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Artigo de método

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

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⸱

DOI:

10.3791/56441

⸱

12 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Resumo

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Introdução

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões1e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um "abominável mistério" por Charles Darwin2. Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares7. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente8 , 9 , 10.

Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência11. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos7. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,12 , 13. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis7,16,17.

Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo21, pacto-PARS-aros22) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo23 e PRESTO ACT24). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.

Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.

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Protocolo

1. a flor e a fixação de síliqua

  1. Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores.
    Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrientes em vasos mantidos sob as mesmas condições (Figura 1). O número de repetições varia de acordo com o objetivo específico de investigação, mas é recomendado um mínimo de 5 inflorescências (a partir de 5 plantas individuais) para cada tratamento. Se as flores são a unidade experimental, é recomendado um mínimo de 10 flores por replicar.
  2. Cortar as inflorescências ou flores (Figura 1E-H), usando uma tesoura pequena (por exemplo, tesoura de unha) e colocá-los imediatamente em um tubo de microcentrifugadora (para fixação única inflorescência/flor) ou um tubo cónico (para fixações coletivas) contendo recém feita do Carnoy, metanol/ácido acético ácido ou fixadores de FPA50 (dependendo da aplicação, veja abaixo) no gelo.
    Nota: As amostras devem estar completamente mergulhadas no fixador.
  3. Deixe o tecido dentro do fixador para 4h durante a noite a 4 ° C.
    Nota: Infiltração de vácuo pode ser usada para acelerar a penetração do fixador no tecido, mas isto pode ser prejudicial para a preservação da estrutura do tecido. Os autores não implementar a infiltração de vácuo.
  4. Retire o fixador, Adicionar suficiente etanol a 70% para cobrir as amostras e devolvê-los a 4 ° C, durante pelo menos 24 h; as amostras podem ficar indefinidamente nesta solução. Depois de retirar o etanol, dirijam-se para a próxima etapa; dissecação, ou clareira de SDS.

2. dissecação sob o microscópio estereoscópico

  1. Coloque acabadas etanol a 70% em vidro de um fabricante relógio colocado em um pequeno prato de Petri para apoio.
  2. Lugar da inflorescência/flor/síliqua sobre este recém feito fixador e dissecar sob o microscópio estereoscópico usando fórceps e uma seringa com uma agulha.
    1. Use de um criador de relógio vidro ou dispositivo similar que permite que as amostras de estar totalmente coberto com etanol (recomendado) para a dissecação de inflorescências e destruindo os órgãos florais de flores maduras (sépalas, pétalas e estame pode ser dissecado nesta fase ) para evitar o risco de secagem de amostras.
  3. Disse siliques e pequenos botões de flores em um slide, conforme descrito abaixo.
    1. Colocar o vidro do relógio da sua cafeteira com amostras pre-processed de lado e usar um slide normal para a última dissecção.
    2. Mover a amostra de interesse para o slide e adicionar 10 µ l de etanol a 70% fresco. Trabalhar rapidamente a última dissecção e adicionar 10 µ l de etanol, se necessário, para manter a amostra húmida sem líquido excessivo.
    3. Para liberar os grãos de pólen de estames, consulte Etapa 5.1. Para dissecação carpelos e óvulos, siga o procedimento descrito na Figura 2. Este procedimento aplica-se a todas as fases de desenvolvimento do carpelo, incluindo o estágio de desenvolvimento do siliques verdes.
      Nota: Não adicionar etanol se houver suficiente ao reporte de etanol de mover as amostras; dissecar as amostras muito pequenas é muito mais fácil em uma quantidade mínima de líquido. Sempre manter apenas os órgãos de interesse (sépalas, pétalas, estames, carpelos, óvulos, as sementes ou grãos de pólen) no slide. Esse procedimento irá assegurar uma espessura uniforme entre a lâmina e lamela, correspondente à espessura do órgão sob exame, resultando em uma maior homogeneidade e, portanto, a eficiência de exames microscópicos (maior número de espécimes de alvo no mesmo plano focal).
  4. Use um pequeno pedaço de papel mata-borrão para absorver e remover tanto etanol quanto possível. Rapidamente, prossiga para a etapa seguinte (seção 3, 4 ou 6) antes da amostra seca para fora.

3. com base em hidrato de cloral compensação e compensação combinada de coloração

Nota: Os melhores resultados para a compensação baseada em hidrato de cloral são obtidos com FPA50 fixada de material.

