Artigo de método

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

DOI:

10.3791/56445

⸱

1 de março de 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Resumo

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A extração e a análise dos neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da função do sistema nervoso e doenças relacionadas, mas sua medida precisa ainda é um desafio. Muitos protocolos têm sido descritos para medição do neurotransmissor por uma variedade de instrumentos, incluindo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). No entanto, existem deficiências, tais como a operação complicada ou difícil de detectar alvos múltiplos, que não podem ser evitados, e atualmente, a técnica de análise dominante é ainda HPLC acoplado com sensível eletroquímico ou detecção de fluorimétrica, devido a sua sensibilidade elevada e boa seletividade. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o pré-tratamento e a detecção de catecolaminas com cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) em amostras de urina real dos lactentes, usando electrospun de nanofibras composto composto de éter de coroa poliméricas de poliestireno como adsorvente, também conhecido como o método de extração (PFSPE) embalado-fibra de fase sólida. Mostramos como urina amostras podem ser facilmente precleaned por uma coluna de fase sólida nanofibras-embalados, e como os analitos na amostra podem ser rapidamente enriquecidos, em estudo dessorvida e detectado em um sistema ECD. PFSPE simplifica os procedimentos de pré-tratamento de amostras biológicas, permitindo a diminuição do tempo gasto e redução da perda de alvos.

Em geral, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a extração de fase sólida acoplada a um sistema de HPLC-ECD para determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e dois de seus metabólitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e ácido 3,4-diidroxi-fenilacético (DOPAC)) na urina dos bebês. O protocolo estabelecido foi aplicado para avaliar as diferenças de catecolaminas urinárias e seus metabolitos entre lactentes de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis. Análise comparativa revelou uma diferença significativa entre os dois grupos, indicando que os metabólitos de catecolaminas podem ser um marcador de candidato importante para o diagnóstico precoce dos casos em risco de danos cerebrais em crianças em MHPG urinário.

Introdução

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Os neurotransmissores catecolaminas e seus conteúdos metabolito em fluidos corporais podem afetar a função neural e afetam o equilíbrio dos Estados de estímulo-resposta-à uma extensão grande1. Abnormities pode causar uma variedade de doenças, tais como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e distúrbios neurológicos1,2. A extração e a determinação de catecolaminas em fluidos corporais é significativo para o diagnóstico das doenças relevantes. No entanto, catecolaminas em amostras biológicas existem em baixas concentrações e são facilmente oxidadas. Além disso, eles são muito di....

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Protocolo

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Foi obtido consentimento dos pais, e aprovação do Conselho de revisão institucional foi obtida para o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o código de ética da associação médica mundial (declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. Cuidadores de todos os participantes fornecidos autorização por escrito para serem incluídos no estudo. Aprovação do Comitê de ética do Hospital de Zhongda, afiliado com a Universidade do sudeste, obteve-se também.

1. preparação das soluções necessárias para a extração e a determinação de catecolaminas e colunas

  1. Prepare a coluna PFSPE. Divida 1-2 mg de nanofibras de....

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Resultados

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Este protocolo é um método PFSPE simples e conveniente para pré-tratamento de amostras de urina e enriquecer cinco catecolaminas para a deteção através de um sistema de HPLC-ECD; um diagrama do processo é mostrado na Figura 1. O protocolo inclui principalmente quatro etapas-ativando, carregamento, lavagem e farmacológicos - juntamente com uma pequena quantidade de nanofibras de PCE-PS e um dispositivo simples extração de fase sólida. A morfologia de nanofibra.......

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Discussão

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O método PFSPE proposto neste trabalho pode ser significativo e significativo no que diz respeito a sua rapidez, simplicidade e conveniência. Os adsorventes usados no protocolo são electrospun de nanofibras, que têm altos superfície rácios de área e o volume e adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada. O procedimento só precisa de alguns miligramas de nanofibras e um pequeno volume de solvente eluente e não requer uma etapa de evaporação para concentrar os analitos. Aqui, apresentamos uma visão geral detalha.......

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Divulgações

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Os autores certificam que não há nenhum conflito de interesses com qualquer organização financeira sobre o material discutido neste artigo.

Agradecimentos

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Este estudo foi suportado por nacional Science Foundation da China (No.81172720, n. º 81673230), o programa de investigação Social desenvolvimento de Jiangsu província ciência e departamento de tecnologia (n. º BE2016741), ciência & tecnologia projeto da China a administração geral de supervisão da qualidade, inspeção e quarentena (2015QK055), o programa de abrir projeto de laboratório chave de desenvolvimento infantil e aprendizagem das Ciências do Ministério da educação, Universidade do Sudeste (CDLS-2016-04). Sinceramente, reconhecemos canção Yuan e Ping Liu, que nos ajudaram na recolha de amostras.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
200 µ Lpara conter nanofibras
Material de nanofibrasextração PFSPE
(cerca de 0,5 mm de diâmetro)encha as nanofibras na seringa
de plástico à prova de gás da coluna (5 ml)comprima a solução na extremidade da ponta
metanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
éster 2-aminoetílico do ácido difenilborínico (DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408reagente complexo
norepinefrina (NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analito
3-metoxi-4-hidroxifenilglicol (MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analito
epinefrina (E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analito
3, 4- Ácido dihidroxifenilacético (DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analito
dopamina (DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analito
3, bromidrato de 4-dihidroxibenzilamina (DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781rótulo interior
acetonitrilaSigma-Aldrich.Inc75-05-8ácido
fosfórico de fase eluriante e móvelSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2
ácido úricoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2creatinina artificial na urina
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5
citrato trissódicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3urina artificial
KClSinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd7447-40-7urina artificial
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9urina artificial
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326urina artificial
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0urina artificial
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6
hidrogenofosfato dissódicona urina Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4urina artificial
naSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6urina artificial
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5urina artificial
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artificial urina
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8urina artificial
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0urina artificial
ácido cítricoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9urina artificial e fase móvel
EDTA sal dissódicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6fase móvel
ortofosfato de sódio monometálicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7urina artificial e fase móvel
1-heptanossulfônico sal de sódioSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6
hidróxido de sódioSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2
ácido fenilborônico de fase móvel (coluna PBA)Aglilent12102018extração de PBA
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Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H.

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Catecholamine NeurotransmittersHigh Pressure Liquid ChromatographyElectrochemical DetectionSolid Phase ExtractionPacked Fiber Solid Phase ExtractionUrine Sample AnalysisNanofiber AdsorbentMonoamine MetabolitesInfant Urine TestingHPLC ECD System

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