Summary
هذا البروتوكول يعمل كمخطط لإقامة نظام على تيت وظيفية في خطوط خلايا السرطان واستخدامها لاحقاً، لا سيما لدراسة دور البروتينات المشتقة من خلية الورم في تجنيد حيدات/الضامة إلى ورم المكروية.
Abstract
siRNA وهدم شرنا بوساطة أساليب (دينار كويتي) لتنظيم التعبير الجيني أدوات لا تقدر بثمن لفهم وظيفة الجينات والبروتين. ومع ذلك، في هذه القضية أن دينار كويتي بروتين الفائدة له تأثير مميتة على الخلايا أو الأثر المتوقع دينار كويتي تعتمد على الوقت، دون قيد أو شرط وأساليب دينار كويتي غير مناسبة. نظم الشرطي هي أكثر ملاءمة في هذه الحالات، وقد خضعت للكثير من الاهتمام. وتشمل هذه النظم overexpression Ecdysone إيندوسيبلي، P-450 الفسفرة التعريفي نظام1، والتتراسيكلين وتنظم أنظمة تعبير الجينات.
يتيح نظام التعبير الجيني التتراسيكلين وينظم عكسها السيطرة على التعبير البروتين بالاستقراء تعبير شرنا حضور التتراسيكلين. في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي استخدام وظيفية تيت-على نظام في خطوط خلايا السرطان البشرية للشرطي تنظيم التعبير الجيني. ثم نظهر استخدام هذا النظام في دراسة التفاعل الوحيدات الخلية الورم.
Introduction
ورم المرتبطة الضامة (تامس) الإسهام في التنمية الورم بتشجيع نمو الورم، وورم خبيث، وتنظيم الاستجابة المناعية2. سرطان خلايا وحيدات المجند التحريضية، التي اختراق الورم وتفرق في برو الورمية تامس3. تسلل للورم مع تامس يرتبط بضعف النتائج السريرية وقد ارتبط بدور كآبته الضامة4،5. ومع ذلك، لم يتم استكشاف آليات توظيف الضامة للورم جيدا وفهم أفضل للمسارات المعنية أمر حاسم لمزيد النهوض بالميدان والعلاجات الواعدة. أحد التحديات في دراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية في ورم المكروية (TME) هو تعقد الآليات والخلايا المعنية، التي تتطلب نهجاً في المختبر أن السماح بتشريح للحديث المتبادل. نقدم هنا منهجية تنوعاً التي يمكن تطبيقها على دراسة تأثير باراكريني من السرطان المستمدة من الخلايا يفرز البروتين على هجرة أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة، في المختبر. باستخدام نظام حيث يتم التعبير عن شرنا ضد بروتين المستمدة من خلايا سرطان المتورطين في تجنيد وحيدات تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي، هو كوانتيتاتيد paracrine تأثير البروتين يفرز على وحيدات. في هذا البروتوكول، استنساخ تسلسلات شرنا إلى التتراسيكلين يرد ناقل التنظيم متبوعاً بجيل خطوط خلايا السرطان مستقرة. علاوة على ذلك، تستخدم تنقية وحيدات البشرية الأساسية ومقايسة دائرة Boyden لتحليل أثر paracrine بروتين الخلايا السرطانية المستمدة على هجرة وحيدات.
عادة يتم تطبيق Downregulation البروتين ترميز الجينات مع تقنيات siRNA وشرنا، على الرغم من أن ليس من دون قيود على استخدامها. الطويلة الأجل تدق لأسفل (دينار كويتي) من الجينات قد تثير الاستجابات التكيفية الثانوية للخلايا التي تتداخل مع النتائج التجريبية. عدم سيطرة مؤقتة على التعبير الجيني يجعل من التحدي لدراسة الدور الدينامي للبروتين على مر الزمن أو دور حاسم لبقاء الخلية البروتين. هذا الموضوع يكتسي أهمية خاصة في الإعدادات في فيفو ، حيث قد يتطلب دور البروتين في ورم في التنمية والتقدم downregulation التعبير عن بروتين الفائدة إلا بعد أن ينشأ الورم. ويمتاز شرطي كويتي لمنع تأثير فتاكة مبكر جداً دينار كويتي في الخلايا، وتمكين تحليل دور البروتين في مراحل مختلفة من نمو الورم، بينما دينار كويتي غير المشروط يمكن أن تؤدي إلى نقص التنمية الورم.
قد وضعت عددا من شرطي كويتي نظم لمعالجة القيود المفروضة على دينار مستقرة. تشمل أنظمة تعبير الجينات المشروط اكديسوني إيندوسيبلي overexpression النظم، نظام P-450 الفسفرة التعريفي1، وينظم التتراسيكلين أنظمة تعبير الجينات. تسمح أنظمة تعبير الجينات تنظم التتراسيكلين السيطرة على التعبير عن شرنا عند إضافة التتراسيكلين مضاد حيوي (أو التماثلية أكثر استقرارا-الدوكسي). في النظم على تيت، هو فعل التعبير عن شرنا حضور التتراسيكلين/الدوكسي أسفر عن تعبير جينات دينار كويتي، بينما في التيت قبالة النظم، يتم منع التعبير عن شرنا حضور التتراسيكلين الناتجة في التعبير الجيني. عيب نظام التتراسيكلين إيندوسيبلي ذكر سابقا مستويات منخفضة من التعبير عن شرنا في غياب الدوكسي-يجتازها ما يسمى6،7. في التيت-على وصف نظام هنا، عند إدارة التتراسيكلين، ربط مؤثرا أعرب التتراسيكلين قامع (تت) البروتين إلى تسلسل العنصر (ترى) تيت المراعية داخل H1 منطقة المروج من شرنا للفائدة وقمعت. هذه النتائج في التعبير عن شرنا وتثبيط لترجمة بروتين اهتمام ب طريقة تعتمد على التتراسكلين8،9.
