Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Resumo

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Resumo

Fatias de cérebro de roedor cultivadas são úteis para estudar o comportamento de neurônios e glia em um ambiente que mantém muitas das suas interações normais na vivo celular e molecular. Fatias obtidas a partir de uma variedade de linhas de rato geneticamente modificado ou o uso de vetores virais para expressão de proteínas fluorescente etiquetadas ou repórteres em fatias de cérebro de tipo selvagem permitem imagens de alta resolução por microscopia de fluorescência. Embora vários métodos têm sido desenvolvidos para imagem fatias do cérebro, combinando cultura fatia com a capacidade de realizar imagens de alta resolução repetitiva de células específicas em fatias ao vivo durante longos períodos de tempo tem colocado problemas. Isto é especialmente verdadeiro quando os vetores virais são utilizados para a expressão de proteínas exógenas desde que isto é feito melhor em um sistema fechado para proteger os usuários e evitar a contaminação cruzada. Simples modificações feitas ao método de cultura rolo tubo cérebro fatia que permitem imagens de alta resolução repetitiva de fatias durante muitas semanas em um sistema fechado são relatadas. Cultivo de fatias em photoetched lamelas permite o uso de marcas fiduciais rapidamente e precisamente reposicionar o palco para o campo idêntico de imagem ao longo do tempo, antes e depois de tratamentos diferentes. Exemplos são mostrados para o uso desse método combinado com coloração neuronal específica e expressão para observar alterações em fatias hippocampal arquitetura, expressão neuronal mediada por viral de proteínas fluorescentes e o desenvolvimento de patologia cofilin, que anteriormente foi observada no hipocampo de doença de Alzheimer (AD) em resposta ao tratamento da fatia com oligômeros de peptídeo de amiloide-β (Aβ).

Introdução

Cultura primária de neurônios dissociadas de regiões do cérebro de roedor é uma importante ferramenta usada por pesquisadores para observar respostas para patologicamente implicado estímulos. No entanto, tais estudos têm a desvantagem de olhar para os neurônios em 2D única e sem seu sistema de apoio a glia. Além disso, a não ser crescidas sob condições de muito alta densidade (640 neurônios/mm² ou cerca de 16% da superfície), no qual ele torna-se impossível acompanhar a consequência aleatória de um dendrito ou axônio para mais do que uma curta distância do corpo celular, hipocampo viabilidade neuronal durante 4 semanas diminui significativamente¹, limitando o uso de culturas dissociadas de estendido estudos das patologias relacionadas com a idade. O cultivo de fatias preparadas a partir de cérebro de roedor é uma opção atraente que supera essas limitações, mantendo uma arquitetura organizada cell e viabilidade para semanas ou meses. As condições para a manutenção de muitas regiões diferentes do cérebro de roedor em fatia cultura foram descritos².

Dois métodos principais são amplamente utilizados para a cultura a longo prazo de fatias de cérebro: cultivo nas membranas para a interface ar-líquido³ ou cultivo em lamelas em tubos fechados pode para girar em uma incubadora de rolo para fornecer aeração⁴. Fatias cultivadas nas membranas podem ser fotografadas diretamente com microscopia de fluorescência de alta resolução usando um microscópio vertical e de objectivos de imersão de água⁵. Alternativamente, fatias cultivadas nas membranas foram transferidas para pratos de fundo de vidro para obter uma boa resolução de espinhas dendríticas, usando um microscópio invertido⁶. No entanto, ambos os métodos de imagem fatias crescidas nas membranas são sistemas abertos que exigem mudanças de médio e costumam usam antifúngico e/ou antibióticos para evitar ou reduzir a contaminação^5,6. Fatias de uma membrana na interface ar-médio mantêm excelente morfologia e sobrevivência, mas retornando para locais precisos durante repetitivo imaging na alta magnificação é extremamente difícil, a menos que a experiência está seguindo apenas pequenos grupos de células expressando um marcador fluorescente. Embora fatias cultivadas em membranas têm sido utilizadas com expressão viral mediada de transgenes^5,6, protocolos de biossegurança podem exigir um sistema fechado de cultura ser empregado por certos vetores virais que são usados para expressando fluorescente etiquetado proteínas e repórteres da fisiologia celular. Além disso, objectivos de imersão exigem descontaminação entre amostras que será seguido em cultura⁵. Uma aplicação importante das culturas de interface da membrana é a combinação de imagem de alta resolução com eletrofisiologia em tempo único pontos⁷.

