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Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

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DOI:

10.3791/56398

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2 de março de 2018

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1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Neste artigo

Resumo

Nós relatamos um gancho de cabelo pequeno RNA (shRNA) e a próxima geração baseada no sequenciamento protocolo identificando os reguladores da inativação do cromossomo x em uma linha de celular murino com luciferase de vaga-lume e genes de resistência de hptII fundiram para o metil CpG ligação proteína 2 ( MeCP2) Gene no cromossomo X inativo.

Resumo

Avançada genéticas telas usando genes repórter inseridos a heterocromatina têm sido utilizadas extensivamente para investigar mecanismos de controle epigenético em organismos-modelo. Tecnologias, incluindo RNAs gancho de cabelo curto (shRNAs) e em cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) permitiram tais telas em células de mamíferos diploides. Aqui nós descrevemos uma tela de shRNA em grande escala para reguladores de inativação do cromossomo x (XCI), usando uma linha celular murino com luciferase de vaga-lume e genes de resistência hptII bateu no C-terminal da proteína CpG-metilo 2 (MeCP2) gene sobre o cromossomo x inativo (Xi). Reativação da construção na linha celular do repórter conferia vantagem de sobrevivência sob seleção hptII B, permitindo-nos selecionar uma biblioteca grande de shRNA e identificar grampos que reativou o repórter medindo usando seu enriquecimento pós-seleção sequenciamento de nova geração. Os grampos de cabelo enriquecidos então foram validados individualmente, testando sua capacidade de ativar o repórter do luciferase no Xi.

Introdução

Uma das formas mais comuns de deficiência mental hereditária nas fêmeas, síndrome de Rett, é causada por mutações heterozigotas em MeCP2, um gene do cromossomo x que codifica uma proteína essencial para a função neuronal normal1. Uma abordagem potencial para tratar esse transtorno seria a reativação do alelo selvagem-tipo MeCP2 na Xi, como restauração de expressão MeCP2 foi mostrada para reverter déficits neurológicos em um modelo do rato desta doença1, 2 , 4. no entanto, silenciamento epigenético de um dos dois cromossomos em células femininas X é mantida firmemente ao longo da vida de um organismo3,4e reativação robusta de um gene de Xi provavelmente exigiria um major perturbação em múltiplas vias regulamentares epigenéticas.

Para identificar os fatores necessários para a manutenção de MeCP2 silencioso, primeiro desenvolvemos um modelo de rato geneticamente modificado carregando uma fusão de gene de resistência (MeCP2-LUC-HR) MeCP2- luciferase - hptII em um dos dois cromossomos X (X MeCP2-LUC-HRxMeCP2)5. Embora o MeCP2 expressado de construção de fusão provou para ser instável e resultou em uma perda de função, fenotipicamente imitando MeCP2 exclusão nos machos heterozigotos (X/yMeCP2-LUC-HR), a expressão dos genes repórter foi prontamente detectável em um padrão consistente com a expressão de endógena MeCP25. Então geramos clones de fibroblasto imortalizado com a construção no cromossomo x inativo ou ativo e confirmou que ex expresso tipo selvagem MeCP2 e não a construção de repórter; o inverso é verdade para o último. Quando exposto a um DNA demethylating agente conhecido para revogar o silenciamento de genes, azacytidine 5 (5-AZA), células com o repórter na Xi ("células de repórter") ganharam a atividade em um ensaio de bioluminescência, indicando que nossa construção poderia ser reactivada e, portanto, usado para a seleção genética.

Em seguida desenvolvemos uma tela genética da elevado-produção de reguladores de MeCP2 silencioso. A linha celular do repórter foi primeiramente infectada com uma biblioteca retroviral contendo > 60.000 shRNAs diferente direcionamento > 25.000 genes durante o rato genoma5,6e em seguida, submetido à seleção de hptII B. Frequência de gancho de cabelo foi comparada no pré e pós-seleção amostras usando a próxima geração de sequenciamento, como repórter reativação conferia vantagem de crescimento sob hptII B seleção e resultou no enriquecimento dos grampos responsáveis. Usando essa abordagem, identificamos 30 genes implicados no MeCP2 silencioso e posteriormente, confirmaram as conclusões transducing as células de repórter com grampos individuais e medindo sua atividade de luciferase.