تشمل نظم تيت على المتاحة الأخرى المتزامنة في ضرب من تيتو التسلسل بين مربع تاتا وعنصر تسلسل الدانية (PSE) وبين مربع تاتا والنسخ البدء في تطوير الموقع بواسطة تشان وآخرون. 10 هذا النظام يتطلب أقل من جرعات سامة من التتراسيكلين لتنظيم التعبير شرنا، ولكن ضمن دولة غير التي يتسبب فيها، وتدني مستويات شرنا يتم التعبير عنها. نظام تيت على مربع المرتبطة كربل (KRAB) على أساس11 يتضمن KRAB، بروتين إصبع زنك، الجينات المواضيع الموجودة داخل نطاق 3 كيلو بايت من الموقع KRAB ملزمة لقمع النسخي. يمكن ربط تركراب البروتين تشيميريك إلى تيتو، وسبب الكبير-نطاق قدرة السيطرة عليها الحمض النووي، تيتو لا حاجة محدودة بين النسخ لبدء تشغيل الموقع والمروج وقد أثر انخفاض في نشاط المروج. في ظل حالة عدم فعل، ذكر هذا النظام تدخل الجيش الملكي النيبالي يمكن السيطرة عليها لإظهار مستوى أدنى من التعبير تسربت من شرنا11،12؛ بيد أنه يقتضي اتباع نهج استنساخ اثنين-ناقل متسلسل. بالمقارنة مع نظم دينار كويتي الشرطي سابقا المتقدمة مثل اكديسوني إيندوسيبلي أوفيريكسبريشن النظام أو النظام التعريفي P-450 الفسفرة، نظام ينظم التتراسيكلين ويمتاز المتانة وإمكانية الرجوع، وبالتالي هو وتستخدم معظم روتيني النظام13. النظام المستخدم في هذا البروتوكول له ميزة على تيتو تدق في النظام المزدوج و KRAB تيت-على نظام كما أنه يتطلب ناقل مستقيم إلى الأمام، واحد الاستنساخ، مما يتيح توليد سريعة لاستنساخ متعددة، وأنه يسلك مستويات منخفضة جداً من يجتازها في نظراً لغياب الدوكسيسيكلين.
TME حاسم بالنسبة لتطور السرطان. لتسهيل نمو الورم، تجنيد الخلايا السرطانية وحيدات الملتهبة بإفراز البروتينات تشيموتاكتيك. اختراق الورم وحيدات المعينين وتفرق في تامس برو الورمية التي تسهم في نمو الورم والانبثاث. الدراسات في المختبر لتجنيد الخلايا المناعية استعمال فحوصات الهجرة، مع Boyden غرفة الفحص يجري على نطاق واسع استخدام14،15،،من1617. في هذا الفحص، يتم وضع مصدر البروتين تشيمواتراكتانت، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية، أو بروتين المنقي، في الدائرة السفلي. وتوضع الخلايا المناعية في مجلس الشيوخ فصل مع الأغشية المسامية من حجرة السفلي. ترحيل نحو التدرج المتزايد تشيمواتراكتانت، وتلك التي عثر عليها في الجانب السفلي من الغشاء الخلايا الملون وتحسب تحت المجهر. هنا نقوم باختبار وظيفة البلاسمينوجين منشط المانع 1 (أي-1) تشيمواتراكتانت على وحيدات بتوليد خطوط خلايا السرطان مستقرة، إيندوسيبلي حيث ينظم التعبير بأي-1 إضافة الدوكسي. نحن نستخدم وحيدات الابتدائي البشرية في مقايسة الهجرة الدائرة Boyden لتقييم دور PAI-1 في الهجرة الوحيدات. الاختلافات بين وحيدات الأساسية البشرية وخطوط الخلايا مونوسيتيك المستخدمة على نطاق واسع مثل THP1 وأفيد وتشمل سيتوكين مختلف أنماط التعبير18؛ على سبيل المثال، مقارنة مع 5-10 إضعاف الزيادة في مستويات التعبير تنف-α بالخلايا THP1 وحيدات البشرية19. خلايا THP1 مشتقة من خلايا سرطان الدم البشرية مونوسيتيك، وهي سهلة للحفاظ على، وتتكاثر مع متوسط مضاعفة الوقت ح 19-5020. على العكس من ذلك، تتميز وحيدات البشرية بعمر قصير وفي غياب عوامل النمو. منذ وحيدات يتم تنقيته من الدم من الجهات المانحة، ويحدث قدرا كبيرا من التباين بين الأفراد، واعتماداً على طريقة تنقية، قد يحدث التلوث بأنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، وحيدات الأساسية ذات الصلة وقد أوصى باستخدام أو تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها مع خطوط الخلية مونوسيتيك استخدام وحيدات الأولية في البحوث البيولوجية19. هنا يصف لنا بروتوكول لتطهير البشرية وحيدات الأولية من الدم المحيطي. وتشمل أساليب بديلة لتنقية الوحيدات الكثافة المتدرجة والالتصاق البروتوكولات وإجراء الخطوة اثنين مع التدرجات واحدة من فيكل-هيباك، متبوعاً تدرج بركل21. نقاء السكان الوحيدات التي حصلت عليها تلك الأساليب يتراوح بين 70-90 في المائة. الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم تدرج كثافة متبوعاً تحديد المناعي سلبي22 ويتيح تنقية وحيدات البشرية دون الاتصال المباشر مع الأجسام المضادة، وبالتالي تجنب بهم التنشيط العرضي وأسفر عن > السكان نقية 95% من وحيدات.