Método do tubo do rolo com lamelas dentro do tubo plástico não permite qualquer eletrofisiologia ou imagens de alta resolução sem remover a lamela. Assim, este método foi aplicado mais frequentemente para estudos de longo prazo em que a pós-fixação observações tenham sido feitas a⁸. Descrito aqui é um método que utiliza a técnica de cultura de tubo do rolo, mas nos tubos perfurados-out com fatias em lamelas que podem ser fotografadas repetidamente para contanto que as culturas é mantido. O sistema fechado não requer nenhuma mudança média para a imagem latente e utiliza as lamelas de photoetched para fornecer marcas fiduciais que permitem que a imagem em alta ampliação, após dias ou semanas, os campos precisos previamente fotografados.

Nós aplicamos esse método para examinar alterações em roedor hipocampo, uma região do cérebro importantes envolvido na aprendizagem e memória. O hipocampo de roedor frequentemente é estudado como um modelo para alterações patológicas ou relacionadas com a idade observada durante o desenvolvimento do impairment cognitive⁹, tais como aqueles que ocorrem no anúncio. Nosso método é particularmente adequado para estudar as alterações patológicas que se desenvolvem dentro de uma única fatia ao longo do tempo em resposta às mudanças ambientais, tais como aumentos de peptídeos Aβ, que é característica da AD⁸. Uma patologia associada com cérebro de AD de humanos e roedor é a presença de agregados de cofilin-actina e hastes, os último contendo feixes de filamentos no qual cofilin e actina são em um 1:1 relação molar^{10,11, 12}. as hastes têm sido observadas em fixas fatias de hipocampo de ratos após o tratamento de Aβ, bem como dentro de uma fatia do cérebro de roedores vivos expressando GFP-cofilin submetida a hipóxia⁸, e eles podem contribuir para a disfunção sináptica vista em AD e acidente vascular cerebral. Aqui nós usamos este novo método de cultivo para observar a evolução temporal e distribuição dentro de fatias de exógenas quiméricoes fluorescentes proteínas expressas introduzidas por diferentes vírus. Então, nós utilizamos a expressão neuronal específica de uma construção de repórter de cofilin para acompanhar o desenvolvimento da haste cofilin e patologia agregada em fatias hippocampal em resposta ao tratamento com oligômeros Aβ solúveis (Aβ_ó).

Protocolo

Uso de animais segue reprodutores aprovados e protocolos de uso de animais que se conformam ao cuidado Animal e usar as diretrizes da Colorado State University.

Nota: O protocolo abaixo descreve o método de preparação e cultura para a incubação a longo prazo e intermitente de imagem de fatias hippocampal. Uma única fatia hippocampal é anexada a uma lamela de photoetched especialmente preparado usando um coágulo de plasma, e em seguida as lamelas são seladas com o lado liso de um tubo perfurado-fora do rolo, que é mantido em uma incubadora de rolo. Coágulos de plasma são dissolvidos com plasmina antes da infecção viral para a expressão da proteína fluorescente e imagens em alta resolução. Um corante fluorescente de vital neuronal é usado para neurônios dentro as fatias de imagem.

1. preparação da cremalheira do tubo do rolo

1. Uso o modelo mostrado na Figura 1um impresso para o tamanho mostrado na barra de escala. Com um prego, fazem pequenos furos (grandes o suficiente para um marcador de ponta fina) no modelo centrado sobre os buracos.
2. Definir o modelo no fundo de um prato de cultura de tecidos de 15 cm (diâmetro nominal de 14 cm) e marque a posição dos furos. Repita isso em um segundo prato.
3. Com brocas, projetadas para uso em plástico, faça 6 furos de diâmetro de 1,5 cm em cada prato em uma matriz de hexagonal (4,8 cm--centro), com centros de furo 2,5 cm da borda do prato. Faça três furos (3 mm de diâmetro) 12 mm da aresta que são colocados equidistantes entre dois dos maiores buracos como mostrado na Figura 1A.
4. Com o fundo de cada prato frente para o outro, coloque um parafuso de máquina longa 2,5 polegadas (diâmetro de 3/16 de polegada) com uma arruela lisa através de um dos furos pequenos seguidos por uma segunda anilha plana, uma peça de polietileno tubos (espaçador, 4,7 cm), outra arruela plana , o segundo prato de cultura de tecidos, outra arruela plana, uma anilha e uma porca.
5. Repita a etapa 1.4 sobre os outros dois parafusos de máquina e só vagamente apertando até que todos os parafusos de máquina são no lugar. Em seguida aperte bem as porcas.
6. Trabalhar os ilhós (5/16 polegadas grosso, 5/8 de polegada buraco de diâmetro) nos orifícios do prato inferior para obter o tubo do rolo final cremalheira (Figura 1B; mostrada com dois tubos no lugar). Coloca um adesivo em cada rack com um número exclusivo.