  1. Lugar de 20 µ l de solução de compensação (hidrato de cloral/glicerol, modificado médio do Hoyer, 4½ do Herr ou soluções de IKI-4½ do Herr) no slide espécime-rolamento. Usando um par de seringas com agulhas hypodermal, posicione os espécimes conforme necessário, reduzindo o espaço entre eles e lançando aqueles onde o órgão de interesse virado para baixo. Remova qualquer bolha de ar restante, usando a agulha.
  2. Baixe uma lamela lateralmente gentilmente colocá-lo, pressionando suavemente e esperar até que a solução de limpeza preenche o espaço entre. Adicione solução de compensação mínima, se necessário, para preencher todo o espaço sob a lamínula.
  3. Coloque o slide sobre um suporte de corrediça e deixá-lo sob a coifa. Proceda às observações microscópicas após pelo menos 4 h e durante 4 a 5 dias seguintes.

4. combinado Alexander manchando e Herr 4½ clareira de anteras

Nota: O protocolo original de Alexander baseia-se em liberar os grãos de pólen no slide antes de coloração. Uma eficiente e mais informativo, modificado Alexander manchando e procedimento de compensação são a coloração dos grãos de pólen maduros dentro de anteras maduras mas não-deiscente.

  1. Escolha os botões de flores recém-colhidas que estão prestes a abrir com anteras não-deiscente.
    Nota: Não tome mais novos botões de flores porque Alexander coloração destina-se a grãos de pólen maduros e não mancha eficientemente imaturos grãos de pólen. É recomendado um mínimo de 5 flores por tratamento de inflorescências e plantas diferentes colhidas.
  2. Prepare uma placa de 96 poços com solução de Alexander suficiente para submergir uma flor em botão. Expor as anteras, removendo as sépalas e pétalas e mergulhe-os em solução de Alexander. Mantenha as amostras sob a coifa para 1 a 3 h.
  3. Substitua a solução de Alexander 4½ solução do Herr e coloque a placa de multi bem sob a coifa para uma incubação durante a noite.
  4. Usando fórceps, mova os botões da flor apurados para um novo slide. Uma vez que pode ocorrer algum reporte solução de Alexandre, use um toalhete de papel para remover tanto clareira solução possível.
  5. Dissecar os estames e remover todos os outros tecidos. Siga as etapas na seção 3, usando solução de 4½ do Herr.

5. remover o Exine de grãos de pólen

Nota: Recomendamos o uso de fixador do Carnoy para coloração de DAPI.

  1. Siga os procedimentos de fixação e dissecação descritos nas seções 1 e 2. Até agora, um deve ter um para muitos estames no slide dentro de uma quantidade mínima de etanol a 70%.
  2. Use um papel mata-borrão para remover o excesso etanol e adicionar 5-10 µ l da solução DAPI. Usando um par de seringas com agulhas, libere os grãos de pólen dentro essa pequena quantidade de solução (por exemplo, usar uma seringa para imobilizar o estame e o outro para liberar os grãos de pólen). Adicione outro 5 µ l de DAPI se a solução secar.
  3. Remover todos os detritos do estame é uma etapa crítica, tal que somente os grãos de pólen são deixados entre a lâmina e a lamela.
  4. Local uma lamela sobre a corrediça do espécime-rolamento de abaixá-la para o lado e adicionar a quantidade mínima de solução DAPI necessária para preencher o espaço. Coloque um dedo sobre a lamela, e sem pisar na também muito fazer uma rápida, firme e curta o movimento de deslizamento.
    Nota: Para medir a força necessária e a amplitude do movimento deslizante, esta etapa deve ser praticada várias vezes, verificar os resultados de cada vez ao microscópio.
  5. Adicionar a solução DAPI se necessário e melhorar o lugar que o slide em uma caixa úmido no escuro a 4 ° C por 15 min a 1 h. seguir para observar amostras sob campo amplo fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h. Tente combinar este procedimento com SDS de compensação para verificar se ainda mais mentos podem ser obtidos.

6. sódio Dodecil sulfato (SDS) de compensação

Nota: Dependendo do órgão floral para ser analisado e em habilidades do pesquisador para dissecar espécimes muito macias e pequenas, o tratamento de SDS pode ser realizado antes (por pesquisadores experientes) ou após a dissecação passo (para menos experientes pesquisadores) em metanol-ácido acético fixada material.