يتم استخدام البروتوكول المعروضة هنا لإقامة نظام على تيت وظيفية للتعبير الجيني دينار كويتي في خطوط خلايا السرطان البشرية لدراسة تأثير chemoattractant المستمدة من سرطان يفرز البروتين بأي-1 على وحيدات. PAI-1 هو أوفيريكسبريسيد بمجموعة متنوعة من الأورام، والتعبير عن المفارقة ترتبط بضعف النتائج السريرية23،24. دور المحترفين ورمي بأي-1 نتيجة لما برو-الأوعية ومهام مكافحة أبوبتوتيك25،26. قد ثبت بأي-1 المساهمة في التهاب بتشجيع توظيف الضامة للموقع لالتهاب27. وأبدى بأي-1 تعزيز العضلات الملساء سيلميجريشن28،29 والمشاركة في الهجرة تعتمد بلعم ماك-130. Overexpression PAI-1 أظهرت أيضا تعزز كثيرا من تجنيد الضامة 264.7 الخام في أورام سرطان الجلد B16F1031. ومع ذلك، لم يتم التحقيق دور PAI-1 في الهجرة تام بالتفصيل. نحن نستخدم بروتوكول وصف للإجابة على سؤال ما إذا كان يجذب الباي-1 وحيدات للخلايا السرطانية. يسمح هذه المنهجية تشريح الحديث المتبادل بين الورم و TME إسكات يفرز البروتين في الخلايا السرطانية وتحليل مكونات TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
المقطع البروتوكول الذي يستخدم وحيدات البشرية التي تم الحصول عليها من المتطوعين صحية يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها "لجنة أخلاقيات البحوث البشرية" الأطفال مستشفى لوس أنجليس وقد أقرها "المجلس استعراض المؤسسية" بموجب "المواد البشرية" بروتوكول رقم: CCI 08-00208.
1-إعداد "خطوط خلايا السرطان" مع شرنا التتراسيكلين-وينظم التعبير
- استنساخ شرنا PAI-1 إلى ناقل تيت-بلكو-بورو 8 , 9
- تصميم ليغومرات شرنا تحتوي على العمروالانقسام منظمة الروتاري الدولية و منظمة التعاون الاقتصاديالموقع في تسلسل الإحساس وحلقة النوكليوتيدات 6، 5 ' نهاية وتسلسل العقاقير.
ملاحظة: تم تصميم النوكليوتيد النموذجية كما يلي: اليغو إلى الأمام: 5 'ككج-bp 19-21 بمعنى-كتكجاج-19-21 شركة بريتيش بتروليوم antisense-TTTTT، عكس اليغو: الشعور بي بي 5' آتاااا-19-21-كتكجاج-19-21 شركة بريتيش بتروليوم أنتيسينسي 3 '. يمكن الاطلاع على البروتوكول مفصلاً لتصميم أوليجومير في 8. في هذه الدراسة تم اختبار 3 تسلسل شرنا ضد الباي-1 لإسكات التأثير الأقوى: شرنا 132وشرنا 2، شرنا 333، و سارعت33 مدرجة في الجدول 1. - يصلب ليغومرات شرنا وسارعت ليغومرات شرنا.
- إعادة تشكيل النوكليوتيد إلى 100 ميكرومتر في المياه، ومزيج 1 ميليلتر اليغنوكليوتيد إلى الأمام و 1 ميليلتر عكس اليغنوكليوتيد ميليلتر 8 H2o.
- أن يصلب النوكليوتيد، مزيج التالية: خليط اليغنوكليوتيد ميليلتر 1، 5 ميليلتر العازلة 10 ملم تريس (هيدروكسيميثيل) أمينوميثاني (تريس) الرقم الهيدروجيني 7.5، 50 ملم 10 ملم من كلوريد الصوديوم (NaCl)، "كلوريد المغنيسيوم" (MgCl2)، ديثيوريثريتول 1 مم (DTE) وميليلتر 44 ح 2 الإخراج.
- احتضان الخليط في بوليميريز سلسلة من ردود فعل (الاسترداد) cycler حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإيقاف تشغيل الأداة، والانتظار حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
- النوكليوتيد ملدنة متعجل بإضافة 5 ميليلتر م 3 خلات الصوديوم pH 5.2 إلى 50 ميليلتر تعتيق النوكليوتيد.
- إضافة 100 ميليلتر الباردة 100% إيثانول (EtOH) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في-80 درجة مئوية. الطرد المركزي في benchtop أجهزة الطرد مركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية، إضافة 500 ميليلتر الباردة 70% EtOH، أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة، إزالة المادة طافية، ويحل بيليه في 20 ميليلتر ح2o.
- تقييم تركيز النوكليوتيد الملدنة التي كانت، قياس امتصاص في 260 نيوتن متر. النوكليوتيد مخفف بتركيز نهائي من 1 نانوغرام/ميليلتر.
- إعداد لوحات أجار رطل والمتوسطة بيرتاني لوريا (رطل).
- رطل المتوسطة، حل ز 10 تريبتوني، استخراج الخميرة ز 5، 10 جرام كلوريد الصوديوم في 1 لتر الماء. ضبط الأس الهيدروجيني للمتوسط إلى درجة الحموضة 7.0 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم والاوتوكلاف.
- لوحات أجار رطل، إضافة 15 غم/لتر أجار إلى المتوسطة رطل. اﻷوتوكﻻف وباردة وصولاً إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية. إضافة المضادات الحيوية وصب اللوحات.
- متتالية البكتيريا ترانسدوسيد مع ناقل تيت-بلكو-بورو (انظر الجدول للمواد) على رطل بلايت أجار تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين واحتضان بين عشية وضحاها (O/N) عند 37 درجة مئوية.
- تلقيح 100 مل رطل المتوسطة وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين (رطل/الأمبيسلّين) مع مستعمرة 1 من اللوحة وتنمو O/N مع تهتز عند 37 درجة مئوية.
- إيسولاتيتيت-بلكو-بورو من ثقافة البكتيرية 100 مل باستخدام مجموعة عزل بلازميد.
- إعداد رد فعل التقييد لناقل تيت-بلكو-بورو مع إنزيمات التقييد اكوري ويجئ كما يلي: 1 ميليلتر اكوري، 1 ميليلتر يجئ، المخزن المؤقت 10 x ميليلتر 5، 1 ميليلتر بلازميد الحمض الخلوي الصبغي (1 ميكروغرام)، 42 ميليلتر ح2سين احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. للحصول على ما يكفي من ناقلات ملصوق، إعداد تصل إلى 5 × 50 ميليلتر من ردود الفعل.
- استخدم 1% [اغروس] هلام لتنقية ناقل ملصوق من [اغروس] هلام باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي. لزيادة العائد من الحمض النووي، تصغير [اغروس] إلى نسبة الحمض النووي في الجل باستخدام [اغروس] هلام مشط للآبار الكبيرة وإزالة معظم [اغروس] عناية من الفرقة باستخدام مشرط.