2. preparação dos tubos de rolo e lamelas

1. Fazendo o gabarito para a furação em tubos de rolo
   1. Faça um furo de 1,5 cm, 8 cm de profundidade no lado centro de um 2 x 4 x 5,5 polegadas bloco de madeira em um ângulo tal que o lado liso do rolo de tubo vai ser quase paralelo com o bloco quando inserido(Figura 2).
   2. Alargar o buraco usando uma lima redonda de madeira a ampliar e a conicidade do furo para permitir a inserção de tubo (tubos de rolo são ligeiramente maiores no diâmetro perto do fim da tampa) (Figura 2B).
   3. Um buraco de 1,5 cm de diâmetro vertical, 5,5 cm do lado do bloco e centrada sobre o furo lateral (Figura 2C).
   4. Quando o buraco de lado é afilado suficiente, inserir um tubo de rolo que está marcado no local desejado para o centro do buraco para a fatia e posicione o tubo para que o local marcado é centrado no buraco vertical 1,5 cm.
   5. Retire o tubo e meça a distância do ponto à extremidade do tubo. Marcar essa distância do centro do furo do gabarito e inserir um prego para fornecer uma paragem para posicionar corretamente o tubo de perfuração (seta na Figura 2C).
   6. Use uma serra para cortar a unha nivelada com a superfície do bloco de madeira para evitar lesões.
   7. Adicione clipes de mola na parte inferior do gabarito se não houver uma imprensa de broca com ranhuras que permitem que seja ancorado (Figura 2D preto seta). Caso contrário, use grampos para prender o gabarito com segurança para a furadeira.
2. Utilizar o gabarito descrito acima para segurar e posicionar um tubo de plástico cultura 11cm face plana com o lado liso para cima(Figura 2), faça um furo de diâmetro de 6 mm com o centro de 1,0 cm da parte inferior e centrado entre os lados do tubo.
   Nota: Deve ser usada uma broca projetada para plástico.
3. Com um giro sobre um eixo rebarbador, suavizar as arestas do furo(Figura 2)e fazer 4 ranhuras no interior borda do furo (Figura 2,E, de encastrar) para facilitar a drenagem do buraco durante a rotação.
4. Com um furo de 12mm socar, corte discos de diâmetro 12 mm de folhas de borracha atóxica dupla face adesivo do silicone. Usando um padrão um papel furador (6 mm de diâmetro), faça um buraco no centro de cada disco.
5. Lave os tubos perfurados com etanol a 70%, ar seco-los em uma câmara de segurança biológica e esterilize os tubos e os discos de adesivo perfurados por 40 min na lâmpada UV (30 W a distância média de 70 cm) a segurança microbiológica.
6. Reposicione os tubos e discos depois de 20 min para que todas as superfícies expostas são esterilizadas. Sob condições estéreis, retire o fundo de um disco adesivo branco e apor a borracha de silicone para o exterior de um tubo, alinhando os orifícios (Figura 2-F).
   Cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use óculos de protecção e fechar o armário antes de ligar a lâmpada UV.
7. Limpe a 12 mm de diâmetro photoetched (100 centro numerado 1 mm quadrados) alemão as lamelas de vidro. Mantenha as lamelas suavemente com fórceps e mergulhe em etanol absoluto, seguido por água, seguida de etanol absoluto novamente e finalmente, mergulhe as lamelas em uma chama para queimar o etanol. Permitir que as lamelas esfriar.
8. Segurando as lamelas com fórceps, mergulhar em 2% 3-aminopropyltriethoxysilane em acetona para 10 s. enxágue as lamelas com água ultrapura e deixar secar ao ar.
9. Definir as lamelas em papel de filtro estéril dentro de uma câmara de segurança biológica do armário e ligar o UV luz. Expor a cada lado das lamelas por 20 min.
   Cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use óculos de protecção e fechar o armário antes de ligar a lâmpada UV.