  1. Use o vidro de um fabricante relógio, uma lâmina côncava ou um tubo de microcentrifugadora para incubar amostras dissecadas ou não-dissecado em SDS 1% e 0,2 N NaOH solução durante a noite em temperatura ambiente.
  2. Manuseie com cuidado porque a amostra é muito macia e tem uma aparência transparente. Enxágue várias vezes com água.
    Nota: Os restos da solução SDS podem levar a precipitação ao adicionar a solução de coloração, por exemplo, anilina azul.
  3. Para as amostras não-dissecado, siga o procedimento de dissecação descrito na secção 2, usando a água em vez de etanol a 70%. Depois de dissecar o tecido desejado, remover todos os restos e detritos e qualquer excesso de água com um toalhete de papel, em seguida, adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração e proceder com passo 6.5.
  4. Para amostras dissecadas, cuidadosamente mover a amostra a partir da solução de lavagem e colocá-lo numa lâmina limpa e adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração.
  5. Coloque delicadamente uma lamela no slide por abaixá-la para o lado. Tome cuidado para não esmagar a preparação. Se o tecido estiver muito mole, lugar nenhum fina separador em entre a lâmina e lamela em seus cantos (por exemplo, fita ou uma lamela quebrada), deixando um espaço de câmara, como entre lâmina e lamela, tal que o lamela não esmaga a amostra.
  6. Coloque todos os slides dentro de uma caixa úmida, cubra com papel alumínio e coloque-a 4 ° C, durante pelo menos 1 h. seguir para observar a amostra usando widefield fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h.

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Resultados

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos25,26...

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Discussão

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a floração é s...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique, um IEF Marie Curie Grant (conceder n. TransEpigen-254797 de A.H.), um avançado Grant do Conselho Europeu de investigação (conceder n. Medea-250358 de U.G.) e um projeto de pesquisa e desenvolvimento tecnológico (grant MecanX de U.G.) de SystemsX.ch, a iniciativa Suíça em biologia de sistemas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes e Materiais
EtanolScharlauET00102500
Ácido AcéticoApplichemA3686,2500100% Grau de Biologia
Molecular Ácido AcéticoGlacial Sigma-Aldrich320099Grau de Biologia Molecular
MetanolScharlau ME03062500
Solução de formaldeídoSigma-AldrichF1635
Ácido propiônicoSigma-Aldrich81910-250 ml
Hidrato de cloralSigma-Aldrich15307
GlicerolRoth3783.1
Goma arábicaFluka51198
Ácido lácticoFluka69773
FenolSigma-Aldrich77607-250MLUsamos fenol líquido (use a densidade para encontrar o volume necessário para sua solução)
Óleo de cravoSigma-AldrichC8392-100ML
XilenoRoth4436.1
IodoFluka57665
Iodeto de potássioMerck5043
Malaquita VerdeFluka63160
Ácido fucsinaFluka84600
Laranja GSigma7252
Dodecil Sulfato de SódioSigma-AldrichL3771Hidróxido
de SódioSigma-Aldrich71690
Di-Hidrogenofosfato de SódioApplichemA1047,1000
Fosfato de Sódio dibásicoSigma-AldrichS9763-1KG
Fosfato de potássioSigma-Aldrich04347
EDTAApplichemA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259Branqueador fluorescente 28
AuraminaChroma10120
DAPISigmaD9542tóxico
Triton-X-100SigmaT8787
Anilina azulMerck1275
MS médioCarolina19-57030
Substrato rico em nutrientesEinheitserdeED73
VidroSem marca específica
Tubos de centrífuga de falcão de 15 mlVWR62406-200
Pinça DumondActimed0208-5SPSF-PS
FórcepsDUMONT BIOLOGY0108-5
SeringaBDBD Plastipak 3000131 ml
Agulha de preparaçãoBDBD Microlance 304000
Lâminas de microscópioThermo Scientific10143562CEbordas
cortadas LamínulasThermo ScientificDV40008
CaixaUma caixa de plástico com papel toalha úmido e suportes de slides dentro
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soluções<
forte>Fixadores
de Carnoy (Farmer's)Etanol absoluto: ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml)
Metanol/fixador50 % (v/v) de metanol, 10 % (v/v) de ácido acético glacial em água desionizada
FixadorFormina, ácido propiónico, etanol a 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Soluções de limpeza
Hidrato de cloral/glicerolHidrato de cloral : glicerol : água, 8:1:2 (g:ml:ml). Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a
Arábica Modificadaformalina 7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, água 30 ml. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é o FPA50
Herr's 4½Ácido lático, hidrato de cloral, cristais de fenol, óleo de cravo, xileno; 2:2:2:2:1, em peso. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor (especialmente para o desenvolvimento do estame) e para o desenvolvimento do silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a
SDS / NaOHDilua a SDS e a solução estoque de NaOH a 1% de SDS / 0,2 N NaOH (diluição de 10x). Para todas as fases de desenvolvimento da flor e da sílica. O melhor fixador é o fixador metano/ácido acético; Os outros dois fixadores também podem ser usados. Pode ser combinado com calcofluor, auramina, DAPI e solução de coloração azul de anilina.
SDS solução-mãe10 % (m/v) de dodecilo sulfato de sódio. Dissolver 10 g de dodecil sulfato de sódio em 80 ml de água desionizada e completar o volume com água desionizada até 100 ml.
Solução-mãeSolução de NaOH 2 N: dissolver 4 g de NaOH em 40 ml de água desionizada e completar o volume de 100 ml com água
soluções combinadas de limpeza e coloração deionizadas
Herr's IKI-4½Para um padrão 4½ (9 g no total) adicionar: 100 mg de iodo, 500 mg de iodeto de potássio. Esta solução de limpeza pode ser usada para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da sílica, seja para aumentar o contraste ou para caracterizar a dinâmica do amido. Use FPA50 para análise estrutural e fixador de Carnoy para análise quantitativa de amido.
ColoraçãoEtanol 95% 10ml, verde malaquita (1% em 95% EtOH) 1 ml, ácido fucsina (1% em ddH2O) 5ml, laranja G (1% em ddH2O) 0,5ml, fenol 5g, hidrato de cloral 5g, ácido acético glacial 2ml, glicerol 25ml . Esta limpeza/coloração sozinha ou em combinação com o 4½ de Herr; solução pode ser usada para avaliar o aborto de pólen em flores com grãos de pólen maduros e tricelulares. É usado em material não fixo recém-cortado.
Soluções de coloração
forteCalcofluorCalcofluor 0,007% em água (g:ml). Originalmente usado como um branqueador óptico. Pode ser usado para corar celulose, polissacarídeos carboxilados e calose nas paredes celulares. Freqüentemente usado para manchar a parte interna do grão de pólen. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução.
de auraminaAuramina 0,01% em água (g:ml). Este corante fluorescente lipofílico pode ser usado para colorir cutículas, cutina e exina, entre outros. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução
Calcofluor-Misturaauramina Solução de auramina : Solução de Calcofluor, 3:1. Pode ser usado para uma coloração combinada por ambas as soluções. Outras proporções podem ser testadas mantendo uma proporção menor de calcofluor em relação à auramina.
SoluçãoDAPI 0,4 ug / ml, tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7), 0,1% Triton-X-100, EDTA 1 mM. Esta solução pode ser usada para corar as propagações cromossômicas durante a meiose masculina e feminina e os núcleos celulares de qualquer tecido. Freqüentemente usado para estudar o desenvolvimento do grão de pólen. Carnoy e metanol / ácido acético são os melhores fixadores para esta solução. Fixadores à base de formaldeído, como o FPA50, podem interferir na coloração. Excitação no UV e emissão máxima em torno de 461 nm.
Tampão fosfato de sódio (0,1 M)Receptor de prótons: 0,2 M Na2HPO4, doador de prótons: 0,2 M NaH2PO4, proporção doador de prótons / receptor de prótons: 1,364 (para pH 7)
Solução0,1% (p / v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% de glicerol. Esta solução pode ser usada para corar calose e celulose de vários estágios de desenvolvimento (por exemplo, deposição de calose em terads masculinos e femininos, tampões de calose em tubos polínicos). Excitação no UV e emissão máxima em torno de 455. Também pode ser excitado a 514 nm com emissão no vermelho para coloração do conteúdo celular.
de Grau de Biologia Molecular do relojoeiro úmida Fixador de ácido acético FPA50 Goma Hoyer FPA50 à base de à base de formalina; fluido de limpeza solução FPA50 à base de formalina de NaOH Alexander Solução de DAPI de azul de anilina

Referências

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