Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.
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Artigo de método
Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa grave e o bacilo da vacina disponível apenas M. bovis Calmette-Guérin (BCG) é segura e eficaz para proteção contra meningite de TB infantil grave e algumas formas de tuberculose disseminada, mas não consegue proteger contra a tuberculose pulmonar, que é a forma mais prevalente da doença. Promissoras para melhorar BCG atualmente confiam na sua transformação com genes que codificam imunodominantes M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos e/ou complementação com genes que codificam co-fatores que estimulam o antígeno apresentação de células. Maiores limitações para essas abordagens incluem baixa eficiência e baixa estabilidade do nível incerto de segurança de vetores de expressão. Neste estudo, apresentamos uma abordagem alternativa para melhoria da vacina, que consiste de complementação do BCG com proteínas exógenas de interesse na superfície de bactérias, ao invés de transformação com plasmídeos codificação de genes correspondentes. Primeiro, as proteínas de interesse são expressos em fusão com avidin monomérico em padrão Escherichia coli sistemas de expressão e, em seguida, usado para decorar a superfície de biotinilado BCG. Usando a superfície de BCG decorado com antígeno de ovalbumina substituto das experiências com animais demonstram que a bactéria modificada é totalmente imunogênicas e capazes de induzir respostas de célula T específica. No total, os dados aqui apresentados fortemente apoiar um romance e um método eficiente para remodelar a vacina BCG atual que substitui a abordagem convencional laboriosa de complementação com os ácidos nucleicos exógenos.
Introdução
Várias estratégias têm sido propostas para substituir a atual vacina contra tuberculose BCG, incluindo sistemas de adjuvante da proteína, tecnologias em vetor virais, M.tb cepas atenuadas e cepas de BCG geneticamente modificadas, também para introduzir genes excesso, expressando antígenos de BCG que não são suficientemente expressa durante infecção1 ou Mtb-antígenos específicos, não presentes na BCG2. Engenharia genética, no entanto, enfrenta muitos obstáculos, incluindo o nível incerto de segurança, o processo demorado e a baixa eficiência de expressão vetores4,
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Protocolo
Todos os animais foram mantidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado Animal e comissões de utilização na Universidade da Colúmbia Britânica. Experimentos foram aprovados pelos comitês de uso e cuidado Animal e executados de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal. O número de bem-estar animal garantia é A11-0247.
1. geração de proteínas da fusão Avidin monomérico expressando plasmídeos
- Clone sub avidin monomérico sequência12 em plasmídeo pDEST17 entre os sites "CTC" e "Ga", que corresponde a 133-134bp. (ou seja, entre o 6-histag e o site de recombi....
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Resultados
Com os procedimentos gerais descritos acima, foi examinada a viabilidade da superfície biotinylation BCG e decoração com substituto do antígeno óvulos. A imunogenicidade do BCG modificado foi então testado em vivo. A superfície bacteriana foi facilmente rotulada com biotina para exibição rápida dos antígenos quimérico de avidina sem qualquer alteração detectável em fenótipos bacterianas. A BCG modificada resultante é eficientemente ingerido pelas células de apresentação de antíge.......
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Discussão
Nós relatamos neste estudo uma abordagem não-genético para exibição rápida e eficaz de proteínas exógenas na superfície de BCG para adicionar propriedades funcionais específicas eficientemente melhore imunogenicidade da bactéria ou antígenos específicos. Demonstrámos que superfície celular BCG pode ser facilmente biotinilado para decoração de superfície instantânea com proteínas da fusão avidina. O procedimento total pode ser realizado até 2 horas, enquanto transformação genética e seleção de clones positivos requer 2 a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. R Stokes para a cepa BCG Pasteur e r. Talal para suporte técnico. Agradecemos também o GenScript para obter ajuda com a síntese do gene.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 livres de endotoxinas | 36750 | ||
| Sulfo-NHS SS biotina | Thermo Fisher | 21328 | |
| estreptavidina conjugada com FITC | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| I-Ab-OVA323-339 tetrâmero | MBL Internacional | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON resina de purificação poli-histidina-Tag | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 rato conjugado anti-camundongo CD4 | BD Bioscience | ||
| AF647 rato anti-rato IFN-g | BD Bioscience | ||
| AF647 rato anti-rato I-A/I-E | BD Bioscience | ||
| PeCy7 rato anti-camundongo CD4 | BD Bioscience | ||
| PE rato anti-camundongo CD8 Ab | BD Bioscience | ||
| AF 647 rato anti-rato H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com FITC | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rato anti-rato CD4 | BD Bioscience | ||
| Ultra-pequeno ouro - conjugado cabra anti-coelho IgG | Microscopia Eletrônica Ciências | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 caldo | BD Sistemas de Diagnóstico | 271310 | |
| OADC | BD Sistemas de Diagnóstico | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 linhas celulares de macrófagos murinos | Tipo Americano Coleção | ||
| pDEST17 plasmídeo | Invitrogen | 11803012 | |
| plasmídeo pUC57-OVA | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| plasmídeo pDONR221 | Invitrogen | 12536017 | |
| colunas Ni-NTA | Concentradores de proteína Qiagen | 31014 | |
| Pierce | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II | Carl Zeiss Inc | ||
| Retiga EX, microscópio eletrônico QImaging | |||
| Tecnai G2 200kV | FEI Empresa | G2 200Kv | |
| 70μ m Filtro de células Falcon | Thermo Fisher | 87712 | |
| Kit de seleção positiva de biotina para camundongos EasyStep | Células-tronco | 18556 | |
| biotina-Ter119/anticorpo de células ertyroid | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| kit Cytofix/Cytoperm | BD Pharmingen | 554714 | |
| Sistema de ensaio de Luciferase Bright-Glo | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminômetro | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 micrótomo | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 liofilizador | Savant Instruments | NL 50 | |
| Frascos de vidro boroscilicado Wheaton | Wheaton | VWR 66011-675 |
Referências
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al.
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Reimpressões e permissões