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Protocolo

Todas as etapas que envolvem animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Fred Hutchinson Cancer Research Center institucional Animal Care. Não reagentes usados aqui são conhecidos por causar riscos significativos para a saúde humana exceto azacytidine 5 (5-AZA).

1. geração de uma linhagem de células de repórter com MeCP2- LUC-HR transgene na Xi

  1. Preparação de fibroblastos de rato do tendão de uma fêmea X xMeCP2-LUC-HR MeCP2 rato
    1. Eutanásia em um dia 10-12-velha fêmea X xMeCP2-LUC-HRMeCP2 rato.
    2. Usando uma tesoura reta de dissecação, faça uma incisão circunferencial através da pele da porção proximal da cauda.
    3. Segurando a carcaça perto da base da cauda, puxe a pele longe do mouse para expor a porção fibrocartilaginoso da cauda. Retire e corte o terminal 10mm do tecido exposto em 1 mm longos fragmentos usando um bisturi cirúrgico.
    4. Transferência o tecido fragmentado para um 15ml cónico tubo contendo 5 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 1 U/mL penicilina, 1 µ g/mL Estreptomicina e colagenase 1,5 mg/mL, previamente filtrada através de 0,45 µm e filtros de malha então 0,2 µm. Incube durante 3-4 h a 37 ° C, com rotação contínua.
    5. Centrifugar a amostra à temperatura ambiente a 500 x g durante 10 min. resuspenda o pellet em 10 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1 penicilina U/mL e 1 estreptomicina µ g/mL (DMEM-10) e placa em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Passagem das células uma vez e expandir a uma placa de 10cm antes de prosseguir para a próxima etapa.
    6. Imortalize as células, realizando uma transdução com um vetor de expressão carregando oncogenes virais do HPV-16 (E6/E7), conforme descrito anteriormente,7.
  2. Seleção de clones de única célula e caracterizando a expressão de repórter MeCP2
    1. As células de uma placa de 10 cm da colheita. Primeiro, aspirar a mídia, adicionar 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar com 9 mL de DMEM-10 e coletar as células ressuspensa em um tubo cônico de 15 mL.
    2. Diluir as células com DMEM-10 para uma concentração final de 1 célula/100 µ l. traslado para placas de 96 poços pipetagem 100 µ l de suspensão para cada poço.
    3. Incube a 37 ° C até que os poços são confluente, que pode levar até 2-3 semanas. Substitua a mídia fresco DMEM-10 a cada 3-5 dias. Quando confluentes, mobilizar as células com 20 µ l de 0,05% do trypsin-EDTA por alvéolo e dividi-los em dois conjuntos de duplicados de placas de 96 poços.
    4. Use um conjunto de placas para analisar para a atividade de luciferase. Use um kit de ensaio do luciferase vagalume homogêneo que não exige a remoção de mídia. Siga o protocolo incluído no kit.
    5. Use os resultados da etapa 1.2.4 para selecionar clones sem atividade detectável do luciferase do restante conjunto de placas. Expanda estes clones para placas de 24 poços e em seguida 6-poços.
    6. Executar o mesmo para um clone com a mais alta atividade do luciferase; Isso será usado como um controle positivo para fins de validação.
    7. Recolher uma alíquota de cada poço na placa de 6 para um Western blot. Mobilize as células com 200 µ l de 0,05% do trypsin-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar com 2 mL de DMEM-10 e metade das células transferir para tubo de centrifuga de 1,5 ml. Lave as células uma vez com PBS antes Lise para o borrão ocidental. Alternativamente, transfira metade das células para outra placa 6. Quando as células anexar a parte inferior da placa, enxaguar com PBS e lyse para o borrão ocidental.
    8. Realizar um Western blot com anticorpo anti-MeCP2 para confirmar que expressam a células do luciferase-negativo, enquanto as células do luciferase-positivo não expressam MeCP2 do selvagem-tipo de cromossomo X ativo; Siga o protocolo descrito anteriormente8. Use tecido cerebral lisado de qualquer tipo selvagem do mouse como um controle positivo.
    9. Placa de vários clones de negativos em 2 x 105 células/poço em uma placa de 6. Tratar uma vez com 10 µM 5-AZA, incubar durante 72 h sem alterar a mídia e analisar para a atividade de luciferase, conforme descrito na etapa 1.2.3.
    10. Escolha um clone negativo (clone de Xi) que ganhou a atividade do luciferase com 5-AZA e começa a expandi-lo para várias placas de 10 cm. Congele os restantes clones negativos em nitrogênio líquido como um backup. O clone positivo (Xa clone) pode ser mantido em cultura de tecido ou congelado até utilização posterior.

2. selecionando a biblioteca para reativação usando seleção hptII B

  1. Infectando o clone de teste, aplicando a seleção e colheita de DNA para sequenciação
    1. Obter virais concentrados de construções retrovirais expressando grampos de uma biblioteca de shRNA ou produzir concentrado viral sobrenadante usando o protocolo incluído com a biblioteca desejada.
    2. Antes de prosseguir com a tela, titule da biblioteca (usando um marcador GFP, se disponível). Aponte para uma multiplicidade de infecção entre 0,3 e 0,5.
      Nota: Realize pelo menos quatro telas independentes para minimizar falsas taxas positivas. Use 20 placas por tela para obter 100 vezes cobertura da biblioteca para manter a representação adequada dos grampos de cabelo e evitar interrupções aleatórias9. No entanto, dada a tela de seleção positiva e um tamanho grande biblioteca, é provável que uma cobertura inferior seria suficiente.
    3. Pela manhã, chapa de 1 x 106 células de Xi em placas de cultura de tecido de 10 cm.
    4. À tarde, infectar as placas, substituindo os meios de comunicação com DMEM-10 fresco contendo sobrenadante viral e 5-10 µ g/mL de polybrene. Use a quantidade de sobrenadante viral determinado na etapa 2.1.2.
    5. Após 18-24 h, aspirar a mídia e adicionar 10 mL de DMEM fresco-10 para cada placa. Cultura para outra 48 h.
    6. Pela manhã, mobilizar as células usando 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA por placa e saciar com 9 mL de DMEM-10 por placa. Execute a suspensão através de um filtro de malha de 100 µm. Juntar as suspensões filtradas e dois conjuntos de placas de 10 cm em 1 x 106 células/placa de sementes.
    7. À tarde, substitua a mídia em um conjunto de placas com DMEM-10, contendo 15 µ g/mL de hptII B (dia 0). No outro conjunto, substituir a mídia com DMEM fresco-10 apenas.
    8. Após 48 horas, mobilize as células não tratadas conjunto de placas com 1 ml de 0,05% do trypsin-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar com 9 mL de DMEM-10. Transferi as células para tubos cônico de 15 ml e centrifugar a 500 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aspirar os sobrenadantes e proceder imediatamente com a extração de DNA de Pelotas. Alternativamente, piscina as células nos tubos maiores antes da etapa de centrifugação.
    9. Extrair DNA usando uma mistura de fenol e chroroform e precipitar o DNA com etanol acetato e frio de sódio como descrito anteriormente,10. As amostras de DNA de pré-seleção individuais do pool e armazenar a-20 ° C até utilização posterior.
    10. Continue a seleção B de hptII definido por mais 4 dias de cultivo. Repor os meios de seleção com fresco DMEM-10 contendo hptII B depois de 2 dias.
    11. No dia 7, substitua os meios de seleção fresco DMEM-10 apenas. Permitir que 2 a 4 dias para recuperação e então colher as células conforme descrito na etapa 2.1.8. Prosseguir com a extração de DNA, conforme descrito na etapa 2.1.9.
  2. Identificação de grampos enriquecidos nas amostras pós-seleção
    1. Contexto de uso 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') e 3' reverse loop primers (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') para amplificar a metade-grampos de pré e pós-seleção de amostras de DNA. Use o DNA extraído tudo em separado reações de PCR com 100-200 ng de DNA por reação.
      Nota: Estes contexto primer de 5' e 3' ciclo reverso primários correspondem a sequência de contexto de miR-30 montante do inserto de shRNA e a sequência para o loop de shRNA, respectivamente. Diferentes bibliotecas exigirá oligos diferentes. Ajuste as etapas de purificação para isolar os tamanhos diferentes de produto conforme necessário.
    2. Grânulos de tamanho-seleção uso para remover primers e DNA genômico e recuperar os produtos de PCR entre 100 e 200 BP seguem o protocolo incluído com os grânulos.
    3. Prepare uma biblioteca de sequenciamento para sequenciar os metade-grampos de cabelo. Gere pelo menos 50 milhões de leituras por tela. Segui o protocolo apropriado para o kit de sequenciamento e equipamentos.
      Nota: leituras de 50 milhões por tela fornece 1000-fold representação de cada shRNA na biblioteca e cerca de 10 vezes cobertura de cada infecção independente (realizada em 100 vezes a representação de cada shRNA), que garante uma representação adequada dos cada evento de infecção.
    4. Enumere cada shRNA usando um script em Perl que conta sequências com fósforos perfeitos. Escolheu a shRNAs que tinha pelo menos 10 leituras na piscina pré-selecção para uma análise mais aprofundada. Calcule os avanços como rácios de pós para pré-seleção conta e determinar a taxa falsa da descoberta (FDR) com base em 1000 permutações. Escolheu genes alvejados de shRNAs com < 5% FDR como "hits" para mais testes.