- إعداد مزيج رد فعل ربط كما يلي: 1 نانوغرام تعتيق النوكليوتيد 50 نانوغرام ملصوق متجه، 2 10 x ميليلتر ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر ليجاسى والمياه تصل إلى 20 ميليلتر. اضطر ناقلات مع النوكليوتيد شرنا الملدن في 16 ° ج س/أ.
- إعداد بالإضافة إلى ذلك، فعل مراقبة سلبية دون النوكليوتيد لحساب متجه أونكليفيد وملصوق جزئيا، والواصلة الذاتي الذي سيؤدي إلى المستعمرات الإيجابية الكاذبة.
- باستخدام تقنيات التحويل القياسي، تحويل خلائط ربط الخلايا البكتيرية كيميائيا المختصة ترمي إلى منع جزئ مثلى من ناقلات لينتيفيرال التي تحتوي على تكرار المباشرة.
- تنمو البكتيريا في لوحات مع الأمبيسلّين O/N عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في حال حدوث نمو المستعمرات الفضائية، كرر التحول وتنمو البكتيريا في 30 درجة مئوية تباطؤ في النمو ومن ثم منع المستعمرات الفضائية. - للتحقق من نجاح عملية ربط، اختر بين 10-20 مفرد المستعمرات وتطعيم الثقافات رطل/الأمبيسلّين 2 مل صفيحة الأمبيسلّين كلوحة أسهم (لاستخدامها كاستنساخ إيجابية في وقت لاحق). تنمو الثقافات السائل مع اهتزاز O/N عند 37 درجة مئوية. احتضان لوحة O/N عند 37 درجة مئوية.
- ختم اللوحة مع بارافيلم ومخزن في 6 درجة مئوية.
- عزل الحمض النووي بلازميد من الثقافات السائل باستخدام مجموعة عزل بلازميد.
- إجراء تحليل لتقييد بلازميد الحمض النووي المعزولة من المستعمرات الأمبيسلّين مقاومة استخدام الإنزيم زهوي. لكل استنساخ، وإعداد مزيج الرد التالي: 0.5 ميليلتر زهوي، المخزن المؤقت 2.5 10 x ميليلتر، 1 ميليلتر بلازميد الحمض الخلوي الصبغي (0.5 ميكروغرام)، و 21 ميليلتر ح2O. إينكوباتي ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تحليل نتيجة لرد فعل التقييد عن طريق تشغيل رد فعل على 1% [اغروس] هلام.
ملاحظة: تحليل تقييد ناقل WT المشقوق من زهوي سوف تولد الشظايا 3: 8,447، 1,800، و 200 شركة بريتيش بتروليوم. التسلسل ستوفر متجه تيت-بلكو-بورو 1,800 bp ليست موجودة في الحيوانات المستنسخة الإيجابية التي تحتوي على شرنا-أي-1 وهضم زهوي سيؤدي إلى شظايا من الحمض النووي للحجم: 8,447 و 190 و 130 شركة بريتيش بتروليوم. كما هو مبين في الشكل 1، لم يتم العثور على جزء bp 2,000 في الحمض النووي معزولة عن عدد المستعمرات مقاومة الأمبيسلّين: 3 و 8 و 11. استناداً إلى تصميم النوكليوتيد، قد تختلف في طول وعدد الأجزاء التي تم الحصول عليها في الحمض النووي من المستعمرات الإيجابية. - التحقق من الإدراج السليم من التسلسلات شرنا في ناقلات تيت-بلكو-بورو بتسلسل8،9.
- تلقيح 100 مل الثقافة رطل/الأمبيسلّين مع المستعمرة التي تحتوي على نسخة صحيحة وتنمو O/N عند 37 درجة مئوية.
- عزل الحمض النووي بلازميد استخدام عدة عزل بلازميد.
- تصميم ليغومرات شرنا تحتوي على العمروالانقسام منظمة الروتاري الدولية و منظمة التعاون الاقتصاديالموقع في تسلسل الإحساس وحلقة النوكليوتيدات 6، 5 ' نهاية وتسلسل العقاقير.
- جيل جسيمات لينتيفيروس.
- معطف طبق استنبات الأنسجة 15 سم مع بولي-L-يسين التي تغطي سطح الطبق مع حل الماء المعقم 0.01 ٪ بولي-L-يسين وتفرخ في الرايت 15 دقيقة لإزالة الحل بتطلع وأيردري الأطباق.
- 293 الكلي الجنينية البشرية البذور 5 × 106 خلايا خلايا (HEK293) في الطبق بولي-L-يسين-المغلفة 15 سم، والثقافة في المتوسط المتوسطة (دميم) "تعديل النسر" دولبيكو تزويده بمزيج البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا) عند 37 درجة مئوية، 5% 10% FBS و 1% أول أكسيد الكربون 2 حتى تصل إلى 70% كونفلوينسي.
- لإنتاج الجزيئات الفيروسية، ترانسفيكت الخلايا HEK293 مع 25 ميكروغرام بلكو-تيت-في-شرنا وبسب ميكروغرام، (التعبئة والتغليف بلازميد)، 5 ميكروغرام pMD2.G البلازميدات (بلازميد تعرب عن المغلف) باستخدام الكاشف تعداء 25.
ملاحظة: البلازميدات بسب و pMD2.G هدية من مختبر ترونو ديدييه (مدرسة البوليتكنيك Federale دي لوزان، سويسرا). - حمل الخلايا HEK293 في اليوم التالي بتغيير الوسيلة دميم وتستكمل مع 10 ملم الصوديوم butyrate و 20 مم هيبيس pH 7.2، وتثقيف ح 8.
- تغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة 25 مل من الطازجة دميم المتوسطة تحتوي على 20 مم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس) الرقم الهيدروجيني 7.2. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية ح 48، جمع بعناية المتوسطة المحتوية على الفيروس عن طريق بيبيتينج؛ تحاشي الانسكابات.
- تصفية المتوسطة التي تم جمعها من خلال عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرون لإزالة الخلايا HEK293. يمكن استخدامها على الفور المتوسطة التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية أو تخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
- جيل خطوط الخلية transfected ثابت
- البذور HCT116 خلايا سرطان القولون وخلايا سرطان الثدي MDA-ميغابايت-231 50000 خلايا/بئر في المتوسط دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% القلم/بكتيريا في صفيحة 12-جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حتى يتم روافد 60-70% من الخلايا.
- تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل المحتوية على الفيروس المتوسطة لسرطان الخلايا، واحتضان O/N في 37 درجة مئوية في شركة 5%2. كعنصر تحكم، أضف 1 مل من الطازجة المتوسطة دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% القلم/بكتيريا إلى الآبار 2 مع الخلايا السرطانية.
- بعناية إزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس بالطموح. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتغيير الوسيلة دميم مع 10% (v/v) خالية من التتراسيكلين FBS (Tet الحرة) و 1% القلم/بكتيريا.
- بعد 72 ساعة، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتغيير المتوسطة إلى دميم 10% FBS خالية Tet 1% القلم/بكتيريا، بوروميسين 1 ميكروغرام/مل للفيروس transfected الخلايا المحددة.
- اعتماداً على خط الخلية المستخدمة، ضبط تركيز بوروميسين للاختيار الأمثل باختبار بوروميسين التركيزات (0.1، 0.5، 1، 2، و 5 ميكروغرام/مل) في الخلايا غير ترانسدوسيد واختيار أدنى تركيز حيث البقاء لا خلايا المراقبة وبعد 3 أيام ثقافة.
- حدد الخلايا ترانسدوسيد الفيروس باستزراع خلايا حضور بوروميسين لمدة 3-14 يوما. كعناصر تحكم، إعداد بئرين إضافية مع الخلايا غير ترانسدوسيد، واحد مع المتوسطة التي تحتوي على بوروميسين، وواحد بدون بوروميسين. الاحتفال بالقتل الجزئي للخلايا عن طريق بوروميسين في البئر مع الخلايا ترانسدوسيد الفيروس مقارنة بابار المراقبة.
ملاحظة: لن يتم تكبير الخلايا غير ترانسدوسيد حضور بوروميسين. - التحقق من كفاءة دينار كويتي الشرطي في سرطان القولون HCT116 بوروميسين المقاوم ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 خلايا سرطان الثدي.
ملاحظة: تركيز الدوكسي الفعال ستختلف مع خط الخلية المستخدمة ويجب أن تكون تيتراتيد (عادة من 100 نانوغرام/مل إلى 2 ميكروغرام/مل).- تحديد تركيز الدوكسي غير السامة للخلايا ولكنها فعالة في دوونريجولاتينج التعبير عن البروتين للفائدة. وكان 1 ميكروغرام/مل في هذا البروتوكول، تستخدم بنجاح في المختبر.
- ثقافة الخلايا ح 72 في وجود وغياب الدوكسي ميكروغرام/مل 0.1، 1 و 2. التحقق من مستوى التعبير عن البروتين دوونريجولاتيد (هنا، PAI-1) في الخلية ليستي بالغربية لطخة تحليل. مقارنة HCT116 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا شرطيا معربا عن شرنا للخلايا التحكم المجمعة.
- إعداد متوسطة مكيفة
- وينظم البذور 1 × 106 خلايا ستابلي transfected مع الدوكسي بلكو-شرنا لينتيفيروسيس تحتوي على أطباق 10 سم.
- تنمو خطوط الخلايا في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) مع 10% FBS خالية تيت و 1% القلم/بكتيريا في غياب وحضور 1 ميكروغرام/مل الدوكسي ح 72 في 37 درجة مئوية في 5% CO2، مضيفاً الدوكسي الطازجة يوميا.
ملاحظة: ربمي المتوسطة متوافق مع شروط الثقافة وحيدات. الدوكسيسيكلين مركب حساس ضوء. حماية الثقافات الخلية من الضوء التي تغطي برقائق الألومنيوم وتجنب العمل تحت التعرض المباشر للضوء. - جمع المتوسطة عن طريق بيبيتينج وتصفية من خلال 0.45 ميكرومتر تصفية وتجميد في-80 درجة مئوية في مختبرين.
2-عزل وحيدات من الدم البشري
- عزل وحيدات من الدم المحيطي البشري.
ملاحظة: وحيدات الابتدائي البشرية معزولة من 7 مل خلايا الدم البيضاء التي تتركز في عامل تصفية الكريات البيض التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة الصفائح الدموية صحية. حسب الجهة المانحة، تنتج عامل تصفية واحد من الكريات البيض بين 1 × 109 و 2 × 109 خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس)، حوالي 10% من التي تشكل وحيدات.- إعداد محطة العمل في التدفق الصفحي مجلس الوزراء.
- تعقيم المقصات وتدفق الصفحي مجلس الوزراء مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) لمدة 30 دقيقة.
- رش فلتر الكريات البيض مع 70% EtOH وداخل أيردري الاندفاق الصفحي مجلس الوزراء.
- قص طرفي فلتر الكريات البيض مع المقص وإفراغ محتوى التصفية في أنبوب 50 مل.
- تضعف إلى 90 مل بإضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% (v/v) FBS (برنامج تلفزيوني/FBS).
- إعداد أنابيب 3 × 50 مل مع 15 مل الكثافة المتدرجة الحل. طبقة ببطء 30 مل دم PBS/FBS تضعف أكثر كثافة الحل التدرج باستخدام وحدة تحكم ماصة تعيين على تدفق الجاذبية لتجنب الخلط بين الطبقات.
- الطرد المركزي في دوار سوينغ في ز 400 x في RT دون الفرامل لمدة 25 دقيقة.
- التصرف في الطبقة العليا، ونقل الطبقة الوسطى التي تحتوي على ببمكس إلى أنبوب 50 مل طازجة.
- إضافة إزالة برنامج تلفزيوني/FBS ما يصل إلى 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في ز 120 x في RT للحد الأدنى 10 المادة طافية المحتوية على الصفائح الدموية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
- ريسوسبيند بيليه في 50 مل من برنامج تلفزيوني/FBS والاعتماد ببمكس استخدام هيموسيتوميتير. الطرد المركزي في 120 س ز على RT وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني/FBS المحتوية على حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) (برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا) بتركيز نهائي من 5 × 107 خلايا/مل.
