas. Se não houver suficiente robustas colônias crescendo na membrana da etapa 1.1.12 matriz, congelar as colônias em MEFs usando iPSC congelando mídia conforme o fabricante ' diretrizes de s.
    14. Separar as colônias robustas chapeadas na membrana na etapa 1.1.12 usando 500 µ l de dispase por 20 min e placa novamente na membrana de matriz revestido placas 12-boas. Raspar manualmente quaisquer células diferenciadas ou contaminantes células de alimentador MEF para enriquecer para pluripotentes clones na membrana.
    15. Expandir os clones após 6-8 d crescendo na membrana revestido placas por dissociando com solução de dispase como antes e chapeamento agregados de pequenas células frescas membrana revestida 6 ou 12-placa. Médio de mudança mTeSR1 diariamente. Caracteriza os clones reprogramados pela fosfatase alcalina, coloração, immunostaining pluripotência marcadores (OCT3/4 NANOG), FACS análise e marcadores de superfície pluripotentes e ensaios de diferenciação. Crescer e cultura os clones em placas com revestimento em membrana para todos os ensaios incluindo CRISPR edição conforme explicado acima, a menos que outra solução de revestimento é especificamente mencionada.
  2. IPSCs caracterização da humana
    1. coloração fosfatase alcalina
      Nota: um kit comercial é usado aqui. Consulte a tabela de materiais.
      1. Putativo iPSCs humana na placa de 24 e cultura para 4-5 d da placa com mudança de mídia diariamente.
      2. Para iniciar o protocolo de coloração, Aspire o meio de cultura e lavar as células com 1 mL de 1X PBS com 0,05% Tween 20 (PBST).
      3. Adicionar 0,5 mL de solução de correção no kit sobre as células e incubar a RT para 2 a 5 min.. aspirar a solução de correção e em seguida, lave as células fixas com PBST. Não permita que os poços secarem.
      4. Adicionar 0,5 mL de solução de substrato AP recentemente preparada por bem, misturando a solução A, B e C. Incubar as células no escuro (embrulhado com papel alumínio ou em um recipiente escuro) à temperatura de 5 a 15 min.
        Nota: Estreitamente monitorar a mudança de cor e parar a reação, quando a cor se transforma brilhante para evitar coloração inespecífica.
      5. Parar a reacção por aspirar a solução de substrato AP e lavagem dos poços duas vezes com 2 mL de 1X PBS.
      6. Observar as colônias sob o microscópio e capturar as imagens em 4 X ou ampliação de 10x usando qualquer microscópio de campo claro com uma câmera.
    2. Immunostaining
      1. placa iPSCs humana em placa de 24 e cultura para 4-5 d com mudança de mídia diariamente.
      2. Lavar as células uma vez brevemente com PBS e correção para 20 min com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.
      3. Lavar três vezes por 10 min (3x, 10 min) com PBS em RT.
        4. Sites de específico
      4. saturar com 10% soro normal de cabra ou burro (NS, dependendo o anticorpo secundário animal foi erguido em) em PBS durante 40 min à RT Para apenas intracellular epitopes, incluem 0,3% TX-100 em PBS (TX/PBS) para permeabilize.
      5. Lavagem de 3 x 5 min com PBS em RT.
