Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Resumo

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Resumo

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Introdução

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões¹e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um "abominável mistério" por Charles Darwin². Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores^3,4,5,6....

Protocolo

1. a flor e a fixação de síliqua

1. Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores.
   Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrientes em vasos mantidos sob as mesmas condições (Figura 1). O número de repetições varia de acordo com o objetivo específico de investigaç....

Resultados

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos^25,26.......

Discussão

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a floração é s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes e Materiais
Etanol	Scharlau	ET00102500
Ácido Acético	Applichem	A3686,2500	100% Grau de Biologia
Molecular Ácido Acético	Glacial Sigma-Aldrich	320099	Grau de Biologia Molecular
Metanol	Scharlau ME03062500
Solução de formaldeído	Sigma-Aldrich	F1635
Ácido propiônico	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Hidrato de cloral	Sigma-Aldrich	15307
Glicerol	Roth	3783.1
Goma arábica	Fluka	51198
Ácido láctico	Fluka	69773
Fenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	Usamos fenol líquido (use a densidade para encontrar o volume necessário para sua solução)
Óleo de cravo	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xileno	Roth	4436.1
Iodo	Fluka	57665
Iodeto de potássio	Merck	5043
Malaquita Verde	Fluka	63160
Ácido fucsina	Fluka	84600
Laranja G	Sigma	7252
Dodecil Sulfato de Sódio	Sigma-Aldrich	L3771	Hidróxido
de Sódio	Sigma-Aldrich	71690
Di-Hidrogenofosfato de Sódio	Applichem	A1047,1000
Fosfato de Sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Branqueador fluorescente 28
Auramina	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	tóxico
Triton-X-100	Sigma	T8787
Anilina azul	Merck	1275
MS médio	Carolina	19-57030
Substrato rico em nutrientes	Einheitserde	ED73
Vidro			Sem marca específica
Tubos de centrífuga de falcão de 15 ml	VWR	62406-200
Pinça Dumond	Actimed	0208-5SPSF-PS
Fórceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Seringa	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Agulha de preparação	BD	BD Microlance 304000
Lâminas de microscópio	Thermo Scientific	10143562CE	bordas
cortadas Lamínulas	Thermo Scientific	DV40008
Caixa			Uma caixa de plástico com papel toalha úmido e suportes de slides dentro
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções<
forte>Fixadores
		de Carnoy (Farmer's)	Etanol absoluto: ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml)
Metanol/fixador			50 % (v/v) de metanol, 10 % (v/v) de ácido acético glacial em água desionizada
Fixador			Formina, ácido propiónico, etanol a 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Soluções de limpeza
Hidrato de cloral/glicerol			Hidrato de cloral : glicerol : água, 8:1:2 (g:ml:ml). Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a
		Arábica Modificada	formalina 7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, água 30 ml. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da silique com microscopia DIC. O melhor fixador é o FPA50
Herr's 4½			Ácido lático, hidrato de cloral, cristais de fenol, óleo de cravo, xileno; 2:2:2:2:1, em peso. Pode ser usado para todos os estágios de desenvolvimento da flor (especialmente para o desenvolvimento do estame) e para o desenvolvimento do silique com microscopia DIC. O melhor fixador é a
		SDS / NaOH	Dilua a SDS e a solução estoque de NaOH a 1% de SDS / 0,2 N NaOH (diluição de 10x). Para todas as fases de desenvolvimento da flor e da sílica. O melhor fixador é o fixador metano/ácido acético; Os outros dois fixadores também podem ser usados. Pode ser combinado com calcofluor, auramina, DAPI e solução de coloração azul de anilina.
SDS solução-mãe			10 % (m/v) de dodecilo sulfato de sódio. Dissolver 10 g de dodecil sulfato de sódio em 80 ml de água desionizada e completar o volume com água desionizada até 100 ml.
Solução-mãe			Solução de NaOH 2 N: dissolver 4 g de NaOH em 40 ml de água desionizada e completar o volume de 100 ml com água
soluções combinadas de limpeza e coloração deionizadas
Herr's IKI-4½			Para um padrão 4½ (9 g no total) adicionar: 100 mg de iodo, 500 mg de iodeto de potássio. Esta solução de limpeza pode ser usada para todos os estágios de desenvolvimento da flor e para o desenvolvimento da sílica, seja para aumentar o contraste ou para caracterizar a dinâmica do amido. Use FPA50 para análise estrutural e fixador de Carnoy para análise quantitativa de amido.
Coloração			Etanol 95% 10ml, verde malaquita (1% em 95% EtOH) 1 ml, ácido fucsina (1% em ddH2O) 5ml, laranja G (1% em ddH2O) 0,5ml, fenol 5g, hidrato de cloral 5g, ácido acético glacial 2ml, glicerol 25ml . Esta limpeza/coloração sozinha ou em combinação com o 4½ de Herr; solução pode ser usada para avaliar o aborto de pólen em flores com grãos de pólen maduros e tricelulares. É usado em material não fixo recém-cortado.
Soluções de coloração
forteCalcofluor			Calcofluor 0,007% em água (g:ml). Originalmente usado como um branqueador óptico. Pode ser usado para corar celulose, polissacarídeos carboxilados e calose nas paredes celulares. Freqüentemente usado para manchar a parte interna do grão de pólen. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução.
		de auramina	Auramina 0,01% em água (g:ml). Este corante fluorescente lipofílico pode ser usado para colorir cutículas, cutina e exina, entre outros. Todos os três fixadores podem ser usados com esta solução
Calcofluor-Mistura			auramina Solução de auramina : Solução de Calcofluor, 3:1. Pode ser usado para uma coloração combinada por ambas as soluções. Outras proporções podem ser testadas mantendo uma proporção menor de calcofluor em relação à auramina.
Solução			DAPI 0,4 ug / ml, tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7), 0,1% Triton-X-100, EDTA 1 mM. Esta solução pode ser usada para corar as propagações cromossômicas durante a meiose masculina e feminina e os núcleos celulares de qualquer tecido. Freqüentemente usado para estudar o desenvolvimento do grão de pólen. Carnoy e metanol / ácido acético são os melhores fixadores para esta solução. Fixadores à base de formaldeído, como o FPA50, podem interferir na coloração. Excitação no UV e emissão máxima em torno de 461 nm.
Tampão fosfato de sódio (0,1 M)			Receptor de prótons: 0,2 M Na2HPO4, doador de prótons: 0,2 M NaH2PO4, proporção doador de prótons / receptor de prótons: 1,364 (para pH 7)
Solução			0,1% (p / v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% de glicerol. Esta solução pode ser usada para corar calose e celulose de vários estágios de desenvolvimento (por exemplo, deposição de calose em terads masculinos e femininos, tampões de calose em tubos polínicos). Excitação no UV e emissão máxima em torno de 455. Também pode ser excitado a 514 nm com emissão no vermelho para coloração do conteúdo celular.

de Grau de Biologia Molecular do relojoeiro úmida Fixador de ácido acético FPA50 Goma Hoyer FPA50 à base de à base de formalina; fluido de limpeza solução FPA50 à base de formalina de NaOH Alexander Solução de DAPI de azul de anilina