3. hippocampal fatia preparação

1. Antes de iniciar a dissecação, prepare as metades de lâminas de dois gumes para o helicóptero de tecido. Dobrar as lâminas longitudinalmente cuidadosamente com os dedos e partir ao meio.
2. Enxágue as metades de lâmina com acetona, usando um cotonete de algodão para limpá-los, seguido de lavagem em etanol absoluto e secagem do ar.

Antes de montar uma lâmina metade no helicóptero do tecido, sterilize a enxaguando com etanol a 70%.

Seguir protocolos aprovados pelo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização; após a anestesia de isoflurano, abater um filhote de rato ou rato de 4-7 dias de idade por decapitação e remover a cabeça com uma tesoura ou guilhotina.
Nota: O protocolo de cultura de fatia de cérebro é independente do mouse ou rato estirpe ou genótipo. Muitas linhas de rato transgénico com diferentes origens genéticas têm sido utilizadas.

Enxaguar a cabeça com etanol a 70% e coloque-o em um prato de Petri de 60 mm. Até a montagem final da fatia cerebral no tubo do rolo, todas as seguintes etapas são executadas em uma capa de fluxo laminar para manter a esterilidade.

Usando uma lâmina cirúrgica #21, fazer um corte sagital através da pele e o crânio. Com uma pinça de Dumont #5, casca de volta a pele e o crânio para expor o cérebro.

Com a pinça fechada, delicadamente destrinchar o cérebro todo, liberá-lo por beliscar com a pinça através do tronco cerebral por trás do cerebelo. Coloque o cérebro em um prato de 60mm estéril contendo glicose de Balanced Salt Solution/0.5% do 4 ° C Gey (SYNTHASE/glicose).

Usando um microscópio de dissecação para visualizar o cérebro (Figura 3), coloque o lado dorsal do cérebro e corta o terço frontal do cérebro e o cerebelo com uma lâmina cirúrgica (Figura 3B).

1. Com a pinça, segure a aparada cerebral posterior para cima e o lado ventral contra o lado da caixa de Petri para a estabilidade. Delicadamente tease meninges afastadas em torno da linha sagital mediana e remover o tecido do mesencéfalo usando um fórceps de Dumont #5 com ponta fino (Figura 3C, círculo tracejado).
2. Fazer dois cortes nas laterais do cérebro para espalhá-lo aberto (Figura 3C, linhas tracejadas). Uma vez que o cérebro é colocado lado dorsal para baixo e aberto de propagação, a fissura hippocampal deve estar visível (Figura 3D, seta).
3. Transferir o cérebro aberto de propagação para um pedaço de filme plástico Policlorotrifluoroetileno e posicioná-lo para cortar no palco de um helicóptero de tecido. Molhar a lâmina com SYNTHASE/glicose e pique o hipocampo em ~ 300 µm de espessura.
4. Com uma pipeta de transferência, irrigue o cérebro fatiado fora do filme plástico em um prato fresco 60 mm contendo SYNTHASE/glicose (Figura 3E). Delicadamente, beliscar fora e provocar, com pinça de ponta fina, as restantes meninges e outros tecidos não-hipocampo (Figura 3F) do rodelas (Figura 3G, H).

4. chapeamento fatias

1. Uma vez fatias foram obtidos, coloque 2 µ l de plasma de galinha no centro do lado de photoetched de uma lamela preparado. Espalhe o plasma ligeiramente para alcançar um lugar de diâmetro de 3 a 4 mm.
   Nota: O photoetched de lado é o lado superior da lamela quando visto através de um microscópio de dissecação, tal que os números são orientados corretamente.
2. Transferi 1 fatia de cérebro com uma espátula de ponta estreita-estéril(Figura 4)para o lugar de plasma (Figura 4B). Use pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia do SYNTHASE/glicose.
3. Toque a espátula para o plasma mancha na lamela e com a pinça fechada, empurre a fatia no sentido da lamela.
4. Mix de 2,5 µ l de plasma com 2,5 µ l de trombina em um tubo separado. Rapidamente coloque 2,5 µ l dessa mistura sobre e em torno da fatia e pipetar acima e para baixo suavemente para misturar (Figura 4B).
   Nota: Irá coagular o plasma dentro de 10-15 s, então isso deve ser feito rapidamente. Se a fatia de adesão é um problema, misturar 5 plasma µ l com 5 trombina µ l e usar 4-5 µ l na fatia, removendo alguns após a mistura para que a fatia situa-se no sentido do lamela.
5. Remova o plástico transparente cobrindo desde o lado exposto do adesivo de borracha do silicone anteriormente Aposto em um tubo de rolo e colocar a lamela com a fatia do cérebro para o adesivo, alinhando a fatia dentro do buraco (Figura 4C).
6. Para assegurar uma aderência, macio, aplica pressão para a lamínula com o polegar pressionando a lamela para baixo uniformemente e segurando-o por cerca de 1 min enquanto transferi-lo para a câmara de segurança biológica.
7. Em uma câmara de segurança biológica, adicione 0,8 mL de meio de cultura completo Neurobasal A (Tabela de materiais) para cada tubo (Figura 4-D).
8. Fluxo de uma mistura de ar 5% CO₂95% através de uma pipeta de Pasteur algodão-conectado estéril fixa por uma pinça. Lave o tubo do rolo com a mistura de gás e cap rapidamente o tubo como sua retirada do próximo a pipeta.
9. Rotule os tubos com o número de fatias e rack de número. Inserir os tubos em um rack de rolo, garantindo que eles são geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione os tubos para equilibrar.
10. Coloque as prateleiras em uma incubadora de rolo de 35 ° C com rolos girando a cremalheira do rolo no sobre RPH 10-13 (Figura 4E). Para manter a média no fundo dos tubos, inclinação da incubadora volta aproximadamente 5°, aumentando a sua frente em uma placa.
11. Digite o número de fatia e tubo em uma planilha, que é usado para gravar todas as informações de datas de observação e tratamentos de fatia.
12. Em aproximadamente dia 6, na cultura, adicione 1 µ l (0.002 U) de plasmina ativa a cada tubo.
13. Após a formação de coágulos dissolver completamente (geralmente dentro de algumas horas), retire o meio e substituí-lo por meio fresco sem plasmina. Se necessário, as fatias podem ser incubadas com plasmina durante a noite e o meio mudou no dia seguinte.
14. Fatias geralmente são incubadas pelo menos 7-10 dias antes da utilização em experimentos. Aspire médio e substituí-lo no dia 3 ou 4, novamente no dia 7 e posteriormente a cada 7 dias.

5. preparação de vetores virais para a expressão do Transgene

Nota: Expressão de transgenes em neurônios das culturas fatia é conseguida usando cérebros de roedores geneticamente modificados ou introduzindo o transgene infecção com vírus deficiente de replicação recombinante.Adenovírus (AV), vírus adeno-associado (AAV) e vetores de lentivirus recombinantes foram todos utilizados em nossas culturas hippocampal fatia para expressão de quimeras de diferentes proteínas fluorescentes em fatias de cérebro.

