Este protocolo descreve um método para injetar plasmídeo no rim do rato através da pelve renal para produzir a expressão do transgene especificamente no rim.
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Artigo de método
Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim
Neste artigo
Resumo
Resumo
Injeção hidrodinâmica cria um ambiente local, de alta pressão para transfect vários tecidos com o Plasmídeo e outras substâncias. Injeção de veia de cauda hidrodinâmica, por exemplo, é um método bem estabelecido, pelo qual o fígado pode ser transfectado. Este manuscrito descreve uma aplicação dos princípios hidrodinâmicos pela injeção do rim do mouse diretamente com plasmídeo para expressão de genes específicos do rim. Os ratos são anestesiados e o rim é exposto através de uma incisão de flanco, seguida por uma injeção rápida de um plasmídeo que contém ADN solução diretamente na pelve renal. A agulha é mantida no lugar por 10 segundos e o local da incisão é suturado. No dia seguinte, ao vivo de imagem animal, borrão ocidental, ou imuno-histoquímica pode ser utilizado para ensaiar a expressão do gene ou outros ensaios adequados para o transgene de escolha são utilizados para a detecção da proteína de interesse. Métodos publicados para prolongar a expressão gênica incluem tratamento de integração e ciclofosfamida mediada por transposon transgene para inibir a resposta imune para o transgene.
Introdução
A técnica de injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se uma forma comumente usada para alcançar altos níveis de expressão gênica em rato fígado1,2. Os rins também são transfectados por esta técnica em um nível muito inferior, aproximadamente 100 vezes menos3. A injeção hidrodinâmica pelve renal descrita aqui fornece uma maneira simples de controlar a especificidade da expressão do órgão através de meios físicos, usando os mesmos princípios hidrodinâmicos que foram criados anteriormente no fígado4,5 , músculo
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comitês (IACUCs) da Baylor College of Medicine e Vanderbilt University Medical Center.
1. preparar a solução de DNA para injeção
- Selecione o plasmid(s) expressar o transgene cuidadosamente para maximizar as características desejáveis para melhorar a eficiência da transfecção e expressão do transgene.
Nota: Injeção hidrodinâmica pelve renal de plasmídeos de expressar o marcador fluorescente TdTomato, a eritropoietina hormônio (Epo) e luciferase de vaga-lume tem sido descrito anteriormente11. Se não houver um ensa....
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Resultados
A técnica de cirurgia e injeção são simples para executar uma vez dominado, exigindo sem grandes equipamentos ou materiais caros. Se novo para cirurgia de rim de flanco-incisão, um dia de treinamento em vários ratos agendada para eutanásia devem em que os ratos não são recuperados de cirurgia seguir porque a primeira tentativa desta cirurgia pode levar muito mais tempo do que o normal. Alternativamente, os investigadores familiarizados com técnicas similares podem achar bastante simples. .......
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Discussão
Neste protocolo é descrito um método robusto para atingir a expressão do gene pode ser reproduzido especificamente no rim. Nas mãos de um cirurgião experiente moderadamente encontramos a porcentagem de ratos transfectadas por esta técnica para estar na faixa de 50-100%, dependendo da idade do rato e a sensibilidade da leitura do transgene. O nível de expressão do gene do luciferase foi acima do fundo por vários meses em ratos recebendo piggyBac transposões e completamente mantido por várias semanas em ratos imun.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar e não declarar nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
American Heart Association [15GRNT25700209] suporte J.C. e com um prêmio de desenvolvimento de carreira do departamento de assuntos de veteranos [BX002797] suporte L.E.W. e o National Institutes of Health [R01-DK095867] O National Institutes of Health [DK093660], departamento de assuntos de veteranos [BX002190] e o centro de Vanderbilt para doença renal com suporte M.H.W. Este material é o resultado de trabalho apoiado com recursos e utilização das instalações do sistema de cuidados de saúde VA Tennessee Valley.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anestésico - Substância não controlada |
| Seringa de insulina BD 0,5 mL 29G 1/2 polegada | Cardinal Health | 309306 | seringas necessárias |
| Buprenex | Farmacêutico / Veterinário | Analgesia - Substância Controlada | |
| Dynarex Cortina de toalha descartável | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Coloque sobre a almofada de calor |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use apenas DNA de plasmídeo livre de endotoxina |
| Endosafe Gel-Clot LAL Controle Positivo Rápido | Charles River | PC200 | Controle positivo para teste de endotoxina |
| Endosafe Gel-Clot LAL Frasco de Teste Único | Rápido Charles River | R13500 | Teste de endotoxina |
| Tesoura de Dissecação Micro Extra Fina | Roboz Surgical Instrumento | RS-5882 | Ferramenta cirúrgica |
| Bolsa de esterilização de selagem instantânea Fisherbrand - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | Para autoclavagem de ferramentas cirúrgicas |
| Bomba de calor Gaymar | Paragon Medical | TP-700 | Bomba de calor circulante de água |
| Germinador 500 | Instrumento cirúrgico Roboz | DS-401 | Para reutilizar ferramentas cirúrgicas durante a cirurgia |
| Graefe Fórceps | Roboz Instrumento Cirúrgico | RS-5136 | Ferramenta Cirúrgica |
| Graefe Tecido Fórceps | Roboz Instrumento Cirúrgico | RS-5153 | Ferramenta Cirúrgica |
| Halsey Porta-Agulhas, 5" Comprimento | Instrumento Cirúrgico Roboz | RS-7841 | Almofadas |
| cirúrgicas - 15" x 21" - precisa de pelo menos 3 | Paragon Medical | TP22G | Para uso com Bomba de Calor |
| GaymarIsoFlo (Isoflurano, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | Para imagem e eutanásia |
| Vaporizador do Sistema de Entrega de Isoflurano | Isotec Smiths Medical | VCT3K2 | Para imagem e eutanásia |
| Anestésico | veterinário | de cetamina | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Tecidos |
| Software de imagem viva | Caliper Life Sciences | Para imagens de animais vivos | |
| Luciferina | Perkin Elmer | 122796 | Para imagens de animais vivos |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Espectrofotômetro para medição de DNA |
| Cotonetes Prevantics | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | Para preparação de cirurgia de pele |
| Prolene 5-0 suturas Cone 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Suturas não absorvíveis para a pele |
| Pomada Oftálmica da Marca Puralube | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Para manter os olhos úmidos durante a cirurgia |
| Trans IT - Solução de Entrega Hidrodinâmica QR | Mirus Bio | MIR-5240 | Tampão de entrega hidrodinâmico para diluir o DNA |
| Vicryl 5-0 Suturas J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Suturas absorvíveis para camada muscular |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Barbeador para preparação da pele |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Ciências da Vida | Para imagens de animais vivos |
Referências
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....
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Reimpressões e permissões
