Method Article

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

DOI:

10.3791/56476

⸱

September 4th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Lab of Cardiovascular Signaling, Centenary Institute, 2Faculty of Medicine, Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.

Abstract

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Mutações no CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformação cavernosa cerebral (CCM) em seres humanos. Modelos do rato da doença CCM foram estabelecidos pela exclusão de tamoxifeno induzido de Ccm genes em animais pós-natal. Esses modelos de rato fornecem ferramentas de valor inestimáveis para investigar o mecanismo molecular e abordagens terapêuticas para a doença CCM. Um método exato e quantitativo para avaliar a progressão e o fardo da lesão é essencial para aproveitar o valor total desses modelos animais. Aqui, demonstramos a indução da doença do CCM em um modelo do rato e o uso do contraste melhorado método de (micro-CT) radiografia computadorizada micro medida CCM encargo de lesão no cérebro de rato. No dia pós-natal 1 (P1), usamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para ativar a atividade de recombinase Cre do transgene de Cdh5-CreErt2 para decompor o alelo floxed de Ccm2. Lesões do CCM em cérebro de rato foram analisadas em P8. Para o micro-CT, solução de Lugol à base de iodo foi usada para aumentar o contraste no tecido cerebral. Nós temos otimizado os parâmetros de verificação e utilizou uma dimensão de voxel de 9,5 µm, que levam a um tamanho mínimo de recurso de aproximadamente 25 µm. Esta resolução é suficiente para medir o número e volume de lesão CCM globalmente e com precisão e fornecer alta qualidade 3D mapeamento de lesões do CCM em cérebro de rato. Esse método aumenta o valor dos modelos rato estabelecida para estudar as bases moleculares e terapias potenciais para CCM e outras doenças cerebrovasculares.

Introduction

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CCM são de paredes finas, dilatado malformações vasculares no cérebro, com prevalência de até 0,5% na população humana1. CCM pode ser herdada como uma desordem dominante devido a mutações de perda de função em um dos três genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (também chamado PDCD10)2,3,4 ,5,6. Estes genes estão presentes em um único complexo de sinalização.

Foram desenvolvidos vários modelos para doenças humanas de CCM modelo e entender os caminhos a jusante de genes CCM que são responsáveis por CCM7,8,9,10. O modelo mais robusto é condicionalmente excluir qualquer um dos genes Ccm com tamoxifeno-inducible Cdh5-CreERT2 em P1 em filhotes recém-nascidos8,10. Esses filhotes desenvolvem lesões CCM no cérebro de P6 para a frente e são esperados para ser um modelo ideal para estudos pré-clínicos em busca de mecanismos e agentes terapêuticos no tratamento de doenças do CCM.

Fardo de lesão CCM em cérebro de rato foi medido principalmente pelos métodos baseados em histologia, uma abordagem que é extremamente demorado e sujeito a investigador viés de11,10,12. MRI com base em métodos foram usados para avaliar a carga de lesão CCM no rato adulto modelo9,13. No entanto, um instrumento de MRI animal pequeno altamente especializado e varredura-tempo de várias horas durante a noite é necessária para alcançar uma resolução satisfatória para identificar lesões CCM. Também, não foi relatada se ressonância magnética pode ser usada para detectar lesões do CCM em camundongos Neonatais e resolução pode limitar a sensibilidade.

Recentemente desenvolvemos uma técnica de micro-CT para imagem e analisar CCM lesão14,15. De alta resolução, tempo e método cost-effective dramaticamente impulsionaram o valor do modelo de doença CCM em estudos terapêuticos e mecanicistas. Melhorar o contraste, toda montagem coloração métodos têm sido utilizados para a imagem latente de micro-CT dos tecidos moles e rato embriões16,17. Anteriormente, usamos uma baseada no ósmio de coloração para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT de lesões do CCM no cérebro14. Neste trabalho, usamos um menos tóxico, não-destrutivo, e reagente custo-eficiente, um iodo solução baseada em solução de Lugol, para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT. Iodo pode difundir em todo o cérebro e tem uma elevada afinidade para sangue18.

O protocolo detalhado é apresentado aqui para a indução de lesões do CCM em um modelo de rato neonatal, junto com a imagem e análise de lesões CCM com uma contraste baseados micro-CT. Este método baseado em micro-CT fornece medição global quantitativa do volume de lesão do CCM, identifica com precisão o número e a localização em 3D das lesões do CCM no cérebro do rato e reduz o custo e tempo necessário para o fenótipo desses animais.

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Protocol

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todos os protocolos e ética animal foram aprovados pelo The Sydney Local Saúde Animal Welfare Comissão distrital e institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de medicina de Tianjin. Todos os experimentos foram conduzidos em Diretrizes/Regulamento do centenário Instituto, Universidade de Sydney e a Universidade de medicina de Tianjin

1. Indução de malformações cavernosas cerebrais em modelos de Mouse

  1. Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl ratos com Ccm2 fl/fl para gerar ninhadas com Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl filhotes (Ccm2 iECKO) e controles littermate (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 e Ccm2 fl/fl animais têm sido descritas anteriormente 19.
  2. Dissolver 4HT em 100% de etanol e armazenar a-80 ° C, em alíquotas de 30 µ l (4HT concentração: 10 mg/mL). No dia do uso, diluir aliquotadas 4HT em óleo de milho (0,5 mg/mL).
  3. Intragastrically injetar 50 µ l de 4HT (0,5 mg/mL) para filhotes neonatais em P1 para induzir lesões CCM experimentais utilizando uma seringa de insulina.

