Nós relatamos um gancho de cabelo pequeno RNA (shRNA) e a próxima geração baseada no sequenciamento protocolo identificando os reguladores da inativação do cromossomo x em uma linha de celular murino com luciferase de vaga-lume e genes de resistência de hptII fundiram para o metil CpG ligação proteína 2 ( MeCP2) Gene no cromossomo X inativo.
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Artigo de método
Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Avançada genéticas telas usando genes repórter inseridos a heterocromatina têm sido utilizadas extensivamente para investigar mecanismos de controle epigenético em organismos-modelo. Tecnologias, incluindo RNAs gancho de cabelo curto (shRNAs) e em cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) permitiram tais telas em células de mamíferos diploides. Aqui nós descrevemos uma tela de shRNA em grande escala para reguladores de inativação do cromossomo x (XCI), usando uma linha celular murino com luciferase de vaga-lume e genes de resistência hptII bateu no C-terminal da proteína CpG-metilo 2 (MeCP2) gene sobre o cromossomo x inativo (Xi). Reativação da construção na linha celular do repórter conferia vantagem de sobrevivência sob seleção hptII B, permitindo-nos selecionar uma biblioteca grande de shRNA e identificar grampos que reativou o repórter medindo usando seu enriquecimento pós-seleção sequenciamento de nova geração. Os grampos de cabelo enriquecidos então foram validados individualmente, testando sua capacidade de ativar o repórter do luciferase no Xi.
Introdução
Uma das formas mais comuns de deficiência mental hereditária nas fêmeas, síndrome de Rett, é causada por mutações heterozigotas em MeCP2, um gene do cromossomo x que codifica uma proteína essencial para a função neuronal normal1. Uma abordagem potencial para tratar esse transtorno seria a reativação do alelo selvagem-tipo MeCP2 na Xi, como restauração de expressão MeCP2 foi mostrada para reverter déficits neurológicos em um modelo do rato desta doença1, 2 , 4. no entanto, silenciamento epigenético de um dos dois cromossomos e....
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Protocolo
Todas as etapas que envolvem animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e Fred Hutchinson Cancer Research Center institucional Animal Care. Não reagentes usados aqui são conhecidos por causar riscos significativos para a saúde humana exceto azacytidine 5 (5-AZA).
1. geração de uma linhagem de células de repórter com MeCP2- LUC-HR transgene na Xi
-
Preparação de fibroblastos de rato do tendão de uma fêmea X xMeCP2-LUC-HR MeCP2 rato
- Eutanásia em um dia 10-12-velha fêmea X xMeCP2-LUC-HRMeCP2 rato.
- Usando uma ....
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Resultados
Fibroblastos de tendão do mouse foram colhidos de um descrito anteriormente X xMeCP2-LUC-HRMeCP2 rato feminino, imortalizado por retroviral transdução dos oncogenes E6 e E7 do HPV-16 virus7, clonado utilizando diluição limitante e testado para luciferase atividade e expressão da proteína MeCP2 de tipo selvagem (figura 1A e 1B). Atividade do luciferase foi robusto se o repórter estava em Xa e indetectável se na Xi; a expressão MeCP2 nativa exibiu um padr.......
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Discussão
Em nosso recente estudo6, geramos uma linha de celular murino com luciferase e hptII de genes de resistência fundiram a MeCP2 na Xi e transfectadas com uma biblioteca de > 60.000 shRNAs segmentação > 25.000 genes. Encontramos 30 genes cuja vantagem conferida sobrevivência knock-down sob hptII B seleção, sugerindo seu papel no controle de MeCP2 e silenciamento do cromossomo x. Esses resultados foram validados transducing a linha de celular relatados com grampos individuais e avali.......
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Divulgações
Dr. Leko contribuíram para este artigo como um funcionário do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson. As opiniões expressadas são as suas próprias e não necessariamente representam as opiniões dos institutos nacionais de saúde ou o governo dos Estados Unidos
Agradecimentos
Agradecemos a Ross Dickins da Universidade de Melbourne para fornecer graciosamente a biblioteca de shRNA usada na tela. Este trabalho foi financiado pelo Rett síndrome pesquisa Trust (A.B.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linha celular de 293 pés | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacitidina | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anticorpo anti-MECP2 | Millipore | 07-013 | |
| Colagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Microplacas de poliestireno branco sólido | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Parada de Expressão Vetor Retroviral Adaptado a MicroRNA (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Parada de Expressão pSM2 Biblioteca shRNAmir | Biblioteca Open Biosystems | RMM3796 | |
| Soro Fetal Bovino | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY– 401– 2501 | Ou equivalente |
| Higromicina B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Sistema de Ensaio de Luciferase Bright-Glo | Promega | E2610 | Ensaio Homogêneo para Triagem de Colônias |
| Sistema de Ensaio de Luciferase | Promega | E4530 | Ensaio Não Homogêneo para Teste de Grampos |
| de Cabelo IndividuaisLuminômetro TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Ou luminômetro similar |
| Kit de Reagentes MiSeq v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use o kit compatível com seu equipamento |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G vetor |
| de envelopePolybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polietilenimina | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Vetor de embalagem |
| Puromicina | Gibco | A11138-02 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Gibco | 25300-054 |
Referências
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett....
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Reimpressões e permissões