      6. Diluir os anticorpos OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 e SOX17 em uma solução fresca de 5% NS em PBS e incubar durante 2 h em RT, ou durante a noite em 4 ° C.
      7. Lavar 3 x por 5 min com PBS em RT.
      8. Diluir apropriado secundário Alexa Fluor 488 ou 568 anticorpos em 5% NS/PBS e incubar as células por 1h no RT.
      9. Lavar 3 x por 5 min em RT.
      10. Incubar com DAPI em PBS para 10 min e lavar 2x por 5 min em RT. Use um microscópio fluorescente para tirar fotos.
    3. Classificação de célula fluorescência-ativado (FACS)
      1. placa iPSCs humanas em uma placa de 6 e cultura até as colônias tornam-se 80% confluente (pelo menos 10 5 células /Sample.) com mudança média diária de mTeSR1.
      2. No dia do experimento, isolar as células e dissociar a uma suspensão de célula única, conforme explicado acima no protocolo. Lave com média de 10% FBS.
      3. Para marcadores de superfície, resuspenda em 0,5-1 mL de meio FBS 10% e manter na Ice.
      4. Para marcadores intracelulares, resuspenda em 1 mL de 4% PFA/PBS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar com média de 10% FBS. Resuspenda em 0,1% TX/PBS e incube por 15 min no gelo. Lave novamente com média de 10% FBS. Resuspenda em 0,5-1 mL de meio FBS 10% e manter na Ice.
      5. Adicionar 50 µ l de suspensão de células para 50 µ l de 10% FBS médio contendo quantidade de TRA-1-60, TRA-1-81 ou anticorpos SSEA-4 recomendada e incube por 30 min a 1 h.
      6. Duas lavagens com 10% FBS.
      7. Resuspenda em 100 µ l de 10% médio FBS contendo anticorpos secundários fluorescentes e incube por 30 min. Lave duas vezes com 10% FBS e ressuspender em volume apropriado de 10% FBS. As células vivas podem ser diferenciadas de células mortas pelo corante iodeto de propidium adicionado no < 1 µ g/mL para estimar a apoptose celular durante o processo.
    4. Tri-linhagem diferenciação
      1. sementes de duas placas de 6-poços com 1,5 a 2 x 10 6 iPSCs/bem no meio de mTeSR1 com inibidor de pedra 10 µM.
      2. Permitem que as células a crescer para 2-3 d com diariamente mTeSR1 mudança médio até os poços são 80-90% confluente.
      3. Para indução de ectoderma, adicionar meio de indução neural (NIM) de acordo com o fabricante ' instruções de s em 2-3 poços das placas 6-poços.
      4. Alterar o meio RPMI contendo 2% B27 suplemento menos insulina e 12 µM CHIR99021 para indução de mesoderme em 2-3 poços das placas 14. Add RPMI única contendo 2% B27 suplemento menos insulina para as próximas 24 h. adicionar 5 µM, IWP4 ao meio RPMI com 2% B27 suplemento menos insulina para as próximas 24 horas. Depois de 72 h, substituir a mídia com RPMI contendo 2% B27 suplemento levando à geração de bater cardiomyocytes em 2-3 d.
      5. Para indução de endoderme, mudar o meio em poços das placas para 131 MCDB suplementados com 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 1 x Glutamax, glicose 10 mM, 0.5% BSA, 100 ng/mL GDF8 e 5µM de CHIR99021 por 24 h. cultura no mesmo meio sem CHIR99021 6-poços para 2-3 d 15.
      6. Seguir o protocolo de imunocoloração da etapa 2 para todas as três linhagens e verifique se a expressão de marcadores pertinentes.

