Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Summary

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Abstract

Fatias de cérebro de roedor cultivadas são úteis para estudar o comportamento de neurônios e glia em um ambiente que mantém muitas das suas interações normais na vivo celular e molecular. Fatias obtidas a partir de uma variedade de linhas de rato geneticamente modificado ou o uso de vetores virais para expressão de proteínas fluorescente etiquetadas ou repórteres em fatias de cérebro de tipo selvagem permitem imagens de alta resolução por microscopia de fluorescência. Embora vários métodos têm sido desenvolvidos para imagem fatias do cérebro, combinando cultura fatia com a capacidade de realizar imagens de alta resolução repetitiva de células específicas em fatias ao vivo durante longos períodos de tempo tem colocado problemas. Isto é especialmente verdadeiro quando os vetores virais são utilizados para a expressão de proteínas exógenas desde que isto é feito melhor em um sistema fechado para proteger os usuários e evitar a contaminação cruzada. Simples modificações feitas ao método de cultura rolo tubo cérebro fatia que permitem imagens de alta resolução repetitiva de fatias durante muitas semanas em um sistema fechado são relatadas. Cultivo de fatias em photoetched lamelas permite o uso de marcas fiduciais rapidamente e precisamente reposicionar o palco para o campo idêntico de imagem ao longo do tempo, antes e depois de tratamentos diferentes. Exemplos são mostrados para o uso desse método combinado com coloração neuronal específica e expressão para observar alterações em fatias hippocampal arquitetura, expressão neuronal mediada por viral de proteínas fluorescentes e o desenvolvimento de patologia cofilin, que anteriormente foi observada no hipocampo de doença de Alzheimer (AD) em resposta ao tratamento da fatia com oligômeros de peptídeo de amiloide-β (Aβ).

Introduction

Cultura primária de neurônios dissociadas de regiões do cérebro de roedor é uma importante ferramenta usada por pesquisadores para observar respostas para patologicamente implicado estímulos. No entanto, tais estudos têm a desvantagem de olhar para os neurônios em 2D única e sem seu sistema de apoio a glia. Além disso, a não ser crescidas sob condições de muito alta densidade (640 neurônios/mm² ou cerca de 16% da superfície), no qual ele torna-se impossível acompanhar a consequência aleatória de um dendrito ou axônio para mais do que uma curta distância do corpo celular, hipocampo viabilidade neuronal durante 4 semanas diminui significativamente

Protocol

Uso de animais segue reprodutores aprovados e protocolos de uso de animais que se conformam ao cuidado Animal e usar as diretrizes da Colorado State University.

Nota: O protocolo abaixo descreve o método de preparação e cultura para a incubação a longo prazo e intermitente de imagem de fatias hippocampal. Uma única fatia hippocampal é anexada a uma lamela de photoetched especialmente preparado usando um coágulo de plasma, e em seguida as lamelas são seladas com o lado liso de um tubo perfurado-fora do rolo, que é mantido em uma incubadora de rolo. Coágulos de plasma são dissolvidos com plasmina antes da infecção viral para a expressão da pr....

Results

Para determinar exatamente como marcas fiduciais podem ser utilizadas para recriar as mesmas células dentro das mesmas áreas ao longo do tempo, nós examinamos fatias cultivadas em photoetched lamelas (Figura 6A). Os neurônios foram visualizados por coloração com um corante vital (100 nM para 2h; não mancha células não-neuronais), que desaparece de neurônios ao longo do tempo, sem prejudicar as células²⁵. Nós identifica.......