2. Preparação para Micro-CT Scans da amostra

  1. eutanásia neonatais filhotes no P8 através de dióxido de carbono asfixia.
  2. Realizar a perfusão intra cardíaca através da inserção de uma agulha de calibre 29 com 3 mL de 2% paraformaldeído em PBS em uma seringa de 10 mL para o ventrículo do coração do mouse.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada.
  3. Separar a cabeça do corpo usando uma tesoura. Remova toda a pele se a cabeça usando uma tesoura e descolar o crânio usando fórceps para dissecar o cérebro todo.
  4. Tirar fotos do cérebro com duas oculares em 7,82 x ampliação, 1 x ganho, 0,6 gama e tempo de exposição de 20 ms.
  5. Consertar o cérebro dissecado com paraformaldeído 4% em solução de PBS durante a noite.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada.
  6. No dia seguinte, desanexar hindbrains usando uma pinça e lavar com solução de PBS.
  7. Incubar os hindbrains no Lugol ' s solução de iodo por 48 h.
  8. Após a incubação, brevemente ar seco os hindbrains para remover o excesso Lugol ' solução de iodo de s.
  9. Pack o Lugol ' iodo s manchado hindbrains em 0,65 mL microcentrifuge tubos e selo completamente com filme plástico parafina para evitar o encolhimento do tecido ( Figura 2).
  10. Coloque microcentrifuga tubos em tubos de plástico de 5 mL com esponjas para impedir a movimentação durante a verificação ( Figura 2 B).

3. Micro-CT Scan do CCM no cérebro do rato

  1. verticalmente, montar o rombencéfalo embalado em um tubo em um suporte de alumínio no sistema de micro-CT.
  2. Definir os parâmetros de digitalização para 540 projeções e tempo de exposição 2 s com condições de fonte de 50 kV e 10 W para adquirir os conjuntos de dados tomográficos (imagem resolução 9,5 μm/pixel).
  3. Radiografias do exame são reconstruídas automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseada em hardware fornecido pelo sistema micro-CT, produzindo uma série de imagem de 16 bits fatias axiais (" TXM " arquivo).

4. Análise de conjuntos de dados Micro-CT

  1. abrir o arquivo de imagem reconstruída (" TXM " arquivo) do software de análise em 3D e visualizar o cérebro usando o " renderização de volume " função.
  2. Transformar o rombencéfalo à orientação desejada usando o " caixa delimitadora " e " plano de recorte " funções.
  3. Resample na imagem transformada em modo estendido e preservar o tamanho de voxel.
  4. Criar " editar novo rótulo de campo " na imagem transformada (4.3) e destacar apenas o rombencéfalo usando intensidade greyscale.
  5. Adicionar as áreas destacadas e executar " etiqueta análise " para obter medições do rombencéfalo inteira (ou seja, total volume e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
  6. Visualizar o rombencéfalo usando o " isosuperfície renderização " função.
  7. Criar outro " editar novo rótulo de campo " sobre as áreas de imagem e destaque transformadas com lesões usando a escala de cinzentos intensidade.
  8. Adicionar as áreas destacadas e executar " rótulo " análise para obter medições das lesões dentro do rombencéfalo (i.e., volume total e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
  9. Visualizar as lesões utilizando o " gerar superfície " e " vista de superfície " funções.
  10. As imagens do rombencéfalo em orientações desejados de instantâneo ou gerar um filme para visualização em 3D das lesões.

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Results

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Uma única injeção de 4HT no P1 foi suficiente para induzir lesões CCM no cerebelo. Solução de Lugol iodo contrastado micro-CT suficientemente detectado lesões CCM e podia quantificar o volume e o número. Estamos utilizando o micro-CT otimizado, fotografada lesões CCM nos hindbrains de Ccm2iECKO ratos. Imagens digitalizadas de raios-x foram reconstruídas para produzir imagens em 3D do cérebro do rato, que permitiu a visualização de lesões inteiras no parênquima cerebra...

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Discussion

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CCM é uma malformação vascular comum que afeta até 0,5% de indivíduos1. CCM pode ocorrer de forma esporádica ou familiar. Prognóstico do paciente é muitas vezes pouco claro como lesões CCM podem romper inesperadamente para causar acidente vascular cerebral e outras consequências neurológicas. Atualmente, a único tratamento opção é remover cirurgicamente lesões, que são acompanhadas de alto risco.

Recentemente foram reproduzidas em condições humanas de CCM animal modelos...

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Os autores reconhecem as instalações e a assistência científica e técnica de a Sydney microscopia & microanálise Research Facility (AMMRF) e o centro australiano para microscopia & microanálise (ACMM) na Universidade de Sydney. Estes estudos foram apoiados pela Australian National Health e projeto de Conselho de pesquisa médica (NHMRC) conceder 161558 e APP1124011 (XZ).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-hidroxi tamoxifenoSigma-AldrichH6278Para ativar Cdh5-CreErt2
Óleo de milhoSigma-AldrichC8267-500MLPara diluir 4-hidroxi tamoxifeno
EstereomicroscópioLeicaM205FAPara tirar imagens macroscópicas
Solução de iodo de LugolSigma-AldrichL6146Para corar amostras para micro-CT
de contrasteFilme plásticoparafinaParafilm PM992Para embalar amostras
Micro-CTXradiaMicroXCT-400Micro-CT
Software de renderização 3DFEI Visualization Science groupSoftware de processamento de imagem Avizo 3DPara analisar varreduras de micro-CT

References

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  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11(2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).

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Cerebral Cavernous MalformationsMouse Model InductionMicro CT ImagingTamoxifen Induced DeletionIodine Contrast EnhancementVoxel Dimension OptimizationLesion Burden Measurement3D Brain MappingCcm2 Gene KnockoutPostnatal Day 1 Injection

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