2. Edição de humano iPSC genoma usando CRISPR-Cas9

  1. sgRNA e preparação de Cas9 proteína
    1. Cas9 alíquota proteína microcentrifuga tubos em condições estéreis e armazenar as alíquotas por congelamento dos tubos a -80 ° C.
    2. Desenha dois direcionamento guia RNAs por gene baseados no software do MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) ou qualquer outro CRISPR guia projeto webtool. Alvo de primeiro ou segundo exon do gene (baseado no frame de leitura aberto) para gerar nocautes. Escolha os dois guias para que eles cortaram juntas (~ 30-100 bp separado) e podemos facilmente Visualizar a exclusão usando o mesmo conjunto de iniciadores de triagem. Escolha os guias da saída do software com base no índice de qualidade superior e menor número de sites de fora do alvo. Projeto triagem primeiras demão usando a explosão de cartilha do programa (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Iniciadores de rastreio deve ser pelo menos 100 bp longe o Cas9 corta sites e o tamanho do produto do PCR deve ser de preferência entre 400-700 bp para mais fácil amplificação por PCR.
    3. Design sgRNA complementares dois oligo DNAs (19-22 nucleotídeos de comprimento, dependendo da sequência guia) com um Bsa1 corte local em cada extremidade. O oligo DNAs pode ser sintetizado comercialmente e recozido para formar o DNA da dobro-costa. Para recozimento, adicionar 1 μL de cada de 100 µM de guias, 25 µ l de tampão (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM de NaCl, 1 mM EDTA) de recozimento e 23 µ l de água. Incubar em um thermocycler programado para começar a 95 ° C por 2 min e então gradualmente refrigerando a 25 ° C mais 45 min.
    4. Clone a 2 µ l do fragmento resultante em uma enzima de restrição Bsa1 digerido 1 µ l de in-house vetor de pCR2.1 de promotor T7 com um sítio de ligação Cas9 usando T4 DNA ligase conforme o fabricante ' protocolo de s.
    5. Sequenciar os fragmentos de DNA clonados e quando a fidelidade é estabelecida, em vitro transcrever os clones usando um kit de T7 para gerar guia único RNAs. Purificar o sgRNAs com um kit comercial e eluir em água livre de RNase. Verificar a concentração de RNA.
  2. Transfeccao de hiPSCs
    1. cultura hiPSCs no meio de mTeSR1 como descrito acima até que as células são 40-50% de Confluencia.
    2. Duas horas antes de nucleofection, substitua o meio com 2 mL de meio de mTeSR1 escaldadas contendo inibidor de pedra 10 µM.
    3. Uma hora mais tarde, preparar poços de destino para nucleofected células por aspiração de membrana, preparado como acima, de placa de 12 e substituindo com escaldadas 1 mL de meio de mTeSR1 com inibidor de pedra 10 µM. Manter a 37 ° C para a incubação.
      4. Suplemento de
    4. preparar nucleofection mistura de mestre (escala adequadamente dependendo das amostras) para cada amostra por adicionando µ l 16,4 de célula primária de P3; 3,6 µ l de suplemento 1 do kit de nucleofector; 0,5 µ g de proteína Cas9 e 0,5 µ g de cada sgRNA em 22 µ l por volume de reação. vetor GFP pMAX também foi nucleofected conforme o fabricante ' recomendações de s em células aproximadamente estimar a eficiência de iPSC transfeccao.
    5. Cada um Lave bem com 2 mL de PBS RT após aspirar o meio contendo inibidor de pedra dos poços de iPSC. Em seguida, Aspire PBS, adicionar 1 mL de solução de desprendimento de célula e incubar a placa a 37 ° C durante 10 min.
    6. Ressuspender as células em 3 mL de meio de mTeSR1 e suavemente Pipetar para cima e para baixo para gerar uma suspensão de célula única. Células de transferência dissociada de uma centrífuga de 15 mL tubo contendo 5 mL de meio de mTeSR1.
    7. Contar células com contador de célula e calcular o volume total exigido para 0,5 x 10 6 células/do transfection. Coloque a quantidade desejada de células num tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 200 x g durante 5 min à RT e aspire o sobrenadante.
