Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

Resumo

Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

Resumo

A análise de DNA do tumor (ctDNA) usando o sequenciamento de próxima geração (NGS) em circulação tornou-se uma valiosa ferramenta para o desenvolvimento da oncologia clínica. No entanto, a aplicação deste método é um desafio devido à sua baixa sensibilidade ao analisar a quantidade de rastreamento de ctDNA no sangue. Além disso, o método pode gerar resultados falsos positivos e negativos a partir desta análise de sequenciamento e subsequente. Para melhorar a viabilidade e a confiabilidade da deteção de ctDNA na clínica, aqui apresentamos uma técnica que enriquece raras mutações por sequenciamento, enriquecer a rara mutação sequenciamento (ER-Seq). ER-Seq pode distinguir uma única mutação fora 1 x 10⁷ nucleotídeos de tipo selvagem, que o torna uma ferramenta promissora para detectar alterações genéticas extremamente baixa frequência e, portanto, será muito útil no estudo de heterogenicity doença. Em virtude da ligadura do adaptador exclusivo de sequenciamento, esse método permite uma recuperação eficiente de moléculas de ctDNA, ao mesmo tempo corrigindo para erros bidirecionalmente (sentido e antisentido). Nossa seleção de sondas 1021 kb enriquece a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações em 12 tumores relacionados ao tumor motorista. Esse método cost-effective e universal permite uma acumulação excepcionalmente bem sucedida dos dados genéticos. Depois de forma eficiente filtragem de erro de fundo, ER-seq precisamente pode detectar mutações raras. Usando um estudo de caso, apresentamos um protocolo detalhado demonstrando sonda design, construção de biblioteca e metodologias de captura de DNA alvo, enquanto incluindo também o fluxo de trabalho de análise de dados. O processo para realizar este método normalmente leva 1-2 dias.

Introdução

Sequenciamento de próxima geração (NGS), uma poderosa ferramenta para investigar os mistérios do genoma, pode fornecer uma grande quantidade de informações, que podem revelar alterações genéticas. A aplicação da análise NGS na clínica tornou-se mais comum, especialmente para a medicina personalizada. Uma das maiores limitações da NGS, no entanto, é uma taxa de erro elevada. Embora considera-se adequado para estudar as mutações herdadas, a análise de mutações raras é extremamente limitada^1,2, especialmente quando analisar o DNA obtido de uma biópsia"líquida".

Tumor de circulação DNA ....

Protocolo

amostras de tumor e amostras de sangue foram obtidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê ética de Peking University povo ' ' s Hospital. Obteve-se consentimento escrito dos pacientes para usar suas amostras. Os participantes foram selecionados de acordo com os seguintes critérios: fêmea, avançado de câncer de pulmão de células não pequenas, mutação de EGFR p.L858R indicado pelo anterior de sequenciamento Sanger, progressão da doença após dois sessão de EGFR alvo terapia com Erlotinib, e Que foi aplicado a ctDNA para analisar a causa da resistência e encontrar novas drogas alvo ER-Seq.

1. extração de DNA de sangue periférico ....

Resultados

As sondas de 1021 kb regiões-alvo enriquecido usadas em ER-Seq são mostradas na tabela 1, que abrange mais de 95% das mutações gene em 12 tumores comuns. A vasta gama de tais sondas torna este processo aplicável para a maioria dos pacientes com câncer. Além disso, nosso exclusivo sequenciamento adaptadores e triagem de banco de dados de base tornam possível detectar mutações raras precisamente.

Discussão

A existência de circular de DNA do tumor (ctDNA) foi descoberta há mais de 30 anos atrás, no entanto, a aplicação de análises ctDNA é ainda não é rotina na prática clínica. Interesse na aplicação prática dos métodos de ctDNA aumentou com o desenvolvimento de tecnologias para a detecção de ctDNA e análise. Tumor de monitoramento com ctDNA oferece uma abordagem minimamente invasiva para a avaliação de doença residual microscópica, resposta à terapia e perfis molecular do tumor sob o fundo do tumor evolução e intratumoral h.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ácido nucleico circulante QIAamp	Qiagen	55114	Extração de DNA do sangue periférico para cfDNA
Minikit QIAamp DNA Blood	Qiagen	51105	Extração de DNA do sangue periférico para gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Medir a concentração de cfDNA
Quant-iT dsDNA BR Kit de ensaio	Invitrogen	Q32853	Medir concentração de biblioteca
Agilent DNA 1000 Reagentes	Agilent	5067-1504	Meça cfDNA e fragmentos de biblioteca
O NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit para Illumina	NEB	E7645L	Preparação de Biblioteca
Agencourt SPRIselect Reagente	Beckman	B23317	Triagem e purificação de fragmentos
de DNA Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	dissolução
Sondas de bloqueio xGen	IDT	— —	Sonda personalizada xGen
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Captura de DNA direcionada
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Captura de DNA
direcionada xGen Reagentes de bloqueio	IDT	1072281	Captura de DNA direcionada
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	bibliotecas de enriquecimento de PCR pós-captura
KAPA Library Quantification Kit	KAPA	KK4602	Medir a concentração da biblioteca
NextSeq 500 High Output Kit v2 ((150 ciclos)	illumina	FC-404-2002
Sequencial Centrífuga 5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Medir a concentração de gDNA
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantificar
Agilent 2100 Bioanalisador	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubação
16-tubo DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrador mais	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina