Artigo de método

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

DOI:

10.3791/56308

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24 de janeiro de 2018

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um romance tridimensional em vitro modelo, onde as células do estroma corneana e diferenciada de células neuronais são cultivadas juntos para ajudar na análise e compreensão das interações dos tipos de célula de dois.

Resumo

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Engenharia de tecidos ganhou reconhecimento substancial devido à alta demanda para as substituições de córnea humana com cerca 10 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda de visão da córnea1. Para atender a demanda de córneas humanas viáveis, progressos significativos em tecido tridimensional (3D) engenharia foi feita2,3,4. Estes córnea modelos variam de sistemas monocamada simples até modelos de várias camados, levando a 3D cheio-espessura corneal equivalentes2.

No entanto, o uso de uma córnea 3D engenharia de tecidos, no contexto dos modelos de doença em vitro estudou a semelhança de falta de data para a estrutura de várias camadas de tecido corneal 3D, função e a interconexão dos diferentes tipos de células (ou seja, nervo, epitélio, estroma e endotélio)2,3. Além disso, a procura de modelos de tecido em vitro córnea tem aumentado na tentativa de reduzir a testes em animais para produtos farmacêuticos. Assim, modelos mais sofisticados são necessários para melhor coincidir com sistemas às exigências fisiológicas humanas e o desenvolvimento de um modelo que é mais relevante para a população de pacientes seja absolutamente necessário. Dado que vários tipos de células na córnea são afetados por doenças e distrofias, tais como ceratocone, ceratopatia diabética e Fuchs, este modelo inclui um modelo 3D co-cultura de fibroblastos da córnea humanos primários (HCFs) de doadores saudáveis e os neurônios de a linha de celular de SH-SY5Y. Isto permite-pela primeira vez investigar as interações entre os tipos de dois célula dentro do tecido da córnea humano. Acreditamos que este modelo poderia potencialmente dissecar os mecanismos subjacentes associados com as interações de nervo do estroma corneal doenças que apresentam danos do nervo. Este modelo 3D espelha a natureza básica de anatômica e fisiológica do tecido corneal na vivo e pode ser usado no futuro como uma ferramenta para investigar defeitos da córnea, bem como a eficácia dos vários agentes de triagem antes de testes em animais.

Introdução

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No corpo humano, a córnea é o tecido mais densamente inervado. Os nervos são responsáveis por várias sensações como o toque, dor, temperatura e também têm um papel essencial na cicatrização de feridas, piscar reflexos, rasgar a produção e secreção de5,6,7. Na córnea, estromais troncos nervosos surgem do plexo limbal e insira o estroma da córnea periférico radialmente. A organização do nervo do estroma é paralela as lamelas de colágeno e eles ainda mais ramificam em fascículos menores como proceder para o estroma superficial5,8. As fibras nervosas mais penetrar a camada epitelial e assim, inervação é amplamente espalhada por todo o epitélio corneano e o estroma. Portanto, a inervação tem um papel essencial no estado saudável e doente da córnea. Neste protocolo, revelamos o avanço de um modelo novela 3D em vitro , que é a primeira de seu tipo para imitar as interações do estroma-nervo na vivo . A linha de celular de SH-SY5Y foi utilizada para este estudo, como é uma das linhas mais estabelecidas, bem caracterizadas usadas para estudar o crescimento neuronal. A linha de celular de SH-SY5Y tem sido descrita para produzir ambos os aderentes do substrato (tipo S) e neuroblastic (N-tipo) de células que podem sofrer transdiferenciação celular9. Como resultado, mesmo que esta linha de celular é derivada de uma seleção de triplo subclone sucessivas de células de tipo N, ele também contém um pequeno número de células do tipo S capazes de sofrer diferenciação em neurônios através do uso de retinoico ácido e derivado do cérebro Neurotrophic factor9. Isso fornece uma ferramenta que pode levar a uma melhor compreensão das complicações da córnea associado com retinopatia diabética (DM) e outras doenças oculares. Devido as dificuldades associadas com a obtenção e cultivo de neurônios de pacientes com doença ocular, este modelo 3D em vitro fornece implicações substanciais em estudar as interações neuronais e sinalizando com o estroma corneano.

Condições de doentes frequentemente afetam vários tecidos do corpo a uma escala muito grande, levando a uma qualidade de vida comprometida. Distrofias oculares são complicações comuns, frequentemente associadas com doenças sistêmicas e levam à perda de acuidade visual ou perda de visão até mesmo permanente. Estudos exaustivos muitas vezes são essenciais para uma melhor compreensão da condição da doença, bem como os efeitos a nível celular basal. Para estudar os efeitos de tais doenças, foram desenvolvidos vários modelos in vivo e in vitro com a ajuda de aplicações de engenharia de tecidos. Aplicações da engenharia do tecido corneal tem atraído grande interesse através dos vários campos da ciência10,11,12,13,14, mas existem ainda grandes limitações durante aplicação real, incluindo corneal enxerto rejeições, infecções e cicatrizes10,11,12,13,14. Existem vários estudos que desenvolveram com sucesso e estabeleceu várias em vitro modelos3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Os modelos 3D em vitro são os mais promissores e de grande interesse científico. Modelos 3D são conhecidos para melhor espelhar na vivo celular e fisiológico eventos que são essenciais durante a fibrose e o ferimento de28,de27,de15,cura29. Estes modelos em vitro desempenham um papel integral na busca de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de condições diferentes da doença, incluindo complicações da córnea. Apesar do papel crítico da inervação em funções da córnea, fez pouco esforço para promover a proliferação de nervo periférico dentro de construções de engenharia de tecido corneal2,3. No entanto, as construções propostas 3D em vitro celular imitam o tecido-alvo para atingir a funcionalidade do tecido desejado.

Enquanto keratopathy diabética é uma aplicação óbvia para o modelo aqui descrito por defeito neuronal, existem várias outras doenças da córnea que podem se beneficiar de um modelo humano em vitro incluindo distrofias ceratocone e Fuchs. Nosso modelo 3D emerge esta perspectiva e propõe o desenvolvimento de uma representação em vitro do tecido da córnea para avaliar a administração de medicamentos e segurança de novos medicamentos oculares.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão de Universidade de Oklahoma Health Sciences Center/institucional (IRB #4509). Todas as partes do protocolo de conheceram os princípios da declaração de Helsinki. Corneais amostras foram obtidas de desenvolvimento nacional e Instituto de pesquisa (NDRI) e o banco de olhos do Lions de Oklahoma.

1. isolamento de células primárias

  1. Após a recepção de amostras de tecido da córnea humana, transferir os tecidos em um 21,5 cm2 placa de Petri contendo 2 mL de fosfato salino de estéril Dulbecco (DPBS) (1x).
  2. Raspar e remover o epitélio corneano posicionando a córnea cúpula viradas para cima. Para garantir a remoção completa, raspar a camada epitelial cuidadosamente, usando uma lâmina de barbear em um ângulo de 45°. Em seguida, virar a córnea cúpula virada para baixo e completamente raspar o endotélio do estroma com uma lâmina de barbear em um ângulo de 45° para assegurar a completa remoção. Lave o tecido estromal com DPBS.
  3. Corte os tecidos stromal em pedaços pequenos, usando uma lâmina cirúrgica n º 10, mantendo as peças do estroma molhadas em todo tempo usando DPBS. Pegar peças do estroma com pinça estéril e coloque em um frasco de cultura T25 sem mídia (4 ou 5 pedaços de tecido de 2 x 2 mm por balão).
  4. Permitir que os explantes aderir ao fundo do balão a 37 ° C por cerca de 30-40 min. Uma vez aderido, lentamente adicione mínimo essencial meio do águia (EMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% antibiótico/Antimycotic no balão sem perturbar os explantes.
  5. Delicadamente, coloque o frasco na incubadora a 37 ° C, 5% de CO2. Deixe os explantes imperturbado até as células começam a isolar e a migração do balão. Após aproximadamente 2-4 semanas, as células devem alcançar confluência de 100%. Após a confluência de 100%, passagem as células, removendo os meios de cultura de tecido e lave as células com DPBS.
  6. Adicionar tripsina para as células e então eles incubar a 37° C. Após cerca de 5 min, ver as células sob microscopia de luz, para confirmar que eles têm destacado e depois parará a proteólise adicionando mídia fresca.
  7. Transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL por centrifugação a x 1.000 g. remover o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o sedimento e suspender as células no EMEM fresco 10% FBS 1% antibiótico. Contar as células e propagar a cerca de 1 x 106 células no frasco de cultura T75 para expansão ainda mais com EMEM fresco 1% FBS 1% antibiótico.

