Geração de modelos de célula de câncer de próstata de resistência para o agente antimitótica Docetaxel

Um aumento da taxa de proliferação, causada pela perda de controlo do ciclo celular é uma marca registrada de câncer¹. Esta propriedade funcional processa células cancerosas exclusivamente dependente a fidelidade dos processos-chave do ciclo celular durante a S - e M-fases, que levou ao desenvolvimento de vários ciclo celular distorçer drogas que induzem o DNA danos ou defeitos mitóticos. Apesar de numerosos agentes antimitóticos, como inibidores de quinases mitóticas ou proteínas do motor, estão actualmente a ser desenvolvido e testado em ensaios clínicos, legado do microtubule direcionamento MTAs (agentes) continuam a ser a única abordagem clinicamente aprovada para direcionamento de mitose em câncer^2,3,4. MTAs ou desestabilizam (vimblastina, vincristina, Vinorelbina) ou estabilizar microtúbulos (derivado de taxano agentes Paclitaxel, Docetaxel ou Cabazitaxel) e, assim, evitar a formação de um funcionamento fuso mitótico^5,6. Esses agentes acionar o eixo conjunto posto^7,8, que resulta em uma prolongada detenção mitótica e a morte eventual de célula em células cultivadas^9,10 e defeitos mitóticos em tumores^{11 ,12} e são, portanto, útil para tratar uma grande variedade de cânceres, entre eles o câncer de próstata¹³.

Câncer de próstata é o mais frequentemente diagnosticado câncer e das principais causas de câncer relacionados a mortes em homens¹⁴. Agentes antimitóticos como Docetaxel melhorar a sobrevida do paciente com câncer de próstata e são dos pilares no tratamento desta doença^15,16,17. Infelizmente, apesar do encolhimento do tumor inicial, as células do tumor frequentemente desenvolvem resistência aos medicamentos durante o tratamento. Vários mecanismos celulares têm sido implicados em causar o desenvolvimento de chemoresistance, incluindo desregulamentação de apoptotic e vias inflamatórias ou ativação/superexpressão de bombas de efluxo de drogas como o ATP-binding cassette transportador P-glicoproteína (P-gp/ABCB1), o último dos quais resulta na exportação de agentes quimioterápicos, fora as células^18,19. Resistência à taxanos também tem sido associada com outras causas, tais como mudanças na expressão de tubulina isotipos ou mutações de tubulina, que impedem a interação entre a droga e seu alvo ^20,21. Além disso, resistência tem sido relacionada com acúmulo de instabilidade do genoma e tumor heterogeneidade^22,23. No entanto, os mecanismos que contribuem para a resistência de taxano não são completamente compreendidos, que manifesta-se pela ausência de estratégias terapêuticas que impedem a sua aparência. Portanto, há uma necessidade urgente para gerar modelos experimentais que auxiliam na dissecação desses mecanismos e identificar novas abordagens terapêuticas que impedem o desenvolvimento de resistência a estas drogas.

