Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

Resumo

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Resumo

A membrana basal é um componente crítico do bilayers celulares que pode variar em porosidade, composição, arquitetura e rigidez. Estudos in vitro de epitélio endotelial-bilayers têm tradicionalmente invocado suporte permeável modelos que permitem a cultura da bicamada, mas suporta permeável é limitadas em sua capacidade de replicar a diversidade das membranas de porão humanas. Em contraste, modelos de hidrogel que requerem síntese química são altamente sintonizáveis e permitam modificações de rigidez do material e a composição bioquímica através de incorporação de péptidos biomimetic ou proteínas. No entanto, modelos de hidrogel tradicional são limitados na funcionalidade, porque lhes falta poros para contatos de celular e funcional em vitro estudos de migração. Além disso, devido a espessura de hidrogel tradicional, incorporação de poros que se estendem por toda espessura do hidrogel tem sido um desafio. No presente estudo, nós usamos hidrogel de poly-(ethylene-glycol) (PEG) e um método de modelagem de romance de óxido de zinco para abordar as deficiências anteriores de hidrogel biomimético. Como resultado, nós apresentamos um hidrogel ultrafino, membrana basal-like que permite a cultura de bilayers celulares confluentes em um andaime personalizável com arquiteturas de poro variável, propriedades mecânicas e composição bioquímica.

Introdução

Matrizes extracelulares (ECM) compõem os andaimes de proteína que suportam ligação de célula e servem como barreiras entre tipos de células distintas e são uma componente essencial do complexos tecidos e órgãos. Em contraste com o tecido conjuntivo intersticial, a membrana basal (BM) é um tipo especializado de ECM que age como uma barreira para dividir compartimentos de tecido de um outro. BMs são aproximadamente 100 µm de espessura e, portanto, permitam a comunicação direta e indireta entre as células em ambos os lados. Dois exemplos comuns de BMs são vasculares BMs, encontradas na parede microvascular entre pericitos e células endoteliais e BMs das vias aéreas que s....

Protocolo

Leia Material segurança folha de dados (MSDS) de todos os materiais anteriores usar e usar as precauções de segurança em todos os tempos.

1. síntese de agulhas de óxido de zinco

1. Preparar 250 mL de um 0,04 M Zn (NO₃)₂* solução de 6 H₂O, adicionando 2,9749 g de nitrato de zinco para 250 mL de água.
2. Prepare 150 mL de 1 M de NaOH adicionando 6 g de NaOH para 150 mL de água.
3. Configurar um banho de óleo mineral em um prato quente com agitador e mergulhe num balão de fundo redondo de 500 mL do banho de óleo à temperatura ambiente.
4. Adicionar 250 mL de Zn (NO₃)

Resultados

PEG-RGD hidrogel formaram-se pela imprensa a solução de polímero entre duas camadas de óxido de zinco sacrificial e criação de modelos de poros com agulhas de óxido de zinco. Óxido de zinco sacrificial componentes foram removidos então com ácido clorídrico, gerando ultrafinos PEG hidrogel com poros contínuos (Figura 1). A morfologia das agulhas de óxido de zinco foi confirmada pela microscopia eletrônica (SEM), e o comprimento médio e largura estavam determin.......

Discussão

O protocolo detalhado aqui nos permitiu criar um hidrogel PEG ajustável para servir como um andaime biomimetic BM. Especificamente, por diferentes pesos moleculares de PEG, estratégias de conjugação de peptídeo e estruturas microcristalina de óxido de zinco ou concentrações, o módulo de elasticidade, propriedades bioquímicas e estrutura porosa do hidrogel podem ser modificado, respectivamente. O andaime PEG ultrafino apresenta uma maior densidade de poros e menor diâmetro dos poros seja mais mimético das características .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de hidrogel 1M (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	estéril. Use em hottes com proteção para os olhos e luvas.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	Nenhum
Nitrato de Zinco Hexahidratado (Zn(NO3)2• 6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use com proteção para os olhos e luvas.
Hidróxido de Sódio (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use com proteção para os olhos e luvas.
Acetato de zinco di-hidratado ((CH3O2)2Zn2+• 2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use com proteção para os olhos e luvas.
Metanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Utilizar em hottes com protecção ocular e luvas.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Filtro estéril. 5 mL FBS em 45 mL
PBS Óleo mineral	CVS	PLD-B280B	Nenhum
Frasco de fundo redondo	ChemGlass		N/A
Termômetro			N/A
Barra			N/A
Lâminas de microscópio simples pré-limpas 3"x1"x1" mm de espessura	Thermo Scientific	420-004T	Pulverize com etanol e deixe secar antes de usar.
		de pasteur de vidro	N/A
1 mL Bulbos			N/A
Plástico 100 mm placas de Petri			N/A
Pinça			N/A
Isoladores			punções
de polidimetilsiloxano (PDMS)	N/A
	de vidro		N/A
Placas de 6 poços	Cellstar	657 160	N/A
Papel de filtro	Whatman	8519	N/A
Agitador-placa quente	VWR Dya-Dual	12620-970	Utilize com protecção para os olhos e luvas.
2,2-Dimetoxi-2-fenilacetofenona (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Utilizar com protecção para os olhos e luvas.
1-Vinil-2-pirrolidona (C6H9NO)	Aldrich		Use com proteção para os olhos e luvas.
Polietilenoglicol 10.000 (H(OCH2CH2)10.000OH)	Fluka	81280-1kg	Use com proteção para os olhos e luvas.
RGDS	Life Tein	180190	Use com proteção para os olhos e luvas.
Lâmpada UV de onda longa Blak-Ray	UVP	Modelo B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A

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