    8. Ressuspender cada unidade de 0,5 x 10 6 células em 22 µ l da mistura do transfection mestre preparada na etapa 4. Rapidamente transferi células na câmara central de um poço de uma tira de nucleocuvette. Coloque a fita em um dispositivo e nucleofect nucleofector células usando o programa CB150.
    9. Depois de nucleofection, adicione rapidamente 80 µ l de meio de mTESR1 escaldadas contendo inibidor de pedra 10 µM a cada poço das células nucleofected. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo.
    10. Transferência suavemente as células da faixa de poços da membrana pré-revestida 12 placa contendo meio de mTeSR1 com inibidor de rocha preparada no passo 3.
    11. d após 1, mude para mTeSR1 fresco médio sem inibidor de rocha. Células de colheita 2-3 d após nucleofection para classificação de célula única.
  3. Isolamento de célula única do alvo hiPSCs
    1. um dia antes da classificação, preparar placas de 96 poços MEF semeando placa 2 x 10 6 células/gelatina-revestida em média de 10% FBS. Aproximadamente 70-80% dos clones sobreviver após nucleofection e 2-3 placas MEF podem ser preparadas para cada experimento edição.
    2. Após a incubação durante a noite, mudar a médio médio hESC (conforme descrito anteriormente) suplementada com 100 ng /bFGF mL, 1 x SMC4 (inibidores adicionados aos meios de comunicação para melhorar a viabilidade celular único) e 5mg/mL fibronectina para promover a adesão.
    3. Substituir o médio sobre o hiPSCs na placa 12-poços de mTeSR1 para mTeSR1 suplementado com 1 x SMC4 pelo menos 2 h antes de célula única classificação.
    4. o meio de hiPSCs de aspirar e lavar as células suavemente com PBS. Adicionar 500 µ l de solução de desprendimento de células em cada poço e incubar a 37 ° C por 10 min depois de aspirar a PBS. Gerar a suspensão de célula única, adicionando 1 mL de mTeSR1 (unsupplemented) a cada poço e pipetagem subindo e descendo suavemente várias vezes.
    5. Colocar suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar durante 5 min à x 200 g no RT. aspirado sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de mTeSR1.
    6. Classificar as células em células únicas usando um classificador de pilha com bocal de 100 mm em condições estéreis com uma célula no poço individual das placas de 96 poços, preparadas na etapa 1.
    7. Quatro dias depois da classificação, formação de colônia deve ser aparente; neste momento substituir o meio de cultura com hESC suplementado com 1 x SMC4.
    8. Oito dias depois da classificação, substitua médio médio hESC e cultura para 2 m.
    9. Separar as colônias usando colagenase 1 mg/mL por 20 min e transferi-los para placas de 24 poços membrana revestida em mTeSR1 com inibidor de rocha. Deixe os clones de célula única crescer e extrair seu DNA genômico após duplicação ou expandi-las. Use primers específicos de gene para amplificar o alvo do DNA por PCR.
    10. Kit de analisador de fragmento de uso para triagem inicial da PCR amplificados alvo genômico da região todos os clones, executando-as através do gel/corante misture conforme o fabricante ' instruções s. Estime o tamanho do fragmento resultante no software PROSize, comparando-o com a escada apropriada, que é executada com as amostras. Sequenciar o esperado ' edição ' clones e analisar dados de sequenciamento para confirmar a edição ou apagamentos.
    11. Para diferenciar clones monoallelic e biallelic, amplificar a sequência editada com PCR e clone no vetor pJET1.2. Enviar pelo menos 8-10 clones para sequenciamento e verifique a sequência para confirmar a edição em um ou ambos os alelos.
    12. Uma vez com sucesso alvo iPSC clones foram identificados através da genotipagem, examinar para confirmar que eles não perderam a pluripotência ou adquirida anormalidades cromossômicas através do processo.