Neste artigo nós descrevemos um método que permite a geração de Docetaxel-resistente (DR) células cancerosas da próstata. Além disso, descreveremos como validar o status de resistência dessas células utilizando ensaios de formação de colônia e RT-PCR quantitativo. As células produzidas por esse método tem a vantagem de muitas das características moleculares encontradas em bancos de dados de amostra de tumor humano disponível publicamente com o benefício adicional de fornecer a versatilidade para executar uma grande variedade de ensaios experimentais sobre recapitulando longos períodos de tempo do que o permitido por amostras do tumor. Estes modelos de câncer de resistência de terapia podem ser expandidos por muitas semanas em cultura de tecidos e entre outras abordagens, pode ser geneticamente manipulados, visualizados por métodos de microscopia e analisados para expressão gênica. Além disso, eles podem ser xenotrasplanted em ratos para analisar mais efeitos no tumor de formação e crescimento em vivo. Atualmente, o principal método alternativo para estudar a resistência a medicamentos no contexto do câncer de próstata é a análise direta de amostras do tumor. Enquanto estas amostras apresentam um sistema muito potente para reunir informações sobre expressão gênica e status mutacional dos tumores determinados, acesso a eles pode ser muito limitado, e são difíceis de manter por mais manipulações e análise experimental, que pode ser feito facilmente com as linhas de célula geradas com este protocolo^24,25. Importante, no futuro, alternativa abordagens tais como a geração de humanos organoids derivada diretamente de pacientes seria uma ferramenta muito poderosa e alternativa para o presente método^26,27. Uma vez que eles serão recapitulate em um contexto 3D, um tumor que estava em seu ambiente original, organoids será o modelo perfeito entre linhagens celulares e tumores humanos. Ainda, os modelos de celular experimental descritos neste protocolo são ainda mais acessíveis para manter e apropriado para uma análise mais rápida. Os resultados obtidos através do estudo dessas linhas de células podem ser extrapolados para e corroborados em amostras humanas e culturas 3D. Portanto, este protocolo pode ser de interesse para os investigadores procuram modelos de celular estudar os mecanismos de chemoresistance em qualquer linha de celular, desde que nosso protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros tipos de câncer e drogas. Os métodos descritos aqui são fáceis de aplicar em qualquer laboratório, acessível e permitir estudos preliminares dos mecanismos moleculares e celulares da resistência às drogas.

1. determinação da concentração de Docetaxel, causando 50% diminuição na capacidade de formação de Colônia (IC50)

Nota: neste protocolo, concentração de Docetaxel IC50 foi avaliada usando a formação da colônia capacidade. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (i.e., ensaios MTS) podem ser usados com base na investigadores ' preferências.

1. DU145 crescer ou 22Rv1 células em balão ² 75cm e preparar o estoque suficiente de 10mm Docetaxel diluído em DMSO para ser utilizado em experiências futuras.
2. Para placa células para determinação de IC50 de Docetaxel, remova a mídia do recipiente, lavar cuidadosamente as células com 5 mL de PBS e incubar com 2ml 0.05% Trypsin-EDTA para 3-5 min a 37 ° C para separar as células da superfície do balão.
3. Enxaguar as células trypsinized do frasco com 5 mL de mídia fresca e coletar a suspensão de células em um tubo de 15 mL. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, 3 min, temperatura ambiente (RT)).
4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de mídia fresca... contar as células. Diluir a suspensão de células para 2 a 2,5 x 10 ⁵ células/mL para DU145 e 4-4,5 x 10 ⁵ células/mL para 22Rv1, misture bem pipetando para cima e para baixo e 2 mL da suspensão em cada poço de duas placas de 6-poços de sementes.
5. Após 24 h, quando as células encontram-se na confluência de 70-80%, adiciona concentrações de Docetaxel aumentando a dose de 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM e 1000 nM para cada poço. Tratar o controle bem com DMSO em maior volume usado para Docetaxel ( Figura 2A).
6. Depois de 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar 2 mL de mídia fresca. Dentro de aproximadamente 4-5 dias, as placas estarão prontas para a coloração.
7. Para manchar as colônias, lave-os delicadamente com 2-3 mL de PBS e incube-os com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p/v em formol a 10%) por dentro do capô de cultura de tecidos ou uma coifa de 20 min.
8. Remover placas coloração de solução e lavagem com 2-3 mL de H ₂ O, retire H ₂ O e placas de secar ao ar.
9. Analisar os resultados através da visualização dos poços para determinar qual deles tem a concentração de Docetaxel que diminui a viabilidade celular em 50% (IC50). Manualmente a contagem das colónias com a ajuda de uma caneta (para evitar a contagem das colônias mesmas duas vezes) e representam o percentual de viabilidade celular em um gráfico ( Figura 2A). Finalmente, tirar imagens digitais das placas para representação de figura (como mostrado na Figura 3A).