1. Prepare-se^13,14replicação deficiente AV para expressar o RNA de interesse de acordo com os métodos descrito em outro lugar. Título do vírus para infecciosa U/mL, pelo método de diluição serial usando um anticorpo para uma proteína virally expressa como descrito¹⁴. Para observar cofilin agregados e formação de haste cofilin-actina, utilizam o cDNA cofilin-R21Q-mRFP (plasmídeo #51279)¹⁶.
   Nota: O synapsin 1 promotor é uma excelente escolha para expressão neuronal específica¹⁵, Considerando que o promotor citomegalovírus é útil para a condução de níveis de alta expressão em muitos tipos de célula¹³.
2. Prepare AAV transfection co de transferência do plasmídeo contendo o gene de interesse e um plasmídeo rep/cap, com ou sem um plasmídeo ajudante, em células HEK293-embalagens, que abastecem o gene viral de E1, como descrito anteriormente^17,18.
   Nota: AAV recombinante também pode ser feita para alvo inserção no genoma celular hospedeiro¹⁹. Para o plasmídeo de transferência, usamos cofilin humana 1 com um C-terminal mRFP1 fluorescência proteína tag (plasmídeo #50856) clonado em um synapsin contendo promotor AAV plasmídeo a jusante do cálcio sensor GCaMP5G²⁰. Um pedaço de DNA a sequência de peptídeo P2A Self chicotada de codificação é inserido pelo PCR entre GCaMP5G e cofilin-RFP durante a preparação do plasmídeo a transferência para fornecer a expressão de ambas as proteínas de um único vírus adeno-associados transcrição²¹.
3. Prepare vectores recombinantes lentivirus, co transfeccao de plasmídeo de transferência que contém o gene ou cDNA de sinais de interesse e de integração, juntamente com uma terceira geração de lentivirus embalagem mistura que divide a mordaça viral, pol, rev e genes de vsv-g para três diferentes plasmídeos^22,23.
4. Para o plasmídeo de transferência, use um único passo clonagem sistema²⁴ para montar o promotor synapsin e cofilin-R21Q-mRFP cDNA (do plasmídeo 51279 #) em pLKO.1-GFP (plasmídeo #30323), com o promotor de synapsin e cofilin-R21Q-mRFP, substituindo o hPGK promotor e GFP cDNA, respectivamente.
5. Transfect o plasmídeo final em células HEK293T pelo fosfato de cálcio, como descrito anteriormente,²³.
6. Recolher a média de quatro pratos de 10 cm, concentrar a 500 µ l usando concentradores centrífugos 150K-corte e armazenar o lentivirus final a-80 ° C em pequenas alíquotas após congelamento rápido em nitrogênio líquido. Descongele uma alíquota apenas uma vez para infectar as células.
7. Determine empiricamente que o volume de cada tipo de vírus preparado para atingir o grau de expressão desejado pela criação de um número de culturas diferentes fatia a seguir a expressão dos transgenes após infecção com vários volumes de vírus.
   Nota: Normalmente, 1-10 µ l de vírus é usado por fatia.

6. fatia tratamentos

1. Infectando as fatias com vírus
   1. Trabalhando em uma câmara de segurança biológica aprovada pelo trabalho de vírus no nível de segurança biológica adequado para o vetor, misture uma parte alíquota do vírus (geralmente 1-10 µ l) com 0,8 mL de meio completo.
   2. Aspire o meio da fatia usando uma pipeta Pasteur estéril em uma armadilha de coleção contendo água sanitária. Uma armadilha secundária é usada sempre entre a primeira armadilha e a fonte de vácuo.
   3. Substituir este meio com alíquota contendo vírus preparada acima, retornar os tubos de cultura para uma cremalheira e colocar na incubadora.
   4. Depois de 2-5 dias de incubação as fatias com vírus a segurança microbiológica, remover o meio contendo vírus com uma pipeta de transferência estéril e colocá-lo em um frasco contendo um agente antiviral aprovado para matar o vírus.
2. Coloração de neurônios com corante vital
   1. Preparar e armazenar alíquotas de corante vital neuronal fluorescente²⁵ por µ l 4 congelação rápida das alíquotas em nitrogênio líquido a uma concentração de 100 µM e armazenar estas a-20 ° C. Não congelar/descongelar o corante mais de uma vez.
   2. Para rotular os neurônios para visualização por microscopia de fluorescência, descongelar uma alíquota do corante vital neuronal e diluir 4 ml em meio Neurobasal completo (concentração final de tintura é 100 nM).
   3. Remover o meio de fatias por aspiração (ou de uma pipeta de transferência se o meio contém vírus) e substituí-lo com 0,8 mL do meio de contendo o corante vital neuronal de 100 nM. Retorne as fatias para o aparelho de rolo na incubadora.
   4. Após incubação as fatias por 2 h, Aspire o meio contendo corante e substituí-lo com 0,8 mL de meio fresco completo, em uma câmara de segurança biológica.
      Nota: Rotulagem de neurônios em fatias com corante vital requer várias horas de incubação. As primeiras imagens são geralmente tomadas 24h após tratamento com corante. Embora os neurônios são rotulados especificamente, há fluorescência de fundo que declina durante 2-3 dias para dar a melhor imagem neuronal. Intensidade do corante vital declina após 72 h.
   5. Para acompanhar as mudanças na morfologia da fatia ao longo do tempo, reclassificar as fatias cada 7 dias.

7. fatia de imagem

1. Fatias de vista de um microscópio invertido. Para mais brilhantes imagens de fluorescência, a 24 h antes da imagem latente, troca de meio de cultura com meio Neurobasal A completo sem o indicador de pH vermelho de fenol.
   Nota: Para as experiências aqui relatadas, fatias são vistas em um microscópio de fluorescência confocal de disco giro invertido equipado com um linear codificado x, y palco com piezo z controle e uma câmera digital de alta resolução sensível.
2. Transferir o tubo com a cultura de fatia a criação da imagem do aparelho do tubo do rolo para o titular do tubo sob medida (Figura 5A), que é colocado no adaptador de fase (Figura 5B), para manter a lamela perpendicular o objetivo e manter a fatia na mesma orientação durante as sessões de imagem repetitivas ao longo de intervalos de tempo.
3. Empurre a chave deslizante no adaptador de palco apertado contra o tubo para segurar o tubo na posição (Figura 5B).

Manter a temperatura de fatia a 35 ° C durante a imagem latente pelo uso de aquecimento tiras e um controlador de termorregulação construído no adaptador do palco sob medida (Figura 5-C).
Nota: Detalhes do titular do tubo, adaptador de palco, e aquecedor pode ser acessado em: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.

Usando uma baixa potência (EG., 4x) objectivo e transiluminação de campo claro, enfocam o padrão de grade de photoetched (Figura 6A) sob a fatia. Para a sessão de imagem inicial, digitalizar rapidamente em torno da fatia para localizar e registrar o número para as diversas regiões onde a maior imagem de ampliação é desejada (por exemplo, cornu ammonis (CA) 1, CA3, giro denteado (DG), etc.).

Mova o palco para o primeiro quadrado de grade que contém uma região de interesse. Alterne para o 20 X objetivo de ar e localizar uma marca fiducial (EG., dica de um número gravado) (Figura 6B).

Alternar para um objectivo de poder mais elevado (40 X ou 60 X), localize a marca fiducial e depois gravar o x e y posição do palco. Mova o palco para encontrar o campo (s) de interesse nas proximidades e recorde seus x e y desloca das marcas fiduciais (Figura 6B, seta). Repita em outras áreas de grade se desejado.
Nota: Estas posições off-set da marca fiducial permitem identificação consistente da mesma localização da lamela, quando a fatia é imaginada, mesmo que o original x, y configuração da marca fiducial muda quando o adaptador de tubo ou estágio será removido e substituído.

Capture uma imagem Z-pilha dentro de cada campo selecionado usando o controle objetiva de microscópio ou um controle de fase de piezo, se disponível.
Nota: Aviões de imagem geralmente são obtidas em intervalos de 0,5 µm a 2 µm, dependendo do tamanho e a resolução desejada, os recursos de imagem. Criando uma imagem 3D de qualidade exige que características da imagem estendem ao longo de vários planos de aquisição, e então para visualizar características menores, intervalos menores são necessários entre aviões.

Manter o total de imagem tempo para cada fatia tão curto quanto possível.
Nota: a maioria das sessões de imagem relataram aqui estavam sob 18 min/fatia. No entanto, podemos ter fotografado algumas fatias de dez ou mais vezes e até mesmo como longo como 40 min em uma única sessão, sem dano aparente na sobrevivência a longo prazo da fatia.

Resultados

Para determinar exatamente como marcas fiduciais podem ser utilizadas para recriar as mesmas células dentro das mesmas áreas ao longo do tempo, nós examinamos fatias cultivadas em photoetched lamelas (Figura 6A). Os neurônios foram visualizados por coloração com um corante vital (100 nM para 2h; não mancha células não-neuronais), que desaparece de neurônios ao longo do tempo, sem prejudicar as células²⁵. Nós identifica...

