Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

Summary

O objetivo do método apresentado aqui é explorar a agregação da proteína durante o envelhecimento normal no organismo modelo c. elegans. O protocolo representa uma poderosa ferramenta para estudar os agregados grandes altamente insolúveis que formam com a idade e para determinar como as alterações em proteostasis impactam agregação da proteína.

Abstract

Nas últimas décadas, a prevalência de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD), tem crescido. Estas desordens associadas idade caracterizam-se pelo aparecimento de agregados de proteínas com estrutura fibrilar nos cérebros destes pacientes. Exatamente por isso que as proteínas solúveis normalmente passam por um processo de agregação continua a ser mal compreendido. A descoberta de que a agregação da proteína não está limitada a processos da doença e em vez disso, parte do processo normal de envelhecimento permite o estudo dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a agregação da proteína, sem usar ectopically expressa humana proteínas associadas a doença. Aqui descrevemos as metodologias para examinar a agregação da proteína inerente em elegans de Caenorhabditis através de abordagens complementares. Primeiro, nós examinamos como crescer um grande número de idade-sincronizado c. elegans para obter animais envelhecidos e apresentamos os procedimentos bioquímicos para isolar altamente insolúvel-grandes agregados. Em combinação com um nocaute alvo genético, é possível dissecar o papel de um gene de interesse em promover ou impedindo a agregação de idade-dependente da proteína usando qualquer uma análise abrangente com espectrometria de massa quantitativa ou uma análise baseada em candidato com anticorpos. Esses achados são então confirmados por análise na vivo com animais transgénicos expressando proteínas propensas a agregação fluorescente-etiquetadas. Esses métodos devem ajudar a esclarecer por que certas proteínas são propensas a agregação com a idade e, finalmente, como manter estas proteínas totalmente funcional.

Introduction

Enrolamento de proteínas e agregação são reconhecidos como uma marca registrada de várias doenças neurodegenerativas, como AD, PD, esclerose lateral amiotrófica (ela), demência frontotemporal (FTD) e muitos outros. Por exemplo, α-synuclein assemblies para amiloides que se acumulam como corpos de Lewy, particularmente na substância negra de pacientes com DP, enquanto no ALS pacientes TDP-43 ou FUS misfold para agregados citoplasmática de formulário na degeneração de neurônios motores. Cada uma destas perturbações neurodegenerativas, mecanismos de manutenção da homeostase de proteína ou proteostasis falham em evitar a acumulação de misfolded proteínas, consequentemente ....

Protocol

Nota: Para um melhor entendimento do processo, é anexado um esquema de fluxo de trabalho (Figura 1).

1. o crescimento de grandes números de Young e envelhecido c. elegans submetido a RNAi visando um Gene de interesse

Nota: Uso de c. elegans induzida por temperatura estéril gon-2(q388) os mutantes (CF2253) para obter grandes populações de idosos-sincronizado. Durante todas as etapas, é importante para trabalhar em condições semi estéreis com uma chama aberta e verifique se não há contaminações (por exemplo, com fungos ou bactérias) estão presentes. Execute as ....

Results

Usamos os métodos apresentados aqui para avaliar como long-lived animais com IIS reduzidas modulam a agregação da proteína idade-dependente. Por Western borrão (consulte a etapa 2.2, rápida extração da proteína insolúvel para análise ocidental do borrão), analisamos o total e o conteúdo de proteína insolúvel de young (dia 3 de idade adulta) e envelhecido vermes (dia 18 de idade adulta) em controle de RNAi e RNAi visando a insulina / Receptores de IGF-1-como daf-2. Observamos que .......

Discussion

Aqui nós relatamos uma metodologia para isolar agregados de proteínas altamente insolúveis do envelhecimento c. elegans submetidos a RNAi para análise por espectrometria de massa e mancha ocidental. Nós mostramos que melhorar proteostasis, reduzindo grandemente o IIS impede a agregação da proteína idade-dependente. Selecionando a proteínas específicas de agregação-propenso a overexpress em c. elegans, é possível dissecar ainda mais os mecanismos de agregação de proteínas inerente de modulação.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frasco de cultura Fernbach	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacidade 2.800 ml, com 3 reentrâncias de defletor
Tampa de Rosca de Membrana	Misturador	1088655	GL45
	VWR	444-0148
Funil Separatório	Nalgene	4300-1000	Capacidade 1.000 ml
Seringa de 1 ml	BD Plastipak	300013
Agulha cinza, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Filtros de membrana 0,025 µ Tira	M Millipore	VSWP04700
	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Inibidor de Protease Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini comprimidos sem EDTA
Octoxinol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
Ácido 4-morfolineetanossulfônico (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonilfenilpolietilenoglicol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinante, solução de
RNase livre de RNase	Promega	A7973
Coloração total de manchas de proteína	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby mancha de proteína Coloração
total de gel de proteína	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby gel de proteína mancha
TCEP (tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina)	Serva	36970
Iodoacetamida	Serva	26710
Amôniobicarbonato	Sigma-Aldrich	09830
Tripsina modificada de grau sequencial	Promega	V5111
Etiquetas isobáricas para quantificação relativa e absoluta	Sciex	4352135	iTRAQ Reagentes Kit Multiplex
Centrífuga Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrífuga Optima Max-XP	393315		Beckmann Coulter
5424R	Eppendorf
Centrífuga 5404000413 5702	Eppendorf	5702000329
Centrífuga Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrador Plus	Eppendorf	5305000304	Evaporador Centrífugo
Microscópio estereoscópico fluorescente M165 FC	Leica		com Planapo 2.0x microscópio de
dissecção	Leica		Leica S6E
Microscópio de alta ampliação Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		com objetiva PlanAPOCHROMAT 20x e Zeiss Axio Cam MRm
Software
imagem	ImageJ
Análise de dados de espectrometria de massa	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli cepa
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutantes
CF2253	CGC, nome da cepa: EJ1158		Genótipo: gon-2(q388)
C. elegans transgênicos
DCD214	Laboratório de Della David na DZNE Tü gengen		Genótipo: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Laboratório de Della David em DZNE Tü genótipo bingen		: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]