3. validar os grampos identificados ("sucessos")

  1. Lentivírus embalagens contendo shRNAs identificados na tela
    1. Semente de 8 x 106 293 FT células por placa em placas de 10 cm.
    2. No dia seguinte, substituir a mídia com 9 mL de DMEM sem antibióticos-10 por placa; fazer este 30 minutos antes do transfection.
    3. Durante o intervalo de 30 minutos, prepare duas misturas para transfeccao:
      1. Preparar a mistura 1 (por placa/shRNA; scale-up de acordo com o número total de shRNAs): 10 µ l de 2 mg/mL, o polyethylenimine (PEI) em 0,5 mL de mídia essencial mínima ideal. Misture por pipetagem e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
      2. Preparar a mistura 2 (por shRNA): 4 µ g do vetor de shRNA para ser empacotado, 1,5 µ g do vetor VSV-G envelope (pMD2.G) e 2,5 µ g do vetor de empacotamento (psPAX2), misturam em 0,5 mL de mídia essencial mínima ideal.
        Nota: Inclua um vetor de Lentivirus vazio na embalagem para uso em infecções posteriores como controlo negativo.
    4. Adicionar 0,5 mL de mistura 1 para cada alíquota de mistura 2 e misture suavemente pipetando. Incube no escuro à temperatura ambiente por 20 min.
    5. Aplique a mistura em cada prato da etapa 3.1.2 em forma de gota a gota; Agite a placa suavemente para misturar.
    6. No dia seguinte, substitua a mídia com 5 mL de DMEM fresco-10.
    7. 48 horas depois de transfeccao inicial, recolher o sobrenadante e executá-lo através de um filtro de 0,22 µm. Pre-molhado o filtro com DMEM-10 para maximizar a recuperação.
    8. Alíquota do sobrenadante filtrado em quantidades ideais para infectar uma placa de 6 bem.
    9. Congelar as alíquotas a-80 ° C para uso posterior, ou proceder de imediato com a transdução.
  2. Transdução e testes de grampos individuais para reativação do repórter do luciferase e reativação do gene MeCP2 de tipo selvagem na Xi.
    1. Pela manhã, chapa de 1 x 105 Xi células/poço em 6 placas bem.
    2. À tarde, infectar as placas, substituindo os meios de comunicação com 2 mL de DMEM-10 fresco contendo Lentivirus sobrenadante e 5-10 µ g/mL de polybrene. Infectar um controle bem com sobrenadante viral produzido a partir de um vetor de Lentivirus vazio.
    3. No dia seguinte, substitua a mídia com 2 mL de DMEM-10 contendo puromicina de 1 mg/mL. Cultura por quatro dias.
    4. Substituir a mídia com 2 mL de DMEM-10 fresco e permitir 48-72 h para recuperação.
    5. Mobilize as células com 150 µ l de 0,05% do trypsin-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar com 1,5 mL de DMEM-10. Transferi as células para tubos cônico de 15 ml e centrifugar a 500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    6. Remova a mídia e ressuspender as células em 100 µ l tampão de Lise fornecidos no kit de ensaio de luciferase. Incube a temperatura ambiente por 5 minutos. Transfira os lysates no branca placa de 96 poços e ensaio para atividade de luciferase usando o protocolo incluído no kit. Use células Xa como um controle positivo e células Xi infectadas com um vetor de Lentivirus vazio como controlo negativo.
      Nota: Evite expor as placas brancas de luz fluorescente, antes do ensaio; Isto reduzirá o fundo e aumentar a sensibilidade do ensaio. O protocolo fornecido no kit do ensaio foi encontrado para ser mais eficaz se realizada no escuro sempre que possível.
    7. Para determinar se o gancho de cabelo teve um efeito sobre o nível de expressão de MeCP2 no cromossomo x ativo, isolar o RNA das células de tranduced Xi e medir o nível de mRNA MeCP2 usando PCR quantitativo com primers projetados para amplificar apenas selvagem tipo MeCP2 (f: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. Opcional: Aumente a sensibilidade do ensaio adicionando 5-AZA para uma concentração final de 0,2 µM depois que as células se recuperaram de puromicina. Cultura de células para 72 h sem substituir a mídia e em seguida analisar para a atividade de luciferase usando o kit de ensaio do luciferase comercial.
    9. Medir a reativação do MeCP2 selvagem-tipo silenciadas. Infectar células de Xa, que abrigam o tipo selvagem MeCP2 na Xi, com o vetor contendo grampos individuais, seguindo os passos do protocolo 3.2.1. -3.2.4. Isolar o RNA das células e medir o nível de mRNA MeCP2 usando PCR quantitativo com primers projetados para amplificar apenas selvagem tipo MeCP2 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