Discussão

Método do tubo do rolo aqui descrito permite cultivo a longo prazo e de alta resolução de imagem ao vivo do tecido cerebral em fatias. Um grande problema com a técnica de fatia como aplicado aqui é na montagem e manutenção de fatias. Revestimentos de lamela que oferecem suporte a adesão de fatia, promover fatia desbaste, aumentando a consequência natural de neuritos e migração de células fora da fatia; assim, evitamos o uso destes substratos. A inserção de grupos aminoácidos para o vidro por tratamento com 3-aminopropylt...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fundos de pratos de cultura de 15 cm	VWR Scientific	25384-326
Parafusos de Máquina de Cabeça Phillips (#10-32)	Ace Hardware		2.5" de comprimento e 3/16" de diâmetro
Arruelas Planas #10	de Máquina ACE Hardware
(#10-32)	Ilhós de Borracha ACE Hardware
	ACE Hardware		5/16", espessura; 5/8", diâmetro do furo; 1.125", tubulação
de polietileno OD (5/16"; OD, 3/16"; ID)	ACE Hardware		Corte para 1.8" de comprimento
Arruela de Travamento #10	ACE Hardware
Furadeira, 5 velocidades	Ace Hardware	ProTech Modelo 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes	VWR	62407-076
Brocas, 3 mm, 6 mm e 15 mm	Ace Hardware	Diablo freud marca	Brocas para corte de plástico.
Brocas para madeira, 1,5 cm e 1 mm	Ace Hardware
Lima de madeira, clipes de mola Ace Harware
", suporte de pressão de 16 mm	Ferramenta
, 5"	Ace Hardware	26307
Folha de Silicone Adesivo (Selo Seguro)	Grace Bio-Labs	666581	0,5 mm de espessura
6 mm	Furador Office Max
12 mm	thepunchbunch.com
70% de etanol
Lamínulas fototecizadas, diâmetro de 12 mm	Bellco Glass, Inc.	1916-91012
Bico de Bunsen
Etanol Absoluto
Água Nanopura
	Sigma-Aldrich	A3648
Acetona	Sigma-Aldrich	179124
#5 Dumont Fórceps	de Ciência Fina	11251-30
Cortador de Tecidos McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180
Lâminas de barbear de dupla borda	Ted Pella, Inc.	121-6
Papel de filtro Whatman	VWR	28450-182	Cortado em círculos de 5,8 cm de diâmetro
Policloro-trifluoroetileno (Aclar)	Ted Pella, Inc.	10501-10	Corte em círculos de 5,8 cm de diâmetro
#21 Lâmina Cirúrgica	VWR Scientific	25860-144
#5 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Espátula, inoxidável com extremidade cônica	VWR	82027-518
Solução Salina Balanceada Gey's	Sigma-Aldrich	G9779
Glicose	ThermoFisher Scientific	15023-021	Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado
Plasma de frango	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	Reidrate em água estéril, centrifugue a 2500 x g 30 min a 4 ° C, congelamento rápido alíquotas em nitrogênio líquido e armazenamento em  -80 °C.
Trombina tópica (bovina)	Pfizer	Trombina-JMI	Alíquotas de congelamento rápido em nitrogênio líquido a 1.000 unidades internacionais / mL em diluente fornecido e armazenar a -80 ° C. Use a 250 unidades/mL.
Sistema de Rolos Celulares	Bellco Biotech	SciERA
Incubadora	de Rolos	Modelo Forma 3956
N21-MAX	ThermoFisher Scientific	AR008
Caneta/Strep (100X)	ThermoFisher Scientific	15140122
200 mM Glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081
Glicose	ThermoFisher Scientific	15023-021	Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado
Neurobasal A	ThermoFisher Scientific	10888-022	Meio completo: 48 mL de Neurobasal A, 1 mL de N21-MAX, 0,625 mL de 200 mM de glutamina, 0,180 mL de glicose a 25%, 0,250 mL de caneta / estreptococo 100x.
Embalagem de lentivírus de terceira geração	Life Technologies	K4975-00
159 K filtros centrífugos de corte (Centricon)	lentiviral EMD Millipore
(InFusion)	Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279	Addgene
Corante de viabilidade celular neuronal (NeuO)	Stemcell technologies	1801	Descongele uma vez e congele rapidamente em 4 µ L alíquotas. Armazene a -20 > C
Microscópio invertido	Olympus	IX83
Objetivas de microscópio	Ar Olympus	: 4X, 20; óleo: 40X, 60X,
Sistema confocal de disco giratório	Yokagawa	CSU22
Microscópio EMCCD	Câmera fotométrica	Cascata II
Codificação linear (x,y), piezo z estágio superior plano	ASI
Lasers de microscópio e integração	Intelligent Imaging Innovations
HEK293T células	American Type Culture Collection	CRL-3216
Plasmina humana	Sigma Aldrich	P1867	0,002 U/mL em albumina de soro bovino a 0,1% (filtro de 0,2 mm esterilizado), congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 °C.