2. primário HCFs cultura e montagem de construções 3D

  1. Para montar 3D construções do explants EMEM anteriormente cultivado em 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic, passagem e contagem HCFs.
  2. 10% de sementes aproximadamente 1 x 106 células/poço de HCFs primários em policarbonato inserções de membrana com poros de 0,4 µm das construções 3D, juntamente com 1,5 mL de fresco EMEM FBS 1% antibiótico/Antimycotic para o topo da construção. Adicione outro 1,5 mL do mesmo meio para o fundo de cada construção.
  3. Após 24h de célula semeadura, cultura de células com EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic, estimulados com o ácido 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamina C) de 0,5 mM por adicionar 1,5 mL no topo e 1,5 mL na parte inferior de cada construção.
  4. Manter as culturas em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 por 3 semanas e fornecer mídia fresca todos os dias durante o período de estudo inteiro. Nenhuma passagem adicional é necessária.

3. diferenciação e co culturas de pilha

  1. Após 3 semanas, adicionar 8 x 103 células/poço de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y no topo o 3D previamente montado constrói com 1,5 mL do EMEM contendo 10% FBS, 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 1% antibiótico/Antimycotic e 0,5 mM ácido (vitamina C).
    1. Permitir que as células de neuroblastoma de SH-SY5Y de crescer em cima de células do estroma da córnea pelo menos 24 h antes de iniciar a diferenciação celular.
  2. Iniciar a diferenciação de células SH-SY5Y, estimulando as células com EMEM contendo 1% FBS e 1,5 mL de 10 µM ácido retinoico no topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) para o fundo de construção. Observe que o passo ácido retinoico deve ser realizado no escuro.
    1. Continue a cultura de células na mídia diferenciação por 5 dias.
  3. Quando as células atingem a fase de diferenciação, alternar as células a 1,5 mL de soro livre mídia contendo 2 nM de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1% antibiótico/Antimycotic adicionado para o EMEM, adicionando ao topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) para o fundo de construção. Observe que a etapa BDNF deve ser realizada no escuro.
  4. Cultura de células para 2 dias adicionais antes do processamento para qualquer análise mais aprofundada como indicado na tabela 1.

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Resultados

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A Figura 1 é uma passo a passo imagem representativa do modelo de trabalho 3D em vitro . Na primeira etapa, as células são isoladas da córnea humana. Em seguida, são cultivadas em uma membrana de policarbonato e estimuladas com vitamina C para montar uma matriz 3D auto secretado. Este sistema de construção 3D induz a síntese de um várias camadas celulares na vivo-como matriz do estroma. Posteriormente, as células de neuroblastoma são semeada...

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Discussão

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Vários estudos têm sido focados no desenvolvimento de vários modelos de animais que podem ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de doenças da córnea, bem como descobrir tratamentos. No entanto, um valor significativo para os seres humanos destes estudos não foi verificado. Até à data, vários em vitro modelos foram desenvolvidos e amplamente investigadas devido a sua notável importância clínica. Nosso modelo estabelecido anteriormente 3D em vitro é um sistema inovador que significativamente contrib...

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Divulgações

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

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Gostaríamos de estender nossos sinceros agradecimentos ao Dr. Ben Fowler para sua ajuda técnica com os experimentos de temperatura.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tecido saudável da córneaNDRIAmostras de doadores sem trauma ocular ou doença sistêmica
Dulbecco' s Solução Tamponada com Fosfato (1X)Gibco da Life Technologies14190-144
Pinça EstérilFischer Scientific13-812-42Pinça de Fragmentação de Ponta Extra-Fina Fisherbrand Lâminas de
barbear de borda únicaPersonna270100
Lâminas de bisturi cirúrgico estéreis No.10Lâmina Cirúrgica de Penas2976#10
Eagle' s Meio Essencial MínimoATCC30-2003
Soro Fetal BovinoAtlanta BiologicalsS1155010% FBS é necessário para a preparação
do meio Antibiótico-Antimicótico (100X)Gibco da Life Technologies15240-0621% Antibiótico-Antimicótico é necessário para a preparação do meio
0,05% Tripsina EDTA(1X)Gibco da Life Technologies25300062
Inserções de membrana de policarbonato com 0,4-μ M porosCorning Costar3412
2-O-&alfa;-Dglucopiranosil-L-ácido ascórbico (Vitamina C)Sigma-AldrichSMB00390-14Uma concentração de 0,5 mM deve ser usada para o estudo
Bloco de ceraVWR50-949-027
SH-SY5Y Células de neuroblastomaATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Ácido retinóicoSigma-AldrichSRP3014-10UGConcentração final de 10uM precisa ser usada
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGConcentração final de 2nM precisa ser usada
Dimetilsulfóxido(DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5DMSO de grau ultrapuro estéril a ser usado
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cultura de Células Tratadas EasYFlasks (T75)Fisher Scientific12-565-349

Referências

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  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395(2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

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