Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Resumo

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Resumo

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

Introdução

O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra¹. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio². Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-li....

Protocolo

1. preparar reagentes

1. 1X PBS
   1. diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH ₂ O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente.
2. Solução de lise (LS)
   1. preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH ₂ O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Laurilsulfato de sódio 1% e 1% Triton X-100 e ajustar o volume final de 1.000 mL. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
3. <....

Resultados

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2).

Discussão

O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um "padrão ouro" em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização¹³, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese única célula,.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
10x PBS (Ca++, Mg++ livre)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Lauril sarcosinato de sódio	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Acetato de sódio	Sigma	32318
Ácido acético glacial	Sigma	695092
Acetato de amônio	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low ponto de fusão agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% etanol	WARNER-GRAHAM#	64-17-5
Tripsina	GIBICO	25300-054
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
ConsumíveisLâminas de
tecido de vidro	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Tubos de Microcentrífuga	DENVILLE
Pontas de Pipeta	SHARP
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamentos
Microondas	Avanti
Banho-maria	PRECISION
Câmara de eletroforese horizontal	TREVIGEN	Cometassay ES II
Fonte de alimentação	Incubadora Bio-Rad
	Quincy Lab	Modelo 12-140E
Microscópio fluorescente	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf