Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Resumo

Estudos no campo da microbiologia dependem da implementação de uma vasta gama de metodologias. Em particular, o desenvolvimento de métodos adequados substancialmente contribui para fornecer amplo conhecimento do metabolismo dos microrganismos crescendo em meios quimicamente definidos contendo nitrogênio exclusivo e fontes de carbono. Em contraste, a gestão através do metabolismo de várias fontes de nutrientes, apesar de sua ampla presença em ambientes naturais ou industriais, permanece praticamente inexplorada. Esta situação é principalmente devido à falta de metodologias adequadas, o que dificulta as investigações.

Nós relatamos uma estratégia experimental quantitativamente e exaustivamente explorar como metabolismo funciona quando um nutriente é fornecido como uma mistura de moléculas diferentes, ou seja, um recurso complexo. Aqui, descrevemos a sua aplicação para avaliar o particionamento de várias fontes de nitrogênio através da rede metabólica de levedura. O fluxo de trabalho combina informações obtidas durante as experiências de traçador de isótopo estável usando selecionado ¹³C - ou ¹⁵N-rotulado substratos. Primeiro consiste em fermentações paralelas e pode ser reproduzidas no mesmo meio, que inclui uma mistura de moléculas contendo N; no entanto, uma fonte de nitrogênio selecionado é rotulada de cada vez. Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) é implementada para avaliar os padrões de rotulagem dos compostos alvo e para quantificar o consumo e a recuperação de substratos em outros metabólitos. Uma análise integrada do conjunto completo de dados fornece uma visão geral sobre o destino dos substratos consumidos dentro das células. Essa abordagem requer um protocolo exato para a coleta de amostras – facilitada por um sistema de monitoramento on-line de fermentações robô-assistida – e a realização de inúmeras análises demoradas. Apesar dessas limitações, permitiu compreender, pela primeira vez, o particionamento de várias fontes de nitrogênio em toda a rede metabólica de levedura. Nós elucidado a redistribuição do nitrogênio de fontes mais abundantes em direção a outros compostos de N e determinada a origem metabólica de moléculas voláteis e aminos-ácido proteinogenic.

Introdução

Entendimento como funciona o metabolismo microbiano é uma questão fundamental para a concepção de estratégias eficientes para melhorar os processos de fermentação e modulam a produção de compostos fermentativa. Avanços na genômica e genômica funcional nestas últimas duas décadas, em grande medida contribuídas para alargar o conhecimento da topologia de redes metabólicas em muitos microorganismos. Acesso a esta informação levou ao desenvolvimento de abordagens que aponta para uma visão abrangente da função celular¹. Essas metodologias muitas vezes dependem de uma interpretação baseada em modelo de parâmetros mensuráveis. Estes dados experimentai....

Protocolo

1. fermentação e amostragem

1. Preparação de mídia e fermentadores
   Nota: Todas as fermentações são efectuadas em paralelo, usando a mesma tensão e na mesma quimicamente definidas sintético médio (SM, composição fornecida na tabela 1), que inclui uma mistura de amônia e aminoácidos como fontes de nitrogênio¹⁵. Para cada fermentação, um composto único nitrogênio é fornecido exclusivamente em um uniforme etiquetados ¹³C ou formulário ¹⁵N (100%), enquanto os outros permanecem sem rótulo. Para cada fonte de nitrogênio rotulado que é usado no conjunto de experimentos (aqui: ¹⁵

Resultados

A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxo de trabalho que foi implementado para investigar a gestão pelo fermento de várias fontes de nitrogênio que são encontrados durante a fermentação do vinho.
Para diferentes pontos de amostragem, as características de parâmetros – crescimento biológico, padrões de consumo de nitrogênio e o perfil de aminoácidos, proteinogenic demonstrará uma grande reprodutibilidade entre fermentações (Figura 4

Discussão

Quantificar o particionamento de compostos através de redes metabólicas usando experimentos traçador isotópico é uma abordagem promissora para a compreensão do funcionamento do metabolismo microbiano. Esta metodologia, quando aplicada com êxito com um ou dois substratos rotulados, atualmente não pode ser implementada para estudar o metabolismo de várias fontes usando vários isótopos elementais rotulados (ou seja, mais de dois substratos). Com efeito, as técnicas analíticas disponíveis permitem a determinação pre.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Frutose	PanReac	142728.0416
Ácido DL-málico	Sigma Aldrich	M0875
Ácido cítrico monohidratado	Sigma Aldrich	C7129
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	P5379
Sulfato de potássio	Sigma Aldrich	P0772
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma Aldrich	230391
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma Aldrich	C7902
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S9625
Cloreto de amônio	Sigma Aldrich	A4514
Hidróxido de sódio	Sigma Aldrich	71690
Sulfato de manganês monohidratado	Sigma Aldrich	M7634
Sulfato de zinco heptahidratado	Sigma Aldrich	Z4750
Sulfato de cobre (II) pentahidratado	Sigma Aldrich	C7631
Iodo de potássio	Sigma Aldrich	P4286
Cloreto de cobalto (II) hexahidratado	Sigma Aldrich	C3169
Ácido bórico	Sigma Aldrich	B7660
Heptamolibdato de amônio	Sigma Aldrich	A7302
Mio-inositol	Sigma Aldrich	I5125
Sal hemicálcico de ácido D-pantotênico	Sigma Aldrich	21210
Tiamina, cloridrato	Sigma Aldrich	T4625
Ácido nicotínico	Sigma Aldrich	N4126
Piridoxina	Sigma Aldrich	P5669
Biotina	Sigma Aldrich	B4501
Ergosté rol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Etanol absoluto	VWR Chemicals	101074F
Cloreto de ferro (III) hexa-hidratado	Sigma Aldrich	236489
ácido L-aspártico	Sigma Aldrich	A9256
Ácido L-glutâmico	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanina	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginina	Sigma Aldrich	A5006
L-Cisteína	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamina	Sigma Aldrich	G3126
Glicina	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidina	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucina	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucina	Sigma Aldrich	L8000
L-Lisina	Sigma Aldrich	L5501
L-Metionina	Sigma Aldrich	M9625
L-Fenilalanina	Sigma Aldrich	P2126
L-Prolina	Sigma Aldrich	P0380
L-Serina	Sigma Aldrich	S4500
L-Treonina	Sigma Aldrich	T8625
L-Triptofano	Sigma Aldrich	T0254
L-Tirosina	Sigma Aldrich	T3754
L-Valina	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valina	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucina	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Cloreto de amônio	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamina	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginina	Eurisotop	NLM-396-PK
Acetato de etila	Sigma Aldrich
Propanoato de etila	Sigma Aldrich	112305
2-metilpropanoato de etila	Sigma Aldrich	246085
Butanoato de etila	Sigma Aldrich	E15701
2-metilbutanoato de etila	Sigma Aldrich	306886
3-metilbutanoato de etila	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Hexanoato de etila	Sigma Aldrich	148962
Octanoato de etila	Sigma Aldrich	W244910
Decanoato de etila	Sigma Aldrich	W243205
Dodecanoato de etila	Sigma Aldrich	W244112
Lactato de etila	Sigma Aldrich	W244015
Succinato de dietila	Sigma Aldrich
acetato de 2-metilpropila	Sigma Aldrich	W217514
acetato de 2-metilbutila	Sigma Aldrich	W364401
acetato de 3-metilbutil	Sigma Aldrich	287725
acetato de 2-feniletila	Sigma Aldrich	290580
2-metilpropanol	Sigma Aldrich	294829
2- metilbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-metilbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-feniletanol	Sigma Aldrich	77861
Ácido propanóico	Sigma Aldrich	94425
Ácido butanóico	Sigma Aldrich	19215
Ácido 2-metilpropanóico	Sigma Aldrich	58360
Ácido 2-metilbutanóico	Sigma Aldrich	193070
Ácido 3-metilbutanóico	Sigma Aldrich	W310212
Ácido hexanóico	Sigma Aldrich	153745
Ácido octanóico	Sigma Aldrich	W279900
Ácido decanóico	Sigma Aldrich	W236403
Fermentador Dodecanoic	acid Sigma Aldrich	L556
1L	Legallais	AT1357	Fermentador feito à mão para fermentação
Sistema de filtração a vácuo descartável	Dominique Deutscher	029311
Fermentadores (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermentador feito à mão para fermentação
Tubos estéreis	Sarstedt	62.554.502
Fechaduras de fermentação	Legallais	AT1356	Fechaduras de fermetação feitas à mão para fermentação
Extrato de levedura BactoYeast	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubadora	agitador Infors HT
Contador de partículas	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Sistema robótico	Lab Services BV	PF0X-MA	Instrumento automático
Plate Butler Software	Lab Services BV		Software de monitor robótico
RobView			Software de cálculo desenvolvido internamente
My SQL			Base de dados de fontes internacionais
Cimarec i Telesystem Agitadores multiponto	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter balancim de plataforma	Dutscher	60903
Kit enzimático de amoníaco	R-Biopharm AG	5390
Cubetas espectrofotómetros	VWR	634-0678
Espectrofotómetro UviLine 9400	Secomam
Aminoácidos padrões fisiológicos - ácidos e neutros	Sigma Aldrich	A6407
Aminoácidos padrões fisiológicos - básicos	Sigma Aldrich	A6282
Tampões de citrato de lítio - Ultra ninidrina reagente	Biochrom	BC80-6000-06
Ácido sulfosalítico	Sigma Aldrich	S2130
Norleucina	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Software de controle e análise de dados
Ultropac 8 resina Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Filtro de coluna fisiológica de lítio de alta resolução
Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (tamanho do poro 0.22 µ m)
Filtro de membrana PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µ m
Bomba de vácuo Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Prato de pesagem liso de alumínio 70mm	VWR	611-1380
Balança de precisão	Mettler		Especificações AE163
Dimetilsulfóxido seco	Merck	1029310161	(máx. 0,025% H2O) SeccoSolv
Forno de combustão	Legallais
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA		de UP40840A
	Fluka	94318
Peróxido de hidrogênio	Sigma Aldrich	H1009
Ácido clorídrico fumegante 37% Emsure	Merck	1003171000	Grau ACS, ISO, Reag. Tampão
acetato de lítio	Biochrom	80-2038-10
Solução comercial de aminoácidos hidrolisados	Sigma Aldrich	AAS18
L-metionina sulfona	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic ácido monohidratado	Sigma Aldrich	30170
Tubos de cultura de vidro pirex	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Etil cloroformiato	Sigma Aldrich	23131
Diclorometano	Sigma Aldrich	32222
Frascos	Sigma Aldrich	854165
Microinserções para frascos de 1,5 ml	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Software de controle de instrumentos e análise de dados
Metanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, para HPLC
Acetonitrila	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, para HPLC
N,N-Dimetilformamida dimetil acetal	Sigma Aldrich	394963
Coluna BSTFA	Sigma	Aldrich 33024
DB-17MS	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µ O
sulfato de sódio de m, nitro anidro	Sigma Aldrich	238597
o nitrogênio técnico		14629
Zebron ZB-WAX			; m
Helium BIP	Air products	26699
Pipetas de vidro Pasteur	VWR	612-1702