2. Geração de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel

Nota: realizar tratamentos de célula usando o mesmo estoque de solução de Docetaxel utilizado para determinação da concentração de fármaco IC50 (preparar estoque suficiente antecipadamente a experimental Use). Mantenha sempre um pequeno frasco de células da etapa anterior, no caso de algo não funciona bem. Células parentais devem ser cultivadas em paralelo em um pequeno frasco durante todo o processo e expostas ao veículo (DMSO) em volumes correspondentes imitando os montantes utilizados em balões o Docetaxel Tratado.

1. Células DU145 placa ou 22Rv1 em frascos de ² a 150 cm, contendo 20 mL de mídia (3.5 x 10 ⁶ células por balão para DU145 e 6.5 * 10 ⁶ células por balão para 22Rv1). Recomenda-se uso de balões de 10 a 20 de células ter células suficientes, ao final do protocolo.
2. Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência ( Figura 2B, antes Docetaxel), adicionar Docetaxel na concentração IC50 determinada na etapa 1 do protocolo (5 nM para as células descrito neste protocolo).
3. Depois de 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar mídia fresca, livre de Docetaxel ( Figura 2B, 72 h após Docetaxel). Altere os meios de comunicação a cada 3-4 dias. Aproximadamente 1-2 semanas, clones resistentes aparecerão evidentes sob o microscópio ( Figura 2B, 7 e 14 dias depois de Docetaxel).
4. Mídia, Aspire, lavar cuidadosamente as células com 15 mL de PBS e incubar com 4 mL 0,05% Trypsin-EDTA para 3-5 min a 37 ° C para separar as células da superfície do balão.
5. Resuspend trypsinized células de frasco com 8 mL de mídia fresca. Células de piscina de todos os frascos de tratados. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, 3 min, RT).
6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de mídia fresca placa as células em frascos de ² 150 cm (3.5 x 10 ⁶ células por balão para DU145 e 6.5 * 10 ⁶ células por balão para 22Rv1).
7. Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência, adicione 5 nM Docetaxel (concentração inicial de IC50) novo.
8. Repita as etapas de 2,3 para 2,6 no dia 3.
9. Após 24 h, quando as células estão em cerca de 70-80% confluência, células de deleite com 2 X IC50 Docetaxel concentração (10 nM para as células descrito neste protocolo).
10. Repetir passos 2.3 a 2.8, seguindo uma dose-escalonamento das concentrações de Docetaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM e 250 nM), para gerar uma população estável de células crescendo em seus balões sob a mais alta concentração final. Para concentrações mais elevadas, o protocolo de escalonamento de dose pode ser implementado por até 6 meses até que a concentração de 1.000 nM é alcançado ( figura 1A).

3. Funcionais caracterização de adquiriu Docetaxel resistência por ensaio de formação de colônia

Nota: neste protocolo, chemoresistance foi avaliada utilizando ensaios de formação de colônia. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (i.e., ensaios MTS) podem ser usados com base na investigadores ' preferências.

1. Placa 2.000 células (DU145 ou 22Rv1, parental e Docetaxel-resistente) por bem em placas de 6-poços, usando 2 mL de mídia por alvéolo.
2. Após 24 h, adicionar o aumento das concentrações de Docetaxel (células parentais: 0.25, 0.5, 1, 2,5 e 5 nM; Células de DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM). Para tanto, DU145 e 22Rv1 linhas de célula. Adicionar o DMSO somente para um bem como um controle no mesmo volume utilizado para a dose mais elevada de Docetaxel.
3. Após 72 h, aspirar a droga contendo mídia e adicionar mídia fresca livre de Docetaxel.
4. Incubar as placas durante 1-2 semanas até que colônias são visíveis sob o microscópio.
5. Para manchar as colônias, lave-os delicadamente com 2-3 mL de PBS e incube-os com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p/v em formol a 10%) por dentro do capô de cultura de tecidos ou uma coifa de 20 min.
6. Remover placas coloração de solução e lavagem com 2-3 mL de H ₂ O, retire H ₂ O e placas de secar ao ar.
7. Analisar resultado visualizando os poços e manualmente, contando as colónias com a ajuda de uma caneta (para evitar a contagem das colônias mesmas duas vezes) e representam o percentual de viabilidade celular em um gráfico. Levar imagens digitais das placas para representação de figura ( Figura 3A).