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Resultados

Nesta publicação, seguimos um protocolo simples, mas eficiente para a geração de iPSC de células pancreáticas humanas usando integração ou vetores de vírus livre de pegada de Sendai. A figura 1A mostra uma representação esquemática do presente protocolo de reprogramação. As células pancreáticas humanas foram adquiridas comercialmente, cultivadas em meio de Prigrow III e transfectadas com vírus Sendai como explicado acima. Eixo transduzido em forma de células ...

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Discussão

Reprogramação de células somáticas humanas para iPSCs tem proporcionado um grande impulso para os campos de pesquisa de biologia básica, medicina personalizada, modelagem de doenças, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa16. Muitos métodos atuais e amplamente utilizados de iPSC humana geração requerem o uso de vírus com o risco de uma integração do genoma do hospedeiro ou epissomal vetores com baixa eficiência de reprogramação. Aqui, apresentamos um método eficiente para gerar iPSCs ali...

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Divulgações

BT é dos membros fundadores da renovar Biosciences Inc..

Agradecimentos

Trabalho no laboratório foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado para Dr. Anjali Nandal e grant exploratória de Maryland Stem Cell Research Fund para BT (TEDCO).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Vetores virais de Sendai - Kit CytoTune-iPS 2.0InvitrogenA16517Descongelar no gelo; S No: 1
Tripsina EDTAGibco Life Tech25300-0540,05%, 100 ml; S No: 2
Inibidor de rocha (Y-27632)MiliporeSCM075Use 10 μ M; Nº S: 3
Meio DMEM/F-12Invitrogen11330-032Nº S: 4
Reposição de soro (KSR)Gibco10828028Nº S: 5
DMEMInvitrogen119600691X; S No: 6
Soro fetal bovinoThermo ScientificSH30071.03Alíquota; Nº S: 7
L-glutamina (Glutamax, 100X), líquidoThermo Scientific350500611/100; S Não: 8
Aminoácidos Não EssenciaisGibco11140-0501/100; S Nº: 9
2-MercaptoetanolGibco2198502355 mM, 1/1.000; S No: 10
Hemacitômetros HausserHausser Scientific02-671-54S No: 11
Solução de Gelatina a 0,1%STEMCELL Technologies7903Incubar a 37º C por 1 hora; Nº S: 12
anticorpo SSEA-4Santacruzsc-217041/100; S Nº: 13
TRA-1-81 anticorpoSinalização celular4745S1/200; Nº S: 14
OCT4 anticorpoSanta Cruzsc-52791/1.000; S No: 15
Colágeno I, Cauda de Rato LifeTechnologiesA10483-01Mantenha frio; Nº S: 16
Alexa Fluor fluorescente 488/568 (anticorpos secundários)InvitrogenA21202/A100421/2.000; S Nº: 17
DPBSHycloneSH30028LS1X; Nº S: 18
Placa de cultura de tecidos de 100 mmFalcon353003Nº S: 20
Placa de cultura de tecidos de 96 poçosFalcon353078Nº S: 21
Placa de cultura de tecidos de 6 poçosFalcon353046Nº S: 22
Escopo de dissecação NikonSMZ745S No: 23
CapuzNuAireNU-301S No: 24
15  ml Tubo de CentrífugaGreiner Bio-One188271S No: 25
50  ml Tubo de CentrífugaGreiner Bio-One227261S No: 26
Piruvato de sódioInvitrogen11360S No: 28
β-mercaptoetanolSigmaM7522S No: 29
Prigrow III meioABMTM003S No: 31
Condessa ™ Contador de CélulasInvitrogenC10227S Nº: 32
Sistema de raios-X FaxitronFaxitronCellRadS Nº: 33
AccutaseInnovative cell TechnologiesAT-104S Nº: 34
CollagenaseLife Technologies17104019estoque de 1mg/ml; S Nº: 35
DispersãoSTEMCELL Technologies7923Nº S: 36
hESC matrigel qualificadoBD Biosciences354277Para diluir, use DMEM/F-12 frio; S No: 37
bFGFR & D233-FBEstoque 10 ug/ml; S No: 38
ParaformaldeídoEMS157104% de estoque em PBS; S Nº: 39
TRA-1-60Santa Cruzsc-217051/100; S Nº: 40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100; Nº S: 41
Tween 20SigmaP9416-100MLNº S: 42
Kit de fosfatase alcalinaStemgent00-0055Nº S: 43
Proteína Cas9PNA BioCP01-50Descongelamento e alíquota; S No: 44
Soro de cabra ou burroSigmaD9663 / G9023S No: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS No: 46
DAPIThermo ScientificD1306S No: 47
TrisSigma9285-100MLS No: 48
NaCLSigmaS7653-250GS No: 49
EDTASigmaBP2482-500S No: 50
T4 DNA ligaseNEBM0202TS Nº: 51
Mega Shortscript T7 kitThermo ScientificAM1354S Nº: 52
Mega Clear kitThermo ScientificAM1908S Nº: 53
SMC4BD Biosciences354357S Nº: 54
FibronectinaSTEMCELL Technologies7159S Nº: 55
CloneJET clonagemThermo ScientificK1232S Nº: 56
Analisador de fragmentosTMAdvanced AnalyticalNº S: 57
mTeSR1 kit médioSTEMCELL Technologies5850Quente à temperatura ambiente; S No: 58
Meio de congelamento mFreSR™STEMCELL Technologies5855S No: 59
Meio de congelamento CryoStor®STEMCELL Technologies7930S Nº: 60
MEFsGlobalstemGSC-6301GS Nº: 61
L-glutaminaInvitrogen25030081S Nº: 62
Células pancreáticas humanasABMT0159S Nº: 63
STEMdiff™ Meio de Indução NeuralStemcell Technologies5835S Nº: 64
RPMIThermofisher11875-093S Nº: 65
2% B27-insulinaThermofisherA1895601S Nº: 66
CHIR99021Stemcell Technologies72052S Nº: 67
IWP4Stemcell Technologies72552S Nº: 68
2% B27Thermofisher17504044S Nº: 69
MCDB 131Life Technologies10372019Nº S: 70
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS8761-100MLNº S: 71
GlicoseSigma-AldrichG8270-100GNº S: 72
BSAProliant68700Nº S: 73
GDF8Pepro-Tech120-00Nº S: 74
TUJ1 anticorpoEMD MiliporeAB9354S Nº: 75
Anticorpo NKX2-5Santa CruzSc-14033Nº S: 76
Anticorpo SOX17R & D systemsAF1924S No: 77
Iodeto de propídioThermo ScientificP3566S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™LonzaAAF-1002S Nº: 79
FACSAria II (classificador de células)BD biosciencesSORP UVS Nº: 80

Referências

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