- استخدام أدوات تحديد سلبي لإثراء وحيدات باستنفاد الخلايا غير مونوسيتيك.
ملاحظة: الطقم الانتقاء السلبي يستخدم خليط من الأجسام المضادة (CD2 CD3 و CD16، CD19، CD20، CD56، CD66b، CD123، وجليكوفورين أ) ضد تي الخلايا، ناغورني كاراباخ الخلايا، العَدلات، ب خلايا والمحببة والكريات الحمراء. ربط المجمعات جسم على سطح هذه الخلايا غير مونوسيتيك وإلى ديكستران المغناطيسي الجسيمات. عندما يتم وضع الأنبوب في مغناطيس، الخرز التمسك بجدران الأنبوب وإزالة الخلايا غير مونوسيتيك من الحل.- إضافة 50 ميليلتر جسم كوكتيل إلى 1 مل من 5 × 107 ببمكس/mL، يخلط ماصة، واحتضانها لمدة 10 دقيقة في الرايت إضافة 50 ميليلتر المغناطيسي الخرز إلى ببمكس مع جسم كوكتيل، وخلط مع ماصة واحتضانها لآخر 10 دقيقة في الرايت
- إضافة برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا إلى 25 مل ومكان الخليط ببمك في مغناطيس التي يمكن أن تستوعب أنبوب 50 مل. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت المغناطيسي الخرز سوف تلتزم بجدران الأنبوب وعزل الخلايا غير مونوسيتيك من الحل.
- استخدام ماصة 25 مل، إزالة الحل التي تحتوي على وحيدات من الأنبوب في المغناطيس. احرص على عدم لمس جانبي الأنبوب مع ماصة.
- الطرد المركزي الحل في 250 g x في الرايت وإزالة المادة طافية ريسوسبيند بيليه تحتوي على وحيدات في المتوسطة ربمي الذي يحتوي على 10% FBS خالية تيت و 1% القلم/بكتيريا.
3-Boyden دائرة الهجرة الإنزيم
- إعداد الحل ألبومين المصل البقري (BSA) 1% (w/v) بتذويب ز 1 لجيش صرب البوسنة في 100 مل الماء عالي النقاوة، وتصفية من خلال حجم مسام 0.2 ميكرون تعقيم.
- احتضان إدراجات الأغشية المسامية في 1% العقيمة جيش صرب البوسنة الحل O/N لتحسين امتثال الضامة للغشاء. حيدات/الضامة، استخدام 5-8 ميكرومتر المسامية الحجم إدراج.
- ملء طبق استنبات الأنسجة عقيمة مع 1% حل جيش صرب البوسنة ويدرج في الطبق. تطبيق 200 ميليلتر 1% حل جيش صرب البوسنة داخل تدرج.
- أغسل إدراج مرتين بوضعها في صحن مليئة PBS العقيمة وتطبيق برنامج تلفزيوني داخل الفلتر.
- البذور 40,000 HCT116 أو MDA-ميغابايت-231 الخلايا في 0.5 مل ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS خالية تيت و 1% القلم/بكتيريا الواحدة وكذلك، في لوحة 24-جيدا، في ثلاث نسخ. بدلاً من ذلك، ضع 0.5 مل متوسطة مكيفة الذي تم إنشاؤه مسبقاً في البئر كمصدر تشيمواتراكتانت.
- في اليوم التالي، إدراج لوحة 8,000 وحيدات في الذي أعد في حجم 0.3 مل ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS خالية تيت و 1% القلم/بكتيريا، في ثلاث نسخ، واحتضان في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- جمع إدراج بعد 48 ساعة.
ملاحظة: يجب أن يكون طول تجربة الأمثل اعتماداً على الظروف المحددة والخلايا المستخدمة، بإجراء تجربة دورة الوقت حيث جمعت إدراجات في الأوقات المختلفة من الحضانة.- التخلص من المتوسط الزائدة ودقة انتقد السطح الداخلي مع قضيب القطن ذات الرؤوس لإزالة الخلايا التي غير ترحيل.
- وصمة عار على الجانب الخارجي من إدراج استخدام الأسلوب جيمسى رأيت.
- جبل 3 إدراج/الزجاج الشريحة في نفط غمر مجهر لزوجة عالية، مع التأكد من أن يواجه الجانب عامل التصفية مع الضامة التي تم ترحيلها بعناية.
- صورة الشرائح باستخدام مجهر خفيفة مع 20 X الهدف. التقاط صور لحقول 9/عامل التصفية. عد الضامة التي تم ترحيلها في حقول 9/عامل التصفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختبار ثلاثة شرنا تسلسلات "الدينار الكويتي" بأي-1 الأكثر كفاءة. ولهذا الغرض، قد تم استنساخ متواليات شرنا ضد الباي-1 وسارعت (الجدول 1) إلى ناقل التعبير تيت-بلكو-بورو بعد البروتوكول، المذكورة أعلاه. خط الخلية فيبروساركوما HT-1080 كان ستابلي transfected مع الثوابت التي تم إنشاؤها والخلايا تعامل مع الدوكسي لمدة 3 أيام. تم التحقق من التعبير عن الباي-1 طريق الغربية النشاف (الشكل 2 ألف) وكثافة العصابات المقابلة بأي-1 وتوبولين تم تحليلها بواسطة قياس كثافة. باستخدام تسلسل دينار كويتي الأكثر فعالية (شرنا 2)، بالإضافة إلى ذلك أنشأنا جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا غدية الثدي الظهارية (الشكل 2B) وخلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 (الشكل 2) ستابلي transfected مع التتراسيكلين-ينظم ناقل التعبير بلكو-shRNA2-أي-1 (وشرنا سارعت كعنصر تحكم). حققنا انخفاضا 74% من التعبير بأي-1 في جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا خط (الشكل 2B) وانخفاض 17.5% في خط الخلية HCT116 حضور الدوكسي (1 ميكروغرام/مل)(الشكل 2) حسب تقييم النشاف الغربية وتحليل دينسيتوميتريك للعصابات. استخدمت مقايسة الدائرة Boyden التحديد الكمي لهجرة وحيدات نحو الخلايا السرطانية. افترضنا أن سرطان المستمدة من الخلية بأي-1 تشجع هجرة وحيدات نحو الخلايا السرطانية، وذلك أقل الهجرة سيراعي عند الباي-1 دوونريجولاتيد بإضافة الدوكسي. الخلايا السرطانية تعامل مع الدوكسي لمدة 3 أيام وكانت تبذر في الجزء السفلي من لوحة 24-جيدا في الخلايا 40,000/جيدا. وطبقت المنقي وحيدات البشرية الأولية في الدائرة العليا للمقايسة وبعد 24 ساعة، وحيدات تعلق على الجزء السفلي من الغشاء الملون وتحسب تحت المجهر. علينا أن نظهر أن في غياب الدوكسي وبالتالي وجود بأي-1، في جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 و HCT116 الخلايا (PAI-1 شرنا وعناصر التحكم المجمعة)، زادت كثيرا هجرة بشرية وحيدات (الشكل 3). ثم تحول دون هجرة وحيدات بنسبة 33 في المائة ونسبة 74 في المائة عند الدوكسي أضيفت إلى ثقافات المشارك وإنتاج PAI-1 من الخلايا السرطانية كان ينظم لأسفل (الشكل 3 ألف، ج). ولوحظ لا تثبيط الهجرة الوحيدات مع الخلايا السرطانية ترانسدوسيد مع الضوابط شرنا المجمعة، والتي أشارت أيضا إلى أن الدوكسي أي تأثير المثبطة للهجرة الوحيدات. تم الحصول على نتائج مماثلة عندما يوضع المتوسطة مكيفة للخلايا السرطانية تعامل الدوكسي في الجزء السفلي من الآبار كمصدر تشيمواتراكتانتس (الشكل 3، د).