4. Fenotípica caracterização de Docetaxel resistência adquirida fenótipo através de análise de qRT-PCR

Nota: células Docetaxel-resistente (DR) apresentam um perfil de expressão diferente em comparação com suas linhas de célula parental ^{28 , 29}. portanto, o sucesso da seleção pode ser verificado por qRT-PCR utilizando primers para marcadores específicos (para sequências da primeira demão, consulte a seção materiais; para obter detalhes, consulte a seção de resultados). Isso deve ser feito após cada rodada de seleção começam após a terceira rodada. Alternativamente, também é possível a avaliação do fenótipo resistente ao Docetaxel pela mancha ocidental.

1. Extrair RNA das células parentais e Docetaxel resistente usando um kit de extração de RNA e a seguir o fabricante ' instruções de s (veja a Tabela de materiais e reagentes para detalhes). Usando um mínimo de 1-2 x 10 ⁶ células recomenda-se.
2. Quantify RNA em 260 nm a absorvência, usando um espectrofotômetro. Para melhor pureza, os rácios de absorvância nm nm/280 260 devem estar perto de 2.0.
3. PerfoRM reverso transcrição para obter DNA complementar (cDNA) usando o kit de transcrição reversa e seguindo o fabricante ' instruções de s (consulte a Tabela de materiais e reagentes para detalhes), usando 1 µ g de RNA em um 20 µ l mistura de reação (se é necessário uma maior quantidade de cDNA, ampliar o mix de reação conformemente).
4. Preparar a reação de qPCR em triplicado para cada gene de interesse, como segue:
   - 2 µ l de primer para a frente de 10 µM
   - 2 µ l de primer reverso de 10 µM
   - 10 mistura de mestre SYBR Green PCR µ l
   - 5 µ l H ₂ O
   -1 µ l de o cDNA recém preparado da etapa 4.3.
   Nota: Consulte a Tabela de materiais para as sequências dos primers utilizados neste protocolo.
5. Definir o programa PCR como segue:
   - 95 ° C por 15 min
   - 94 ° C por 30 s |
   -56 ° C durante 40 s | 40 vezes
   - 72 ° C por 30 s |
6. Para analisar resultados de qPCR e determinar alterações na expressão gênica entre parentais e DR amostras, os valores de limiar (Ct) de ciclo para cada gene de interesse são determinados em triplicado e a média normalizada para o controle de carregamento (média três vias de actina ) para DR (Ct DR) e células parentais (parental do Ct). Valores das células parentais são normalizados para 1. ΔCt (DR - Ct, Ct parental) é determinado a obter mRNA final prega mudanças e representado em um gráfico. Um aumento de > 2 ou uma diminuição de < 0,5 são considerados significativos e uma boa validação do estabelecimento do Docetaxel adquiriu o fenótipo resistente ( Figura 3B).

Este protocolo vai levar à geração de células de câncer de próstata resistente a Docetaxel (DR). O cronograma para conclusão pode variar de 4 a 7 meses como resumidos na representação esquemática das etapas protocolo na figura 1A e figura 1B. O investimento de tempo pode diferir dependendo da linhagem celular de escolha e a gama de concentrações de droga usado conforme descrito no protocolo. Importante, a determinação da concentração de Docetaxel IC50 para cada linha de celular permite o desenho da droga aumentando o intervalo de concentração para uso no protocolo para as células de escolha (Figura 2A). Uma vez que o protocolo é iniciado, os efeitos iniciais Docetaxel em células DU145 e 22Rv1 podem ser observados em pontos diferentes do tempo sob o microscópio para monitorar se o protocolo está funcionando corretamente. Sugeriu que os pontos de tempo para monitorar o processo de tratamento de Docetaxel são: antes da exposição ao Docetaxel (linha de base), após a exposição de Docetaxel para 72 h, dias 7 e 14 dias. Observe que apenas uma minoria de células tumorais sobreviver à exposição de Docetaxel e gerar clones, que podem ser observadas ao microscópio (Figura 2B).

Ensaios de formação de colônia representativa e gráficos de quantificação de parental e as células recém-gerado Docetaxel-resistente (DR) são mostradas na Figura 3A. Observe que as células resistentes ao Docetaxel geradas podem sobreviver as concentrações de drogas até 1,000-fold mais elevadas do que as células parentais.

Finalmente, o fenótipo resistente ao Docetaxel pode ser validado por qRT-PCR (Figura 3B). Observe que células resistentes ao Docetaxel, em comparação com as células parentais, exibem regulação característica de ABCB1 e GATA2 e para baixo-regulamento de CK19 e CDH1. Estes genes foram selecionados para validação porque temos já experimentalmente demonstrado no nosso trabalho anteriormente publicado GATA2 upregulation e downregulation de CK19 juntamente com CDH1 em ambos de28,de modelos de célula DR29. O gene ABCB1 também foi selecionado como um gene descontínuas que tem sido mostrado por outros para ser consistentemente upregulated em células resistentes aos medicamentos18,19. No entanto, é importante notar que outros genes podem ser escolhidos de acordo com a literatura e dependendo dos modelos de célula e as drogas escolhidas para a geração de células resistentes pelo pesquisador.

Figura 1: linha do tempo para a geração de modelos de célula de câncer de próstata resistente ao Docetaxel. (A) diagrama representativo do protocolo cronograma para geração de modelos de célula Docetaxel-resistente. Ilustração retrata o tratamento Docetaxel, etapas de validação e tempo necessário para cada parte. (B) representação esquemática das etapas de validação do protocolo incluindo ensaios de formação de colônia funcional das células parentais e Docetaxel-resistente, tratados com as concentrações de Docetaxel indicadas para 72 h (em vermelho), representante gráfico da percentagem de colônia e qRT-PCR para validação fenotípica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: geração de sistemas de modelo de células de câncer de próstata resistente ao Docetaxel. (A) diagrama representando a determinação do Docetaxel IC50 nas linhas de células de câncer de próstata parental DU145 e 22Rv1 (etapa 1 do protocolo). Esperado percentagens de viabilidade celular e o Docetaxel concentrações crescentes de dose necessária estão incluídas. Gráficos de viabilidade indicando 5 de células DU145 representante e 22Rv1 nM como o IC50 após 72 h de exposição Docetaxel são incluídos. Os experimentos são triplica e dados representam as imagens de microscopia de campo claro representante SD. (B) média ± de DU145 e células de 22Rv1 no indicaram vezes durante a geração da resistência Docetaxel (etapa 2 do protocolo). Setas vermelhas indicam um clone Docetaxel resistente após a conclusão do protocolo. Barras de escala = 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização fenotípica e funcional dos modelos de célula resistente ao Docetaxel. (A) ensaios de formação de representante da colônia de células parentais e Docetaxel-resistente, tratados com as concentrações de Docetaxel indicadas por 72 h. percentagem de colônias para cada concentração de tratamento é representada no gráfico incluído. Os experimentos são triplica e dados representam a média ± SD. escala barras = 5 mm. (B) DR/parental mRNA dobra aumento relativo quantificada por qRT-PCR de ABCB1, GATA2, CK19 e CDH1 são mostrados. Todos os dados brutos de qPCR é normalizado de actina (Veja o protocolo para obter detalhes). Os experimentos são triplica e dados representam a média ± DP. * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.