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Resultados

Fibroblastos de tendão do mouse foram colhidos de um descrito anteriormente X xMeCP2-LUC-HRMeCP2 rato feminino, imortalizado por retroviral transdução dos oncogenes E6 e E7 do HPV-16 virus7, clonado utilizando diluição limitante e testado para luciferase atividade e expressão da proteína MeCP2 de tipo selvagem (figura 1A e 1B). Atividade do luciferase foi robusto se o repórter estava em Xa e indetectável se na Xi; a expressão MeCP2 nativa exibiu um padr...

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Discussão

Em nosso recente estudo6, geramos uma linha de celular murino com luciferase e hptII de genes de resistência fundiram a MeCP2 na Xi e transfectadas com uma biblioteca de > 60.000 shRNAs segmentação > 25.000 genes. Encontramos 30 genes cuja vantagem conferida sobrevivência knock-down sob hptII B seleção, sugerindo seu papel no controle de MeCP2 e silenciamento do cromossomo x. Esses resultados foram validados transducing a linha de celular relatados com grampos individuais e avali...

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Divulgações

Dr. Leko contribuíram para este artigo como um funcionário do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson.  As opiniões expressadas são as suas próprias e não necessariamente representam as opiniões dos institutos nacionais de saúde ou o governo dos Estados Unidos

Agradecimentos

Agradecemos a Ross Dickins da Universidade de Melbourne para fornecer graciosamente a biblioteca de shRNA usada na tela. Este trabalho foi financiado pelo Rett síndrome pesquisa Trust (A.B.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Linha celular de 293 pésInvitrogenR700-07
5-AzacitidinaSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
Anticorpo anti-MECP2Millipore07-013
ColagenaseSigmaC2674-1G
Corning 96-Well Microplacas de poliestireno branco sólidoFisher Scientific07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965-092
Parada de Expressão Vetor Retroviral Adaptado a MicroRNA (pMSCV)Open BiosystemsEAV4679
Parada de Expressão pSM2 Biblioteca shRNAmirBiblioteca Open BiosystemsRMM3796
Soro Fetal BovinoFisherbrand03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501Ou equivalente
Higromicina BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019
Sistema de Ensaio de Luciferase Bright-GloPromegaE2610Ensaio Homogêneo para Triagem de Colônias
Sistema de Ensaio de LuciferasePromegaE4530Ensaio Não Homogêneo para Teste de Grampos
de Cabelo IndividuaisLuminômetro TopCount NXTPerkin ElmerN/AOu luminômetro similar
Kit de Reagentes MiSeq v2IlluminaMS-102-2001Use o kit compatível com seu equipamento
Opti-MEMGibco31985-070
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259VSV-G vetor
de envelopePolybreneSigmaTR-1003-G
PolietileniminaPolysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260Vetor de embalagem
PuromicinaGibcoA11138-02
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolGibco25300-054

Referências

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