الشكل 1 . زهوي تقييد تحليل الحمض النووي المستخرج من المستعمرات البكتيرية 16- الحمض النووي المستخرج من المستعمرات البكتيرية 16 وتعرض لرد فعل القيد مع الإنزيم زهوي. تم تحليل الشظايا الناتجة عن الحمض النووي من [اغروس] هلام التفريد. يتم وضع علامة استنساخ الإيجابية (الممرات 3 و 8 و 11) التي تفتقر إلى الجزء 2 كيلو بايت بعد خلاصة القيد زهوي مع الأسهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . دينار كويتي مشروطة بأي-1 التعبير في خطوط خلايا السرطان- الغربية النشاف تحليل التعبير بأي-1 في خطوط الخلايا ستابلي transfected مع التتراسيكلين-وينظم بلكو-شرنا-PAI-1 (شرنا 1-3)، وسارعت ناقلات التعبير بعد 3 أيام علاج الدوكسي. (أ) HT1080. (ب) جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231. (ج) HCT116. تحليل قياس كثافة من العصابات هو المبين أدناه الحارات الغربية اسطوانات يقوم كنسبة من كثافة الباي-1 على مدى كثافة الفرقة tubulin. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . بأي-1 تشجع الهجرة بلعم. هجرة وحيدات البشرية نحو (أ) جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 والخلايا HCT116 (ج) خطوط ستابلي transfected مع ناقل مشروط الإعراب عن شرنا 2 ضد الباي-1 وسارعت شرنا، تقاس باستخدام مقايسة الدائرة Boyden. الخلايا السرطانية كانت تعامل مع الدوكسيسيكلين لمدة 3 أيام وتبذر في صفيحة 24-جيدا في ثلاث نسخ. وطبقت وحيدات الابتدائي البشرية على رأس الإدراج. بعد 24 ساعة، الملون وحيدات في الجانب السفلي من عامل التصفية وتحسب تحت المجهر. هجرة وحيدات البشرية نحو المتوسطة مكيفة إنشاء ما يزيد على 72 ح (ب) جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 و (د) خطوط الخلايا HCT116 شرطيا معربا عن الباي-1 في حضور وغياب الدوكسي. وتمثل البيانات يعني تريبليكاتيس التقنية [+/--الانحراف المعياري (SD)]. لكل تكرار، أحصى وحيدات تم ترحيله في الميادين 9 على 20 X التكبير موضوعية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم اليغو | التسلسل | ||||
| شرنا 1 (المضادة للتسلسل PAI-1 1- 8 ) | إلى الأمام: | شباي-1A5 'ككجكتجاكتكاكجاجتكتتككتكجاجااجاكتكجتجاجتكاجتتتت 3' | |||
| عكس: | شباي-1B آتتااااكتجاكتكاكجاجتكتتككتكجاجااجاكتكجتجاجتكاج 3 '5' | ||||
| شرنا 2: (مكافحة PAI-1 تسلسل 2) | إلى الأمام: | شباي-1 ج 5 '-ككجكاجاكاجتتكاجكتجاكتكتكجاجاجتكاجككتجااكتجتكتجتتتت-3' | |||
| عكس: | شباي-1 د 5 '-آتتااااكاجاكاجتتتكاجكتجاكتكتكجاجاجتكاجككتجااكتجتكتج-3' | ||||
| شرنا 3 (المضادة للتسلسل PAI-1-3 9) | إلى الأمام: | شباي-1E 5 '-ككجاجاتجاجاتكاجكاككاكاكتكجاجتجتجتجكتجاتكتكاتككتتتتتت-3' | |||
| عكس: | شباي-1F 5 '-آتتااااااجاتجاجاتكاجكاككاكاكتكجاجتجتجتجكتجاتكتكاتككت-3' | ||||
| التدافع (يتبارى التسلسل-4 9) | إلى الأمام: | يتبارى 1 5 '-ككجاتكتككجاكجتجتكاكجتكتكجاجاكجتجاكاكجتكجاجاتتتتتت-3' | |||
| عكس: | يتبارى 2 5 '-آتتااااااتكتككجاكجتجتكاكجتكتكجاجاكجتجاكاكجتكجاجات-3' | ||||
الجدول 1. تسلسل شرنا. هنا تم اختبار 3 تسلسل شرنا ضد الباي-1 لإسكات التأثير الأقوى: شرنا 1، شرنا 2، شرنا 3، وسارعت
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتألف من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، TME حاسمة بالنسبة لتطور السرطان. للتأكد من ظروف النمو المثلى، جذب الخلايا السرطانية وحيدات عن طريق إفراز عوامل تشيموتاكتيك. نقدم هنا بروتوكولا لدراسة إليه تجنيد الوحيدات بورم الخلايا في المختبر. لهذا الغرض، يتم استخدام مزيج من الجينات إيندوسيبلي التعبير نظام تنقية وحيدات البشرية الأساسية، كمثال مقايسة الهجرة، مقايسة الدائرة Boyden.
