Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Evan Bardot; Nikos Tzavaras; Deanna L. Benson; Nicole C. Dubois

doi:10.3791/56446

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Artigo de método

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

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DOI:

10.3791/56446

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12 de outubro de 2017

Evan Bardot¹^,²^,³ , Nikos Tzavaras⁴ , Deanna L. Benson⁵^,⁶ , Nicole C. Dubois¹^,²^,³

¹Cell, Developmental, and Regenerative Biology Department, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ³Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁴Microscopy Core, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁵Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁶Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Resumo

O uso de técnicas de imagem já avançando contribuiu largamente para nossa maior compreensão do desenvolvimento embrionário. Organogênese e desenvolvimento pré-implantação são duas áreas de investigação que se beneficiaram enormemente destes avanços, devido à alta qualidade dos dados que podem ser obtidos diretamente a partir de imagens de pré-implantação embriões ou ex vivo de órgãos. Enquanto os embriões pré-implantação produziram dados com especialmente alta resolução espacial, estágios posteriores foram menos passíveis de reconstrução tridimensional. Obtenção de dados de alta qualidade 3D ou volumétricos para estruturas embrionárias conhecidas em combinação com mapeamento de destino ou rastreamento de linhagem genética permitirá uma análise mais abrangente dos acontecimentos morfogenéticas ocorrendo durante a embriogênese.

Este protocolo descreve uma abordagem de imunofluorescência toda a montagem que permite a rotulagem, visualização e quantificação de populações de células progenitoras dentro o desenvolvimento crescente cardíaca, uma chave estrutura formada durante o desenvolvimento do coração. A abordagem é projetada de tal forma que ambas as informações de nível de células e tecidos podem ser obtidos. Utilizando microscopia confocal e processamento de imagem, este protocolo permite a reconstrução espacial tridimensional do crescente cardíaca, proporcionando assim a capacidade de analisar a localização e organização das populações específicas progenitor durante nesta fase crítica do desenvolvimento do coração. Importante, o uso de anticorpos de referência permite sucessivo mascaramento do crescente cardíaca e subsequentes medições quantitativas das áreas dentro do crescente. Este protocolo permitirá não só um exame detalhado do desenvolvimento inicial do coração, mas com adaptações deverá ser aplicável à maioria dos sistemas de órgãos na gástrula de embrião somite palco do mouse.

Introdução

O estudo da organogênese tem tempo baseou-se na observação de eventos morfogenéticas no desenvolvimento do embrião. Esses estudos dependem frequentemente o uso de corantes fluorescentes ou repórteres de rastreamento linhagem em combinação com rotulagem das populações de referência definido. ¹ , comparando a posição relativa desses rótulos, informações podem ser recolhidas na origem, movimento ou derradeira contribuição de uma população de interesse. Transplante e experimentos de mapeamento de destino usam Marcos morfológicos ou injeção de corantes em non-motile linhagens para definir o ponto de partida das células de interesse, que são então ex....