Discussion

Método do tubo do rolo aqui descrito permite cultivo a longo prazo e de alta resolução de imagem ao vivo do tecido cerebral em fatias. Um grande problema com a técnica de fatia como aplicado aqui é na montagem e manutenção de fatias. Revestimentos de lamela que oferecem suporte a adesão de fatia, promover fatia desbaste, aumentando a consequência natural de neuritos e migração de células fora da fatia; assim, evitamos o uso destes substratos. A inserção de grupos aminoácidos para o vidro por tratamento com 3-aminopropylt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fundos de pratos de cultura de 15 cm	VWR Scientific	25384-326
Parafusos de Máquina de Cabeça Phillips (#10-32)	Ace Hardware		2.5" de comprimento e 3/16" de diâmetro
Arruelas Planas #10	de Máquina ACE Hardware
(#10-32)	Ilhós de Borracha ACE Hardware
	ACE Hardware		5/16", espessura; 5/8", diâmetro do furo; 1.125", tubulação
de polietileno OD (5/16"; OD, 3/16"; ID)	ACE Hardware		Corte para 1.8" de comprimento
Arruela de Travamento #10	ACE Hardware
Furadeira, 5 velocidades	Ace Hardware	ProTech Modelo 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes	VWR	62407-076
Brocas, 3 mm, 6 mm e 15 mm	Ace Hardware	Diablo freud marca	Brocas para corte de plástico.
Brocas para madeira, 1,5 cm e 1 mm	Ace Hardware
Lima de madeira, clipes de mola Ace Harware
", suporte de pressão de 16 mm	Ferramenta
, 5"	Ace Hardware	26307
Folha de Silicone Adesivo (Selo Seguro)	Grace Bio-Labs	666581	0,5 mm de espessura
6 mm	Furador Office Max
12 mm	thepunchbunch.com
70% de etanol
Lamínulas fototecizadas, diâmetro de 12 mm	Bellco Glass, Inc.	1916-91012
Bico de Bunsen
Etanol Absoluto
Água Nanopura
	Sigma-Aldrich	A3648
Acetona	Sigma-Aldrich	179124
#5 Dumont Fórceps	de Ciência Fina	11251-30
Cortador de Tecidos McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180
Lâminas de barbear de dupla borda	Ted Pella, Inc.	121-6
Papel de filtro Whatman	VWR	28450-182	Cortado em círculos de 5,8 cm de diâmetro
Policloro-trifluoroetileno (Aclar)	Ted Pella, Inc.	10501-10	Corte em círculos de 5,8 cm de diâmetro
#21 Lâmina Cirúrgica	VWR Scientific	25860-144
#5 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Espátula, inoxidável com extremidade cônica	VWR	82027-518
Solução Salina Balanceada Gey's	Sigma-Aldrich	G9779
Glicose	ThermoFisher Scientific	15023-021	Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado
Plasma de frango	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	Reidrate em água estéril, centrifugue a 2500 x g 30 min a 4 ° C, congelamento rápido alíquotas em nitrogênio líquido e armazenamento em  -80 °C.
Trombina tópica (bovina)	Pfizer	Trombina-JMI	Alíquotas de congelamento rápido em nitrogênio líquido a 1.000 unidades internacionais / mL em diluente fornecido e armazenar a -80 ° C. Use a 250 unidades/mL.
Sistema de Rolos Celulares	Bellco Biotech	SciERA
Incubadora	de Rolos	Modelo Forma 3956
N21-MAX	ThermoFisher Scientific	AR008
Caneta/Strep (100X)	ThermoFisher Scientific	15140122
200 mM Glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081
Glicose	ThermoFisher Scientific	15023-021	Solução de 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado
Neurobasal A	ThermoFisher Scientific	10888-022	Meio completo: 48 mL de Neurobasal A, 1 mL de N21-MAX, 0,625 mL de 200 mM de glutamina, 0,180 mL de glicose a 25%, 0,250 mL de caneta / estreptococo 100x.
Embalagem de lentivírus de terceira geração	Life Technologies	K4975-00
159 K filtros centrífugos de corte (Centricon)	lentiviral EMD Millipore
(InFusion)	Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279	Addgene
Corante de viabilidade celular neuronal (NeuO)	Stemcell technologies	1801	Descongele uma vez e congele rapidamente em 4 µ L alíquotas. Armazene a -20 > C
Microscópio invertido	Olympus	IX83
Objetivas de microscópio	Ar Olympus	: 4X, 20; óleo: 40X, 60X,
Sistema confocal de disco giratório	Yokagawa	CSU22
Microscópio EMCCD	Câmera fotométrica	Cascata II
Codificação linear (x,y), piezo z estágio superior plano	ASI
Lasers de microscópio e integração	Intelligent Imaging Innovations
HEK293T células	American Type Culture Collection	CRL-3216
Plasmina humana	Sigma Aldrich	P1867	0,002 U/mL em albumina de soro bovino a 0,1% (filtro de 0,2 mm esterilizado), congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 °C.