هو الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول المقدم لتأكيد استنساخ التسلسلات شرنا في ناقلات على تيت، التي ينبغي تقييمها دائماً بالتسلسل الصحيح. إنشاء المزيد من خطوط الخلية تيت على وظيفية مستقرة تحتاج إلى تأكيد باختبار د. ك حضور الدوكسي من النشاف الغربية. قد يختلف مقدار الدوكسي التطبيقية بين خطوط الخلايا، ولذلك فمن المستحسن أن اختبار التركيزات الفعالة للدينار الكويتي وسمية على الخلايا. عيب معروفة من نظم التتراسيكلين إيندوسيبلي هو ما يجتازها6،7. يجب قياس كمية البروتين التي اكتشفت في وجود وغياب الدوكسي ومقارنة بعناصر التحكم المجمعة لحساب لهذا الغرض. في هذه التجارب في المختبر ، الملاحظ على مستوى منخفض من يجتازها بدك shRNA2 و shRNA3، كما هو مبين في الشكل 2. بالإضافة إلى ذلك، من المهم دائماً استخدام المصل خالية من التتراسيكلين في المختبر لتجنب downregulation مستويات البروتين في ظروف مراقبة. النظام المستخدم في هذا البروتوكول مزايا أكثر من غيرها من نظم تيت-على أنها تتطلب الاستنساخ ناقل واحد، يسمح لتوليد سريعة لاستنساخ متعددة، ومعارض مستويات منخفضة جداً من يجتازها.
خطوة حاسمة في الحصول على وحيدات البشرية الأولية من الدم هو الحصول على فصل التدرج جيدة، الذي يعتمد على طبقات بطيئة من الدم المخفف على التدرج الكثافة. خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول تقدير عدد الخلايا قبل الخطوة الانتقاء السلبي بشكل صحيح لأنه سيتم تحديد مقدار جسم كوكتيل والمغناطيسي الخرز إضافة إلى توقف الدم. لضمان إمكانية تكرار نتائج التجارب، ينبغي أن تستخدم واحد أو أكثر من الجهات المانحة الدم في أداء تكرار التجارب. هذا الأسلوب متفوقة على البدائل الموجودة لتنقية الوحيدات، بما في ذلك تدرج كثافة والبروتوكول على أساس الالتصاق34 وإجراء خطوتين مع التدرجات واحدة21، نظراً لأنها أوامر اللمفاويات منخفضة التلوث المستوى وعالية النقاء (> 95 ٪) من وحيدات المتحصل عليها. حيث يتم إزالة أنواع الخلايا غير مونوسيتيك من الخليط ببمك بالانتقاء السلبي، وحيدات لا تأتي في اتصال مباشر مع الأجسام المضادة الموجودة في جسم كوكتيل، وبالتالي خطر وحيدات تصبح تفعيلها من خلال التفاعل مع الأجسام المضادة هو الحد الأدنى. وقد تشمل التطبيقات البديلة للخلايا التي تم الحصول عليها التفريق بين وحيدات في الضامة من خلال تجارب في المختبر و في فيفو حيث يتم حقن وحيدات البشرية في الفئران العوز. وتشمل تعديلات البروتوكول عادة استخدام المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء أثناء خطوات الغسيل ببمكس. ويهدف هذا التعديل إضافية إزالة خلايا الدم الحمراء عن طريق تطبيق الضغط الاسموزي. قيود تقنية تشمل عددا محدودا من الضامة التي يمكن الحصول عليها باستخدام كمية محددة من الكواشف.
فحص الهجرة الدائرة Boyden طريقة سريعة وبسيطة لتحليل ما إذا كانت نسبة البروتين يفرز أو خط خلية يحفز الهجرة لأنواع أخرى من الخلايا. وتشمل مزالق هذا التحليل حساسية منخفضة وعدم المحاسبة للخلايا تمر بموت الخلايا. أن تأكيد طرق معالجة تلك الشواغل النتائج مع مقايسة مختلفة مثل موائع جزيئية أساس المقايسة وتجربة دورة الوقت حيث يتم قياس الهجرة على مدى فترات زمنية أقصر. باستثناء السكان صغيرة، لا تتكاثر وحيدات ناضجة في فيفو35،36؛ ومع ذلك إذا استخدمت خلايا أخرى، ينبغي اختيار زمني أقصر من دورة شعبة بهم لتجنب زيادة في عدد الخلايا. وبدلاً من ذلك، يجب استخدام الكواشف منع انقسام الخلية تجنب تغيير عدد الخلايا مطلي أصلاً.
البروتوكول المعروضة هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسات أخرى البروتينات التي تفرزها الخلايا السرطانية ووظائفها باراكريني. واحد من التطبيقات الممكنة لخطوط خلايا السرطان دينار كويتي الشرطي هو دراسة دور البروتينات التي دينار كويتي السامة للخلايا ليس فقط في المختبر ولكن أيضا في فيفو، حيث خطوط الخلايا ينظم تيت إكسينوترانسبلانتيد في الفئران، وفعل الدينار الكويتي بعد إنشاء الورم بإضافة الدوكسي لمياه الشرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تود أن تقر روزنبرغ جاكلين لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. كان يؤيد هذا العمل لنا وزارة الصحة والخدمات الإنسانية والوطنية معاهد الصحة مع منحة يا ديكليرك (منح 5R01 كاليفورنيا 129377) ومؤسسة مارتل "تي جي". كوبالا MH هو المستفيد من منحة "زمالة بحث الوظيفية التنمية" معهد سابان للبحث في "مستشفى لوس أنجليس" في الأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J.
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
